治療腎癌的hTERT基因反義寡核苷酸、藥物組合物及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明提供了一種治療腎癌hTERT基因反義寡核苷酸、藥物組合物及應用，特別 是涉及一種hTERT基因全硫代修飾的反義寡核苷酸、包含有腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導 配體（TRAIL)的藥物組合物，以及它們在用于制備治療腎癌藥物中的應用，屬于基因藥物
技術領域。
【背景技術】
[0002] 端粒位于染色體的末端，具有防止染色體末端降解、融合，起到保護染色體完整 性、維持細胞穩(wěn)定性的作用。端粒酶功能在于合成染色體末端的重復序列，以維持端粒的 長度和穩(wěn)定性。人類端粒酶主要在腫瘤組織中表達，而在正常組織及良性腫瘤中，除了 一些具有高度再生潛力和生殖細胞組織外，幾乎不表達，表明端粒酶激活與腫瘤發(fā)生過 程關系密切。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類端粒酶反轉錄酶催化亞單位（humantelomerasereverse transcriptase，hTERT)，克隆了hTERT核酸序列，其基因含有逆轉錄酶高度保守特異序列。 現(xiàn)已證明ATSiTS因mRNA與端粒酶活性表達一致，其上游表達對端粒酶活性表達起重要作 用，被認為是端粒酶活性表達的關鍵組分和限速因子。
[0003]TRAIL是腫瘤壞死因子（TNF)細胞因子家族的新成員，和TNF、調亡相關因子配體 (FasL)-樣，TRAIL也是通過與細胞膜上的相應的死亡受體（DR4，DR5)結合，激活Caspase 通路，傳遞和放大凋亡信號，從而誘導靶細胞發(fā)生快速、大量、高效的凋亡反應[1]。TRAIL與 其受體DR4,DR5特異性結合激活信號轉導系統(tǒng)，啟動凋亡程序的進行[2]。DR4,DR5同樣是 一種促進細胞凋亡的基因，可以合成執(zhí)行細胞凋亡的酶：核酸內切酶（DNase)和凋亡蛋白 酶（caspase)。前者導致腫瘤細胞染色體DNA片段化，后者水解細胞的蛋白質結構，導致細 胞的全面解體[3]。
[0004] 反義技術的基本原理就是根據堿基互補原則，用人工合成或生物體表達的特定互 補的DNA或RNA片段（反義核酸）以抑制或封閉專一靶基因表達的技術，有理由發(fā)展成為 一種新的基因治療藥物。
[0005] [l]ffuXX?KakehiY?MizutaniΥ?etal.EnhancementofTRAIL/Apo2L mediatedapoptosisbyadriamycinthroughinducingDR4andDR5inrenalcell carcinomacells[J].IntJCancer， 2003， 104(4): 409-417.
[2] 欽憲，何麗婭，李平法主編.醫(yī)學分子生物學[M].鄭州：鄭州大學出版社， 2003.105-116
[3]MsutomiK，PossematoR，WongJM，etal.Thetelomerasereverse transcriptaseregulateschromatinstateandDNAdamageresponses[J].PNAS， 2005,102:8222-8227。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種hTERT基因全硫代修飾反義寡核苷酸（ASPS-0DN)，其可以對 腎癌細胞GRC-1端粒酶活性產生影響，另外，本發(fā)明還提供一種藥物組合物，反義寡核苷酸 與腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TRAIL)，ASPS-ODN對端粒酶活性抑制作用可以對 TRAIL誘導腎癌細胞GRC-1凋亡產生增敏作用。
[0007] 根據本發(fā)明的第一個方面： 一種腎癌細胞hTERT基因反義寡核苷酸，其核苷酸序列為：5'_GGAGCGCGCGGCATCGCGGG _3'。
[0008] 所述的反義寡核苷酸上的所有堿基是經過硫代修飾的。
[0009] 根據本發(fā)明的第二個方面： 一種用于治療腎癌的組合物，包括有權利要求1所述的反義寡核苷酸，以及腫瘤壞死 因子相關的凋亡誘導配體（TRAIL)。
[0010] 根據本發(fā)明的第三個方面： 包含有上述組合物的藥物，所述的藥物是以水為載體，其中反義寡核苷酸的濃度是 5 ~2〇Mmol/L，TRAIL的濃度是 50 ~150ng/ml。 toon] 根據本發(fā)明的第三個方面： 上述的反義寡核苷酸在制備治療腎癌藥物中的應用。
[0012] 根據本發(fā)明的第四個方面： 上述的組合物在制備治療腎癌藥物中的應用。
[0013] 有益效果：hTERT基因的全硫代修飾反義寡核苷酸抑制GRC-1細胞hTERT表達及 端粒酶的活性，可以增加GRC-1細胞對腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體誘導凋亡的敏感 性。采用端粒酶活性抑制劑結合腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體治療腎癌具有良好應用 前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1是ASPS-0DN對腎癌GRC-1細胞端粒酶活性的影響研究中的電泳圖。
[0015] 圖2是RT-PCR檢測ASPS-0DN對腎癌GRC-1細胞hTERT基因mRNA的影響研究中 的電泳圖（其中，]?泳道是11^46^?81?322 0嫩/]\^?10嫩分子量標準；1和2泳道分別是 對照組細胞處理24、48h后；3和4泳道分別是ASPS-0DN處理組細胞處理24、48h 后；5和6泳道分別是SPS-0DN處理組細胞處理24、48h后)。
[0016] 圖3是hTERT反義核酸與100ng/mlTRAIL聯(lián)合作用48h，GRC-l細胞凋亡百分率示 意圖（其中圖例為：A:空白組；B:SPS-ODN;C:ASPS-ODN;D:TRAIL;E:TRAIL+S PS-ODN;F:TRAIL+ASPS-ODN)。
【具體實施方式】
[0017] 實施例1材料和方法 1. 1. 1主要試劑 PMBI-1640培養(yǎng)粉為北京天為時代科技有限公司產品，胎小牛血清為蘭州民海生物制 品公司產品，端粒酶檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，噻唑藍為蘭州百奧生物制品公司 產品，腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體為武漢博士德生物制品公司產品。異硫氰酸熒光 素標記的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白雙染凋亡檢測試劑盒為北京天為時代科技有限公司產 品。
[0018] 1.1. 2引物合成 從基因庫中查出hTERT基因mRNA的全部，根據hTERT基因mRNA的序列分析，設計出互 補于起始密碼子的反義片段，選擇起始密碼子上游6個堿基及后續(xù)的14個堿基共20個堿 基長度為作用的靶序列。
[0019]hTERT基因的反義寡核苷酸的序列為 5' -GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3'（SEQID NO. 1)〇
[0020] 正義核酸序列為 5'-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3'（SEQIDNO. 2)。
[0021] 以上每一條鏈上的所有堿基都進行全硫代修飾，由北京賽百勝生物制品公司合 成，純化，分裝。本研究采用全硫代修飾反義核酸，硫代是指硫元素代替磷酸基團自由氧，是 目前反義核酸應用研究最多的一種修飾，可以增強反義核酸的穩(wěn)定性，提高反義核酸對核 酸酶的耐受性，使其藥物半衰期增加10倍，同時增強反義核酸對腫瘤細胞的親核性，從而 使反義核酸更容易進入腫瘤細胞核內發(fā)揮其抗腫瘤作用。
[0022] 各序列經計算機網上檢索證實與hTERT基因以外的已知人類基因無同 源性。hTERT上游引物 5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'（SEQIDN0. 3);下游引物為 5'-GGATGAAGCGCAGTCTGGA-3'（SEQIDNO. 4)，均由上海生工生物工程技術公司合成。
[0023] 1. 1. 3細胞培養(yǎng) GRC-1細胞株由蘭州大學第二附屬醫(yī)院泌尿研究所提供。采用含100mL/L胎小牛血清 (60°C滅活 3min)，100u/ml青霉素，100u/ml鏈霉素的PMBI-1640 培養(yǎng)基，在 37°C，50mL/L C02飽和濕度條件下培養(yǎng)。實驗選用對數生長期細胞。
[0024] 1. 1. 4統(tǒng)計學分析方法數據采用均數+標準差表示，使用SPSS16. 0統(tǒng)計學軟 件，采用非參數秩和檢驗進行統(tǒng)計學處理，以代〇. 05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0025] 實施例2hTERT基因的全硫代修飾反義寡核苷酸對腎癌GRC-1細胞端粒酶活性的 影響 首先，采用TRAP-銀染法對端粒酶活性定性分析，按試劑盒說明書操作。實驗分為AS PS-0DN組，SPS-0DN組及空白對照組。采用24孔培養(yǎng)板，每組接種3孔，每孔接種1X105 細胞。用最適濃度10Mm〇l/L的0DN處理后，收集寡核苷酸處理不同時期后的GRC-1細胞 (24、48、72h)，用PBS洗滌細胞二次，加入lml冰冷的Washbuffer，置冰上5min，4°C離 心（3000rpm，5min)。棄上清后加入40μL冰冷的Lysisbuffer，置冰上30min4°C離心 (13000rpm，30min;離心上清測定其蛋白濃度至5-l〇Pg/ml。取9ulPCR擴增產物，加入 1μ1 10X上樣緩沖液，在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳lh。置于硝酸銀染液浸泡 30min，顯色液顯色10min，直到全部條帶顯色，置于10%乙酸浸泡5min終止反應。
[0026]TRAP-銀染法結果如圖1所示，1、2、3條帶是hTERTASPS-0DN處理細胞24、48、 72h后；4、5、6條帶