一種svf的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種SVF的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，脂肪組織因其在能量調(diào)控、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答方面的作用已被認為是一個內(nèi)分泌器官。此外，它還是具有多向分化潛能的多功能細胞的來源之一，而這種多功能細胞就存在于脂肪組織的血管基質(zhì)部分中。脂肪組織中的血管基質(zhì)部分(SVF)是脂肪組織經(jīng)膠原酶消化、過濾、離心除去成熟脂肪細胞后得到的。正因為SVF易于從脂肪組織中提取并含有豐富的、可塑性極強的脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞(Adipose tissue-derivedmesenchymal stem cells, ASC),所以對SVF的提取和制備是有必要進行研究的。間充質(zhì)干細胞(如骨髓基質(zhì)干細胞、脂肪組織來源干細胞)在臨床多個領(lǐng)域都有巨大的潛在應(yīng)用空間，國內(nèi)外均有大量相關(guān)的基礎(chǔ)及臨床實驗研究，目前干細胞治療在整形外科、心臟科、血管外科、燒傷科、消化科、血液科、風(fēng)濕免疫科等領(lǐng)域都有相關(guān)臨床應(yīng)用開展。
[0003]但是，對于SVF的提取和制備就現(xiàn)有技術(shù)而言，還存在以下的不足:
[0004]1.膠原酶用量較多且最后的殘留量也較多，大大影響了 SVF的純度；
[0005]2.制備得到的SVF細胞活性和增殖活性較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的，就是為了解決上述問題而提供了一種SVF的制備方法，該方法制得的SVF的細胞活性和增殖活性較高。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案實施如下:
[0008]本發(fā)明的一種SVF的制備方法，包括以下具體步驟:
[0009]步驟1:將抽吸的人體脂肪靜置至脂肪和液體分層，去除所述液體，用生理鹽水洗滌所述脂肪兩次后，將所述脂肪裝于無菌離心管中，并加入膠原酶溶液和生理鹽水，所述膠原酶溶液與所述脂肪的體積比為1:10 ;
[0010]步驟2:將所述無菌離心管傾斜放置于恒溫搖床中，37°C溫度下消化30-90分鐘，所述恒溫搖床的振蕩頻率每分鐘300-400次以上；
[0011]步驟3:將所述無菌離心管放入離心機中離心10分鐘，離心力為300-400g，在無菌環(huán)境下吸出上層清液，在下層中加入1ml生理鹽水重懸，并通過100 μ m單細胞濾網(wǎng)過濾，去除濾液，濾渣備用；
[0012]步驟4:將步驟3中的濾渣離心洗滌兩次，離心力為600-700g，每次3-5分鐘，即得所述SVF。
[0013]上述的一種SVF的制備方法中，所述步驟I的詳細操作如下:將抽吸的人體脂肪靜置至脂肪和液體分層，去除所述液體，用生理鹽水洗滌所述脂肪兩次后，將1ml所述脂肪裝于50ml無菌離心管中，并加入Iml膠原酶溶液，隨后加入生理鹽水至所述無菌離心管中的總?cè)芤后w積達20ml為止。
[0014]上述的一種SVF的制備方法中，所述膠原酶溶液的制備方法如下:在600單位膠原酶中加入2ml生理鹽水，充分混合，即制得膠原酶溶液，所述膠原酶溶液的濃度為lmg/ml。
[0015]本發(fā)明方法膠原酶用量較低，制備得到的SVF中膠原酶含量非常低，基本可以忽略不計，同時本發(fā)明方法制備得到的SVF在細胞活性和增殖活性上也較常規(guī)方法制得的SVF要更高。
【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明制得的SVF與其他方法得到的SVF的生長曲線圖；
[0017]圖2是本發(fā)明制得的SVF的細胞增殖情況；
[0018]圖3是采用其他方法制得的SVF的細胞增殖情況。
【具體實施方式】
[0019]下面將結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步說明。
[0020]實施例
[0021]本實施例SVF的制備方法，包括以下具體步驟:
[0022]步驟1:制備膠原酶溶液:在600單位膠原酶中加入2ml生理鹽水，充分混合，即制得膠原酶溶液，該膠原酶溶液的濃度為lmg/ml ;
[0023]步驟2:將抽吸的人體脂肪靜置至脂肪和液體分層，去除所述液體，用生理鹽水洗滌所述脂肪兩次后，將1ml脂肪裝于50ml無菌離心管中，并加入Iml膠原酶溶液，隨后加入生理鹽水至無菌離心管中的總?cè)芤后w積達20ml為止；
[0024]步驟3:將無菌離心管傾斜放置于恒溫搖床中，37°C溫度下消化30-90分鐘，恒溫搖床的振蕩頻率每分鐘300-400次以上；
[0025]步驟4:將無菌離心管放入離心機中離心10分鐘，離心力為300_400g，在無菌環(huán)境下吸出上層清液，在下層中加入1ml生理鹽水重懸，并通過100 μ m單細胞濾網(wǎng)過濾，去除濾液，濾渣備用；
[0026]步驟5:將步驟4中的濾渣離心洗滌兩次，離心力為600_700g，每次3-5分鐘，即得SVF0
[0027]本發(fā)明方法制得的SVF與現(xiàn)有方法制得的SVF試驗對比如下:
[0028]1.膠原酶殘留的檢測:
[0029]文獻中常用的膠原酶的消化脂肪的消化濃度是0.075%。
[0030]本發(fā)明中膠原酶消化濃度為0.01 %，低于常用膠原酶的消化濃度，在反復(fù)2?3次清洗后，在獲得的SVF中膠原酶殘留量非常低，可忽略不計。
[0031]2.膠原酶用量的比較:
[0032]20ml脂肪，本發(fā)明方法采用2mg膠原酶，而常規(guī)方法采用24mg膠原酶，最后制得的SVF 的量無明顯差異，分別為:1.11±0.13X 16 (η = 5)和 1.09±0.21 X 16 (η = 5)ρ>0.05。
[0033]3.采用CCK8法測試不同方法制備的SVF的細胞活性，結(jié)果如圖1所示，圖1中A為本發(fā)明方法制得的SVF，B為現(xiàn)有方法制得的SVF，由此可見，本發(fā)明方法制得的SVF的細胞活性更高。
[0034]4.不同方法制備的SVFPO培養(yǎng)6天(40 X )，其中圖2是本發(fā)明方法制得的SVF，圖3是現(xiàn)有方法制得的SVF，通過比較可以看到本發(fā)明方法制得的SVF的增殖活性更強。
[0035]以上實施例僅供說明本發(fā)明之用，而非對本發(fā)明的限制，有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以作出各種變換或變型，因此所有等同的技術(shù)方案也應(yīng)該屬于本發(fā)明的范疇，應(yīng)由各權(quán)利要求所限定。
【主權(quán)項】
1.一種SVF的制備方法，其特征在于，包括以下具體步驟: 步驟1:將抽吸的人體脂肪靜置至脂肪和液體分層，去除所述液體，用生理鹽水洗滌所述脂肪兩次后，將所述脂肪裝于無菌離心管中，并加入膠原酶溶液和生理鹽水，所述膠原酶溶液與所述脂肪的體積比為1:10 ; 步驟2:將所述無菌離心管傾斜放置于恒溫搖床中，37°C溫度下消化30-90分鐘，所述恒溫搖床的振蕩頻率每分鐘300-400次以上； 步驟3:將所述無菌離心管放入離心機中離心10分鐘，離心力為300-400g，在無菌環(huán)境下吸出上層清液，在下層中加入1ml生理鹽水重懸，并通過100 μ m單細胞濾網(wǎng)過濾，去除濾液，濾渣備用； 步驟4:將步驟3中的濾渣離心洗滌兩次，離心力為600-700g，每次3-5分鐘，即得所述SVF02.如權(quán)利要求1所述的一種SVF的制備方法，其特征在于，所述步驟I的詳細操作如下:將抽吸的人體脂肪靜置至脂肪和液體分層，去除所述液體，用生理鹽水洗滌所述脂肪兩次后，將1ml所述脂肪裝于50ml無菌離心管中，并加入Iml膠原酶溶液，隨后加入生理鹽水至所述無菌離心管中的總?cè)芤后w積達20ml為止。3.如權(quán)利要求1或2所述的一種SVF的制備方法，其特征在于，所述膠原酶溶液的制備方法如下:在600單位膠原酶中加入2ml生理鹽水，充分混合，即制得膠原酶溶液，所述膠原酶溶液的濃度為lmg/ml。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種SVF的制備方法，在抽吸的人體脂肪加入膠原酶溶液和生理鹽水，在37℃溫度下消化30-90分鐘，離心去上清，在下層中加入10ml生理鹽水重懸，并通過100μm單細胞濾網(wǎng)過濾，去除濾液，留濾渣，并離心洗滌兩次即得所述SVF。本發(fā)明方法膠原酶用量較低，制備得到的SVF中膠原酶含量非常低，基本可以忽略不計，同時本發(fā)明方法制備得到的SVF在細胞活性和增殖活性上也較常規(guī)方法制得的SVF要更高。
【IPC分類】C12P21/06, C12N5/077
【公開號】CN105132500
【申請?zhí)枴緾N201510548691
【發(fā)明人】李青峰, 李華, 成琴芳
【申請人】李青峰
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年8月31日