一種桑枝抗腫瘤活性多糖rmpw-2的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及了一種多糖的制備方法，尤其是設(shè)及了一種桑枝抗腫瘤活性多糖 RMPW-2的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多糖（polysaccharide)又稱多聚糖，是由單糖聚合而成并且聚合度大于10的極 性復(fù)雜大分子，分子量一般為數(shù)萬甚至數(shù)百萬。多糖是繼蛋白質(zhì)、核酸之后，又一攜帶大量 生物信息的生物大分子，來源于真菌、藻類地衣、植物、細(xì)菌、動(dòng)物等。大量的藥理和臨床研 究表明，天然多糖具有有效的抗癌作用，而且毒副作用較小，展現(xiàn)出廣闊的研究和應(yīng)用前 旦 O
[0003] 桑枝（Ramulusmori)是?？浦参锷＃∕orusa化a)的干燥枝條，性平味苦，入肝、 脾、肺、腎經(jīng)，一直是民間常用中藥。研究表明，桑枝多糖具有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗 腫瘤、抗炎等多種藥理活性，但藥用機(jī)理尚不清楚，運(yùn)阻礙了桑枝藥用水平提高及藥用范圍 擴(kuò)大。分離純化制備桑枝抗腫瘤活性成分，對于推進(jìn)桑枝藥用開發(fā)具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決【背景技術(shù)】中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種桑枝抗腫瘤活性多 糖RMPW-2的制備方法，是采用回流提取、DEAE-Se地aroseFastFlow離子交換層析柱分離 和Se地ac巧1S-100、S-300層析柱純化的方法，制備桑枝抗腫瘤活性多糖RMPW-2。 陽〇化]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 1)采集桑樹春季新生嫩桑枝或春季老桑枝，太陽光下自然曬干，切片，于40°C烘 箱中烘干至恒重，高速粉碎機(jī)粉碎后過80-100目篩，得到桑枝粉；
[0007] 2)將桑枝粉經(jīng)石油酸回流脫脂、經(jīng)乙醇回流除去巧類和生物堿等小分子物質(zhì)后獲 得桑枝粉殘?jiān)?br>[0008] 3)將桑枝粉殘?jiān)尤腚p蒸饋水從桑枝中提取出粗多糖；
[0009] 4)將粗多糖用Sevag法除去蛋白質(zhì)，并用乙醇進(jìn)行兩次沉淀；
[0010] 5)接著依次通過DEAE-Se地aroseFastFlow離子交換層析柱分離洗脫、通過 S巧hacirlS-IOO層析柱除鹽洗脫、通過Se地ac巧1S-300層析柱純化洗脫后，收集第2個(gè) 洗脫峰的洗脫液，得到多糖組分RMPW-2。
[0011] 所述步驟2)將桑枝粉進(jìn)行脫脂、除巧類和生物堿具體為： 陽01引 2. 1)取桑枝粉，按質(zhì)量體積比（W:V)為1:10加入石油酸溶液，在90°C下回流脫脂Ih后抽濾；
[0013] 2. 2)取殘?jiān)?0倍體積質(zhì)量濃度為80%乙醇在100°C下回流比后抽濾；
[0014] 2. 3)重復(fù)上述步驟2. 2) -次，然后取殘?jiān)?0°C烘箱中烘干。
[0015] 所述步驟3)加入雙蒸饋水從桑枝中提取出粗多糖具體為：
[0016] 3. 1)將烘干桑枝粉殘?jiān)促|(zhì)量體積比（W:V)為1 :10加入雙蒸饋水，超聲波處理 40min后，于100°C下提取化抽濾，獲得殘?jiān)蜑V液；
[0017] 3. 2)取步驟3. 1)得到的殘?jiān)僦貜?fù)上述步驟3. 1)-次，獲得殘?jiān)蜑V液；
[0018] 3. 3)合并步驟3. 1)和步驟3. 2)得到的濾液，在50°C減壓濃縮至原體積的1/3,從 而從桑枝中提取出粗多糖。
[0019] 所述步驟4)將粗多糖用Sevag法除去蛋白質(zhì)具體為：將粗多糖液用Sevage溶液 反復(fù)除蛋白多次直到艦顏色反應(yīng)和巧=酬反應(yīng)均檢測不到蛋白質(zhì)，Sevage溶液中氯仿：正 下醇的質(zhì)量比為4:1，然后于50°C下減壓濃縮并除去氯仿和正下醇。
[0020] 所述步驟4)第一次用乙醇進(jìn)行沉淀具體為：將除去蛋白質(zhì)的粗多糖液中加入無 水乙醇，邊加邊攬拌，至乙醇濃度達(dá)到80%，置4°C冰箱過夜，800化pm離屯、lOmin，獲得第一 次沉淀后的多糖。
[0021] 所述步驟4)第二次用乙醇進(jìn)行沉淀具體為：將第一次沉淀后的多糖按質(zhì)量體積 比（W:V)為1:5加入雙蒸饋水溶解，加入無水乙醇，邊加邊攬拌，至乙醇濃度達(dá)到60%，置 4°C冰箱過夜，800化pm離屯、lOmin，得到沉淀多糖。
[0022] 所述步驟5)通過DEAE-Se地arose Fast Flow離子交換層析柱洗脫分離具體 為：將沉淀多糖用雙蒸饋水溶解配制成20mg/血溶液，800化pm離屯、lOmin，取上清液， 過0. 22Jim濾膜，上DEAE-Se地arose!^istFlow離子交換層析柱用0.IM化Cl液W 3. 0-3. 4mL/min流速洗脫，洗脫時(shí)用自動(dòng)收集器收集，再用苯酪-硫酸法檢測收集有顯色反 應(yīng)的洗脫液，40°C下減壓濃縮，-50°C下真空冷凍干燥，得到酸性多糖組分，取名為RMPW。
[0023] 所述步驟5)通過Se地ac巧1S-IOO層析柱除鹽洗脫具體為：將酸性多糖組分RMPW 用雙蒸饋水溶解配制成lOmg/mL溶液，過0. 22Jim濾膜，上Se地ac巧1S-IOO層析柱用雙蒸 饋水W0. 5-0. 7mL/min流速洗脫，洗脫時(shí)用自動(dòng)收集器收集，再用苯酪-硫酸法檢測收集有 顯色反應(yīng)的洗脫液，40°C下減壓濃縮成濃度為IOmg/血。
[0024] 所述步驟5)通過Se地aarlS-300層析柱洗脫純化具體為：將所述Se地aarl S-IOO層析柱除鹽洗脫后得到的濃縮液上Se地ac巧1S-300層析柱用雙蒸饋水W 0. 5-0. 7mL/min流速洗脫，洗脫時(shí)用自動(dòng)收集器收集，再用苯酪-硫酸法檢測收集第2個(gè) 洗脫峰的洗脫液，40°C下減壓濃縮，-50°C下真空冷凍干燥，得到均一的多糖組分，取名為 RMPW-2〇 陽0巧]本發(fā)明制備得到的多糖組分RMPW-2采用配有TOSOHBIOSEPG4000SW)(L糖類分析 柱的Waters525型高效液相色譜系統(tǒng)，WWaters2410示差折光檢測器檢測RMPW-2,如圖1 所示，呈現(xiàn)單一對稱峰，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分子量為為5. 06X10化a。 陽0%] 另一方面，采用MlT法檢測RMPW-I對人宮頸癌細(xì)胞化Ia和人胃癌細(xì)胞SGC-7901 的生長均表現(xiàn)出明顯的抑制作用（如表1所示），在濃度1. 6mg/血時(shí)的抑制率分別為 44. 06 %和32. 57 %，對正常細(xì)胞人胚胎腎細(xì)胞肥K293和小鼠巨隧細(xì)胞RAW264. 7生長均無 不良影響（如表2所示），在濃度1. 6mg/mL時(shí)，相對于對照組細(xì)胞活力分別為100. 58%和 110. 98%。 W別表1
[0028]
[0031] 所述的減壓均通過減壓累進(jìn)行減壓。
[0032] 本發(fā)明設(shè)及的質(zhì)量體積比的單位均為g:mL。
[0033] 本發(fā)明具有的有益效果是：
[0034] 本發(fā)明制備的桑枝抗腫瘤活性多糖RMPW-2,純度均一，分子量為5. 06XIO5Da,對 人宮頸癌細(xì)胞化Ia和人胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，對正常細(xì)胞 人胚胎腎細(xì)胞肥K293和小鼠巨隧細(xì)胞RAW264. 7生長均無不良影響，可用于抗腫瘤產(chǎn)品的 開發(fā)，運(yùn)對于提升桑枝的藥用價(jià)值，具有積極的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
【附圖說明】
[0035] 圖1是RMPW-2純度檢測的凝膠色譜圖。
[0036] 表1是RMPW-2對腫瘤細(xì)胞生長的影響。
[0037] 表2是RMPW-2正常細(xì)胞生長的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合附圖表和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0039] 本發(fā)明W下各個(gè)實(shí)施例均采用W下方式先獲得桑枝原料：
[0040] 實(shí)施之前，先將春季新生嫩桑枝或春季老桑枝，太陽光下自然曬干，切片，于40°C 烘箱中烘干至恒重，高速粉碎機(jī)粉碎后過80-100目篩，得到桑枝粉；
[0041] 取桑枝粉，按W:V為1:10加入石油酸溶液，在90°C下回流脫脂比，抽濾，殘?jiān)?10倍體積質(zhì)量濃度為80%乙醇在100°C下回流比，除去巧類和生物堿，重復(fù)1次，抽濾，殘 渣于4(TC烘干，獲得桑枝粉殘?jiān)?陽042] 實(shí)施例1 :
[0043] 取過100目篩的春季新生嫩桑枝粉按上述方法脫脂、除巧類和生物堿后獲得桑枝 粉殘?jiān)碔g: 10血料液比加入雙蒸饋水，超聲波處理40min后，于100°C下提取化再抽濾， 重復(fù)1次，合并兩次抽濾得到的濾液，在50°C減壓濃縮至原體積的1/3,提取出粗多糖；
[0044] 將粗多糖液用Sevage溶液反復(fù)除蛋白多次直到艦顏色反應(yīng)和巧S酬反應(yīng)均檢測 不到蛋白質(zhì)，Sevage溶液中氯仿：正下醇的質(zhì)量比為4:1，然后于50°C下減壓濃縮并除去 氯仿和正下醇；將除去蛋白質(zhì)的粗多糖液中加入無水乙醇，邊加邊攬拌，至乙醇濃度達(dá)到 80%，置4°C冰箱過夜，800化pm離屯、lOmin，獲得第一次沉淀后的多糖；接著按質(zhì)量體積比 (W:V)為1:5加入雙蒸饋水溶解，加入無水乙醇，邊加邊攬拌，至乙醇濃度達(dá)到60%，置4°C 冰箱過夜，800化pm離屯、lOmin，得到沉淀多糖。 W45] 將沉淀多糖用雙蒸饋水溶解配制成20mg/mL溶液，800化pm離屯、lOmin，取上清液， 過0.22ym濾膜，上DEAE-Se地aroseFastFlow離子交換層析柱用0.IM化Cl液^ 3.2血/min流速洗脫，洗脫時(shí)用自動(dòng)收集器收集，再用苯酪-硫酸法檢測收集有顯色反應(yīng)的洗脫 液，40°C下減壓濃縮，-50°C下真空冷凍干燥，得到酸性多糖組分RMPW。
[0046] 將酸性多糖組分RMPW用雙蒸饋水溶解配制成lOmg/mL溶液，過0. 22 y m濾膜，上 S巧hacrylS-IOO層析柱用雙蒸饋水W 0. 6血/min流速洗脫，洗脫時(shí)用自動(dòng)收集器收集，再 用苯酪-硫酸法檢測收集有顯色反應(yīng)的洗脫液，40°C下減壓濃縮成濃度為lOmg/mL。
[0047] 將Se地ac巧1S-IOO層析柱除鹽洗脫后得到的濃縮液上Se地ac巧1S-300層析柱 用雙蒸饋水W0. 6mL/min流速洗脫，洗脫時(shí)用自動(dòng)收集器收集，再用苯酪-硫酸法檢測收 集第2個(gè)洗脫峰的洗脫液，40°C下減壓濃縮，-50°C下真空冷凍干燥，得到均一的多糖組分 RMPW-2〇 W4引 RMPW-2純度均一（圖1)，分子量5. 06 XIO3Da,在濃度1. 6mg/mL時(shí)，對人宮頸癌細(xì) 胞化Ia和人胃癌細(xì)胞SGC-7901生長的抑制率分別為43. 86%和33. 27%，對正常細(xì)胞人胚 胎腎細(xì)胞肥K293和小鼠巨隧細(xì)胞RAW264. 7生長均無不良影響。 W49] 實(shí)施例2 :
[0050] 取過80目篩的春季老桑枝粉按上述方法脫脂、除巧類和生物堿后獲得桑枝粉殘 渣，按Ig:10血料液比