一種微量熱法結(jié)合測(cè)定自由基清除率確定高抗氧化大豆肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于大豆深加工技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種微量熱法結(jié)合測(cè)定自由基清除率確定高抗氧化大豆肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)的酶法改性通常是指利用酶水解對(duì)大豆蛋白進(jìn)行改性。蛋白質(zhì)的酶法改性因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)、酶解過(guò)程溫和，而受到人們的廣泛關(guān)注。隨著酶生產(chǎn)、膜反應(yīng)器和固定化酶技術(shù)的不斷發(fā)展，酶水解方法更趨于簡(jiǎn)單化、自動(dòng)化，酶法水解已成為新的方向。隨著一些新用途的酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，極大的拓寬了酶法改性的應(yīng)用范圍，例如各類蛋白水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、磷酸酶以及過(guò)氧化氫酶的應(yīng)用，使得過(guò)去只能采用化學(xué)方法進(jìn)行的磷酸化、去酰胺、交聯(lián)聚合等改性方式都可以采用酶法改性來(lái)進(jìn)行。特別是一些低廉價(jià)格的微生物酶的出現(xiàn)，進(jìn)一步降低了酶法改性的成本，使其更具有實(shí)用性。
[0003]伴隨著酶化學(xué)的迅猛發(fā)展，美國(guó)、日本對(duì)于大豆蛋白的酶解工藝和酶解過(guò)程的感官特性、功能特性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值改善的研究取得了較大的進(jìn)展。目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)的大豆肽是大豆蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解得到的多種肽分子混合物。
[0004]對(duì)蛋白酶水解制備大豆肽的方法國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，大都是通過(guò)測(cè)定產(chǎn)物的性質(zhì)，來(lái)確定最佳反應(yīng)溫度、酸度等條件，試驗(yàn)方法較復(fù)雜，隨意性較大，不能準(zhǔn)確定量確定蛋白酶水解反應(yīng)的最佳工藝。致使蛋白酶水解工藝控制欠缺理論指導(dǎo)，控制難。微量熱法通過(guò)高靈敏度的微量量熱儀直接測(cè)量酶催化反應(yīng)過(guò)程中微量的熱量變化，獲得蛋白酶對(duì)大豆蛋白催化反應(yīng)的熱功率一時(shí)間曲線，定量確定蛋白酶水解大豆分離蛋白最佳反應(yīng)溫度、pH。具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)合測(cè)定自由基清除率可以準(zhǔn)確定量確定高抗氧化大豆肽的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備高抗氧化大豆肽的方法。本發(fā)明用一種新的研究方法微量熱法，對(duì)大豆蛋白酶解制取大豆肽最適蛋白酶、最適條件進(jìn)行定量的研究，結(jié)合測(cè)定產(chǎn)物自由基清除率確定一種新的高抗氧化大豆肽的制備方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種微量熱法結(jié)合測(cè)定自由基清除率確定高抗氧化大豆肽的制備方法，其特征在于，具體方法包括以下步驟:
[0007](I)配制溶液:
[0008]溶液①:準(zhǔn)確稱取大豆分離蛋白樣品，用不同pH值(ρΗ3.3-ρΗΙΟ.0)的緩沖溶液分別配制濃度為5-10g L 1的大豆分離蛋白溶液。
[0009]溶液②:配制濃度為0.1-0.3g L 1的中性蛋白酶(酶活力5.3X10 4U/g)溶液，胰蛋白酶(酶活力5.1 X 104U/g)溶液，菠蘿蛋白酶(酶活力6.0X 104U/g)溶液，堿性蛋白酶(酶活力5.7X104U/g)溶液。
[0010](2) 90°C大豆分離蛋白溶液進(jìn)行水浴處理1min ;
[0011](3)測(cè)定熱功率時(shí)間曲線:取溶液①2ml放入不銹鋼安瓿中。把滴定微量量熱儀的連桿上繞細(xì)塑料管，管中盛蛋白酶溶液②lml，先預(yù)熱，當(dāng)溫度恒定后，將攪拌系統(tǒng)打下，轉(zhuǎn)速為60-120rpm，用蠕動(dòng)栗把蛋白酶溶液②注入安瓿中，然后進(jìn)行熱功率一時(shí)間曲線的測(cè)定;
[0012](4)通過(guò)熱功率一時(shí)間曲線，按照熱動(dòng)力學(xué)理論和對(duì)比進(jìn)度法解析出中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶各溫度(306.15K-336.15K)、pH值(ρΗ6.13_ρΗ9.22)時(shí)米凱利斯常數(shù)Km和最大速度Vmax，并建立米凱利斯常數(shù)與溫度、pH值間的關(guān)系式，從而獲得中性蛋白酶最適溫度319.19K、最適pH7.13 ;胰蛋白酶最適溫度323.27K、最適PH7.77 ;菠蘿蛋白酶最適溫度314.63K、最適pH6.99 ;堿性蛋白酶最適溫度329.5K、最適ρΗ8.25。
[0013](5)通過(guò)熱功率一時(shí)間曲線，求得中性蛋白酶在其最適溫度、最適pH的米凱利斯常數(shù)Κπι = 24.028.?Λ胰蛋白酶在其最適溫度、最適pH的米凱利斯常數(shù)Km = 42.41g.!/，菠蘿蛋白酶在其最適溫度、最適pH的米凱利斯常數(shù)Km = 50.31g *L \堿性蛋白酶在其最適溫度、最適PH的米凱利斯常數(shù)Km = 16.0lg -L \從而可以知道堿性蛋白酶與底物大豆分離蛋白的親和力最強(qiáng)，結(jié)合產(chǎn)物自由基清除率測(cè)定進(jìn)一步確定堿性蛋白酶是催化水解大豆分離蛋白的最適蛋白酶。
[0014](6)不同試驗(yàn)條件(底物濃度、酶底比、pH、溫度、酶組合)下得到的大豆肽產(chǎn)品，進(jìn)行自由基清除率測(cè)定，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定高抗氧化大豆肽的制備方法:調(diào)漿一加酶反應(yīng)—分離提取一脫除異味一脫除無(wú)機(jī)鹽類一殺菌滅酶一濃縮、噴霧干燥一高抗氧化大豆肽產(chǎn)品。其中加酶反應(yīng)底物濃度5-10%、pH值8.25、酶底比1-3%、水解溫度329.5K，堿性蛋白酶水解大豆蛋白3h后加與堿性蛋白酶1:3的胰蛋白酶，在323.27K，pH7.77水解2h，獲得高抗氧化大豆肽，10mg/mL時(shí)DPPH自由基清除率為99.83%。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明使用的微量熱法具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明提供一種制備高抗氧化大豆肽的方法，能夠有效提高產(chǎn)品的抗氧化性，本產(chǎn)品10mg/mL時(shí)DPPH自由基清除率為99.83%。與普通工藝生產(chǎn)的抗氧化大豆肽相比，自由基清除率顯著提高，本發(fā)明無(wú)污染，成本低，工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品抗氧化性高，水溶性好、安全、無(wú)毒、無(wú)副作用等，具有較高的推廣價(jià)值，可以用于保健品、功能食品、食品添加劑的開發(fā)。同時(shí)可以很好地對(duì)大豆深加工企業(yè)大豆肽生產(chǎn)中的蛋白酶水解工藝控制提供理論指導(dǎo)，產(chǎn)生較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益，其前景非常廣闊。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1是堿性蛋白酶在pH = 6.80,不同溫度時(shí)催化反應(yīng)的熱功率一時(shí)間曲線
[0017]圖2是堿性蛋白酶在T = 312.15K,不同酸堿度時(shí)催化反應(yīng)的熱功率一時(shí)間曲線
[0018]圖3是中性蛋白酶在T = 319.19K, PH = 7.13下催化反應(yīng)的熱功率一時(shí)間曲線
[0019]圖4是在溫度為323.27K和PH = 7.77時(shí)胰蛋白酶催化反應(yīng)的熱功率一時(shí)間曲線
[0020]圖5是在T = 314.63K，pH = 6.99時(shí)菠蘿蛋白酶催化反應(yīng)的Km和Vmax
[0021]圖6是在溫度為329.12K, PH = 8.31時(shí)堿性蛋白酶催化反應(yīng)的熱功率一時(shí)間曲線【具體實(shí)施方式】:
[0022]實(shí)施例1
[0023]1.溶液的配制:
[0024]溶液①:準(zhǔn)確稱取大豆分離蛋白樣品，用pH值為7.13,7.65,8.14、8.67、9.22的緩沖溶液分別配制濃度為1g.L 1的大豆分離蛋白溶液。
[0025]溶液②:配制濃度為0.2g L 1堿性蛋白酶溶液。
[0026]2.90°C大豆分離蛋白溶液進(jìn)行水浴處理1min ;
[0027]3.實(shí)驗(yàn)是在4ml不銹鋼安瓶(滴定微量量熱儀)中進(jìn)行的。取大豆分離蛋白溶液2ml放入不銹鋼安瓿中。把滴定微量量熱儀的連桿上繞細(xì)塑料管，管中盛堿性蛋白酶溶液lml，先預(yù)熱，當(dāng)溫度(316.15K ；321.15K ；326.15K ；331.15K ；336.15K)恒定后，將攪拌系統(tǒng)打下，轉(zhuǎn)速為120rpm，用蠕動(dòng)栗把堿性蛋白酶溶液注入安瓿中，然后進(jìn)行熱功率一時(shí)間曲線的測(cè)定，記錄儀開始記錄，當(dāng)記錄筆畫出與基線平行的直線時(shí)即認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)束，攪拌停止。每個(gè)體系重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定三次，取平均值。
[0028]實(shí)驗(yàn)測(cè)得在pH = 6.80,不同溫度時(shí)酶催化反應(yīng)的熱功率一時(shí)間曲線如圖1
[0029]由圖1 得到不同溫度(316.15K ；321.15K ；326.15K ；331.15K ；336.15K)下的酶催化反應(yīng)的米凱利斯常數(shù)(Km)和最大速率(Vmax):
[0030]T = 316.15K, Km = 20.06 和 Vmax = 0.1493 ；T = 321.15Κ, Km = 18.67 和 Vmax =0.1610 ；Τ = 326.15Κ, Km = 17.71 和 Vmax = 0.1749 ；Τ = 331.15Κ, Km = 18.17 和 Vmax =0.1619 ；Τ = 336.15Κ, Km = 19.60 和 Vmax = 0.1505 ；
[0031]根據(jù)Km和Vmax的數(shù)據(jù)，用計(jì)算機(jī)擬合，得Km—T曲線方程，即
[0032]Km = 0.020Τ2-13.18Τ+2172, R = 0.9920，求極值得到堿性蛋白酶的最適溫度為329.5Κ。
[0033]實(shí)驗(yàn)測(cè)