6-乙基鵝去氧膽酸異構(gòu)體的合成及其分離測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種奧貝膽酸（OCA)異構(gòu)體的合成，奧貝膽酸及其異構(gòu)體的分離方 法。具體地設(shè)及OCA-aaP體，OCA-aPa體的合成，W及分離測定OCA及OCA-a曰P體，OCA-a0a體的方法。
【背景技術(shù)】 陽00引奧貝膽酸（ObeticholicAcid, 0CA)，又名6-乙基碟去氧蛋散，是一種通過活化尼 醇X受體抑制細胞色素7A1促進膽酸分泌因而治療原發(fā)性膽汁硬化和非酒精脂肪性肝病的 新型藥物。該要藥物活性高于熊去氧膽酸，副作用低，并能有效降低堿性憐酸酶和血清憐酸 酶（堿性憐酸酶是表示肝臟疾病程度的一種生物標記）。
[0003] 奧貝膽酸（I)較熊去氧膽酸有顯著的臨床優(yōu)勢，近年來處于臨床研究階段，有潛 力作為新一代的非酒精性脂肪肝的藥物應用于臨床。
[0004]
陽〇化]文獻W02013192097、US20130345188A1報道了奧貝膽酸的合成方法，工藝路線如 下：
[0007] 即采用化合物A為原料，經(jīng)鈕碳還原得到化合物B，再經(jīng)過四氨棚鋼還原制備得到 OCA。
[0008] 根據(jù)結(jié)構(gòu)可知，該化合物含有多個手性中屯、，尤其是6位乙基，7位徑基的手性均 在合成過程中引入。在化合物C制備過程中存在構(gòu)型轉(zhuǎn)化的步驟，在四氨棚鋼進行還原的 過程中，引入7位手性徑基。盡管上述反應立體選擇性良好，但是由于反應過程復雜，構(gòu)型 轉(zhuǎn)化不完全等因素，導致奧貝膽酸中潛在奧貝膽酸異構(gòu)體，尤其是6位，7位異構(gòu)體，即奧貝 膽酸a0a，奧貝膽酸aa0異構(gòu)體。尤其是在化合物B的制備過程中，根據(jù)文獻提高的 方案，即采用氨氧化鋼水溶液為溶劑，100 °c反應，并進行轉(zhuǎn)構(gòu)型，研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)型轉(zhuǎn)化不完 全，潛在的引入了手性雜質(zhì)。
[0009] 文獻W02013192097報道了上述兩種異構(gòu)體在OCA中的控制限度，但是未給出上述 異構(gòu)體的合成方法W及與奧貝膽酸的色譜分離方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了一種OCA異構(gòu)體OCA-Q 0 a和OCA-Q a 0的制備方法。
[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種分離測定OCA異構(gòu)體方法，目的在于檢測并分離OCA及 其異構(gòu)體，從而為OCA質(zhì)量控制提供方法。
[0012] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案：
[0013] 一種制備OCA異構(gòu)體OCA- a 0 a的制備方法，包括步驟；
[0014] 1)化合物A催化加氨還原生成化合物B; 陽01引?；衔顱還原得OCA-曰0曰；
[0016] 3) OCA - a 0 a進行柱層析得高純度OCA-a 0曰
[0017] 所述工藝路線如下：
[0019] 更具體地，步驟1中，所述反應是在溶劑中進行，反應溶劑選自甲醇，乙醇，氨氧化 鋼水溶液及其混合物，反應溫度為25~30°C，優(yōu)選20°C;化合物A與金屬鈕的重量比為 1:0.Ol~0. 05。
[0020] 研究發(fā)現(xiàn)，文獻W02013192097采用較高的溫度進行氨化，在反應過程中即生 成化合物B，也生成化合物C，為得到較高純度的化合物B，W便進行后續(xù)反應，本發(fā)明在 W02013192097提示下，降低反應溫度，可顯著遏制轉(zhuǎn)構(gòu)進程，在溫度25°C時，反應進行徹 底，且能夠得到較高純度的化合物B。在逐步升高溫度至50~60°C及W上溫度時候，化合 物C的比例顯著增加。
[0021]
[0022] 根據(jù)上述實驗可知，反應控制在25°C即可得到相對高純度的化合物B，并抑制化 合物C的生成。另外，研究發(fā)現(xiàn)在更加低的溫度下，例如反應溫度為15°C時，反應速度極其 緩慢，同時化合物B轉(zhuǎn)構(gòu)現(xiàn)象比較明顯。
[0023] 步驟2中，所述還原反應是在溶劑中還原劑作用下進行。反應溶劑選自0. 5~2% 氨氧化鋼水溶液；還原劑選自氯基棚氨化鋼，=乙酷基棚氨化鋼，棚氨化鋼，棚氨化鐘，優(yōu)選 四氨棚鋼；反應溫度為30-50°C，優(yōu)選35°C。該步驟得到的OCA-a0a純度低于90 %，需 進一步采用純化步驟進行純化。
[0024] 文獻CN200680017025. 6公開采用四氨棚鋼為還原劑，25% (m/v)氨氧化鋼水溶液 為溶劑的還原體系，并且制備得到OCA-Q0a(即CN200680017025. 6文獻中化合物IB)，文 獻未給出具體操作方案。研究表明，在文獻條件下，由于采用高濃度氨氧化鋼水溶液體系， 反應溫度較高，導致OCA-aea大量轉(zhuǎn)構(gòu)形成OCA,不利于OCA-aea的富集與制備。在 本發(fā)明中，通過摸索不同的試驗條件，確定采用采用本發(fā)明的技術(shù)方案，可得到OCA-Q0a 顯著富集的產(chǎn)品。
陽026]從上表可知，隨著氨氧化鋼堿濃度的降低，OCA-a0a純度增加，且在0. 5~2%的范圍內(nèi)純度比較穩(wěn)定。
[0027] 步驟3中，所述的柱層析填料選自SP20SS，HP20SS，SP207SS，洗脫劑選自甲醇/水， 乙臘/水，丙酬/水，乙醇/水等混合物溶劑，其中有機相與水的體積比為1~3 :10。經(jīng)過 純化后的OCA-a0a純度可達到97%W上，滿足作為雜質(zhì)對照品用于OCA的質(zhì)量控制。
[0028] 本發(fā)明選擇了S種反相填料作為分離純化OCA-Q0a的填料，研究發(fā)現(xiàn)，運些填 料在有機溶劑/水混合物體系下能夠純化得到高純度的化合物OCA-Q0a。
[0030] 采用本發(fā)明的純化技術(shù)方案，可W將OCA-aea的純度由90%不到提高至97% 社。 陽03U -種OCA異構(gòu)體OCA- a a 0的制備方法，包括步驟；
[0032]a)化合物B經(jīng)構(gòu)型轉(zhuǎn)化得到化合物C; 陽03引 b)化合物C經(jīng)金屬鋼還原得OCA- a a 0 ;
[0034] c)0CA-a ae進行柱層析得OCA-a ae;
[0035] 所述工藝路線如下：
[0037]更具體地，步驟a)中，化合物B在堿性水水溶液中經(jīng)熱處理，轉(zhuǎn)化得到中間體C，所 述堿性溶液為氨氧化鋼水溶液，轉(zhuǎn)構(gòu)溫度為75~105°C，優(yōu)選100°C;
[00測步驟b)中，化合物C在金屬鋼的作用下還原得OCA-aa0，反應溶劑選自2-仲下 醇，叔下醇，反應溫度為50~100°C，優(yōu)選75°C;化合物B與金屬化的質(zhì)量比為1:2~5， 優(yōu)選1:3,需加入2%的NiClz催化反應。該步驟得到的OCA-a0a純度接近90%，需進一 步采用純化步驟進行純化。
[0039] 文獻CN200680017025. 6公開了采用金屬鋼還原制備得到異構(gòu)體的方法，即采用 3 :1至3 :2的比例將化合物C與溶解有金屬鋼的仲下醇溶解進行反應得到目的物。研究表 明，采用上述反應條件，樣品純度極低，達不到50 %，不利于制備雜質(zhì)對照品使用。
[0040] 研究發(fā)現(xiàn)，顯著加大金屬鋼的用量，并引入相當于化合物C2%質(zhì)量分數(shù)（催化劑 與化合物C的質(zhì)量比為1:50)的催化劑NiClz,可顯著提高OCA-Q 0a純度。
[0041 ]
[0042] 綜上可知，在根據(jù)文獻采用3:1當量的金屬鋼，W及不添加催化量NiC12的情況 下，純度僅約47%，在顯著增加金屬鋼用量，并添加約2 %質(zhì)量分數(shù)的NiC12的情況下，OCA-a0a純度均可達80%W上，有利于后續(xù)的分離純化。
[00創(chuàng)步驟C)中，所得的OCA-aa0粗品采用柱層析進行純化，得到OCA-aa0，所述 的色譜柱填料包括SP20SS，HP20SS，SP207SS，洗脫劑選自甲醇/水，乙臘/水，丙酬/水，乙 醇/水等混合物溶劑，有機相與水的體積比為1~3:10,經(jīng)過純化后的OCA-Qa0純度可 達到98%W上，滿足作為雜質(zhì)對照品用于OCA的質(zhì)量控制。 W44] 本發(fā)明選擇了S種反相填料作為分離純化OCA-Q a 0的填料，研究發(fā)現(xiàn)，運些填 料在有機溶劑/水混合物體系下能夠純化得到高純度的化合物OCA-Q a 0。
陽046] 采用本發(fā)明的純化技術(shù)方案，可W將OCA-Q0a的純度由不到90%提高至97% 社。
[0047]本發(fā)明的實施方案中，提供了分離OCA及其異構(gòu)體的色譜，包括采用高效液相 色譜法進行拆分，其中色譜柱選自C18色譜柱，填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，檢測器選 自化SD-2000(蒸發(fā)光散射-2000型）檢測器，流動相選自乙臘/0. 1%甲酸水溶液，甲醇 /0. 1 %甲酸水溶液；色譜柱溫為25~35°C，優(yōu)選30°C，流動相流速為0. 5ml/min~1. 5ml/ min,優(yōu)選I.Oml/min，氮氣氣流為2.O~2.化/min,漂移管溫度90~110°C。
[0048] 下面結(jié)合附圖及其實施例，對本發(fā)明進一步進行說明，需要理解的是，W下實施例 僅是對本發(fā)明的描述，不應將此理解為本發(fā)明的保護范圍僅限于W下實施例。
【附圖說明】 W49] 附圖1 :奧貝膽酸a0a體HNMR圖譜 [0050] 附圖2 :奧貝膽酸a0a體ES-圖譜 陽05U 附圖3 :奧貝膽酸aa0體HNMR圖譜 陽05引附圖4 :奧貝膽酸aa0體ES-圖譜
[0053] 附圖5:奧貝膽酸（RT36. 743min)W及奧貝膽酸aa0體（RT24. 8