轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根、基因轉(zhuǎn)化方法及液體培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，主要涉及一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的枸杞發(fā)狀根轉(zhuǎn)化及液體培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 枸杞(Lycium chinense Miller)是名貴的藥材和滋補品，枸杞皮又稱地骨皮，是 枸杞的根皮，可入藥，具有涼血、清肺降火等功效。目前在國內(nèi)，對枸杞的研究多集中于地上 部分的生理生化水平，而在地下組織的基因挖掘與功能分析的報道較少;特別是對枸杞的 根系研究更是少之又少。對于枸杞關(guān)鍵生物學(xué)性狀的研究，基因挖掘與功能驗證起著不可 或缺的作用，而在中國枸杞中，基于根系的轉(zhuǎn)基因體系還未建立，其根系相關(guān)的基因功能還 未見報道。目前缺少一套能讓枸杞通過根系的轉(zhuǎn)基因來驗證類胡蘿卜素相關(guān)基因的功能及 其分析。
[0003] 發(fā)根農(nóng)桿菌為革蘭氏陰性細(xì)菌，采用Ri質(zhì)粒侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞，并在其上含 有的一段T-DNA插入到植物基因組中；發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒的T-DNA有ros A-D基因群，T-DNA有tms基因，能誘發(fā)被感染的植物的受傷部位產(chǎn)生大量的毛狀根，且Ri質(zhì)粒T-DNA上的基 因不影響植株的再生，轉(zhuǎn)化效率高，目前已在甘草、煙草等中獲得成功。發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的 毛狀根屬于激素自養(yǎng)型，具有有效成分含量高、生理生化和遺傳性穩(wěn)定、易于進(jìn)行操作控制 等特點，且所誘導(dǎo)的毛狀根可從形態(tài)水平上鑒定，根多叢生、多分枝、多根毛，且無向地性， 這些都可與未轉(zhuǎn)化的根區(qū)別開。
[0004] 在土壤中獲取枸杞根面臨著諸多問題，如果使枸杞的毛狀根的數(shù)量增多，為獲得 大量的枸杞根有效成分提供保障，但目前，采用發(fā)根農(nóng)桿菌在枸杞根系部分的轉(zhuǎn)化及培養(yǎng) 方法尚未報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根的基因轉(zhuǎn)化方法。
[0007] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根的液體培養(yǎng)方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0009] -種轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根的基因轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：
[0010] (1)制備枸杞無菌葉片:將枸杞葉片，清水沖洗干凈后用無水乙醇擦拭表面，用乙 醇水溶液消毒滅菌5-10min，滅菌蒸餾水漂洗3-5次，接種于MS培養(yǎng)基上，25°C暗共培養(yǎng)獲得 枸杞無菌葉片；
[0011] (2)發(fā)根農(nóng)桿菌A4活化:將發(fā)根農(nóng)桿菌A4在含抗生素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，28°C 暗處倒置培養(yǎng)36-48h后獲得單菌落，挑取單菌落于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基上，28°C、搖床 轉(zhuǎn)速180-220rpm暗培養(yǎng)36-48h，得到活化發(fā)根農(nóng)桿菌A4;所述發(fā)根農(nóng)桿菌A4的載體上含有 35S:RFP基因；所述RFP基因用SEQ.ID.N01所示；
[0012] (3)侵染外植體、共培養(yǎng):將活化發(fā)根農(nóng)桿菌A4涂抹在劃□后的枸杞無菌葉片的傷 口處，放在共培養(yǎng)基上，在24°C~25°C，光照16h、暗培養(yǎng)8h，培養(yǎng)4-6d;
[0013] (4)發(fā)根培養(yǎng):將步驟(3)獲得的枸杞葉片更換到發(fā)根培養(yǎng)基上，封口膜封好，24°C ~25°C，光照16h，暗培養(yǎng)8h，培養(yǎng)25-30d，每6-8天更換一次發(fā)根培養(yǎng)基；
[0014] (5)熒光檢測;檢測步驟(4)獲得的毛狀根中的RFP基因的紅色熒光的存在與否;具 有紅色熒光的毛狀根即為轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根。
[0015]上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根。
[0016] 上述轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根的液體培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0017] (1)配制含植物激素的液體培養(yǎng)基：向1/2MS液體培養(yǎng)基中加入植物激素IBA使?jié)?度為0·1-0·5mg/L，混合均勾；
[0018] (2)將轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根在步驟(1)獲得的含植物激素的液體培養(yǎng)基中，24-28°C， 轉(zhuǎn)速80-120rpm，培養(yǎng)；15-20天更換一次步驟（1)獲得的含植物激素的液體培養(yǎng)基，對轉(zhuǎn)基 因枸杞毛狀根進(jìn)行擴大培養(yǎng)。
[0019]含抗生素的LB固體培養(yǎng)基是用下述方法制成:在LB固體培養(yǎng)基配方中加入卡那霉 素，使卡那霉素的終濃度為80_120mg/L，加入壯觀霉素，使壯觀霉素的終濃度為80-120mg/ L〇
[0020] 含抗生素的LB液體培養(yǎng)基是用下述方法制成:在LB液體培養(yǎng)基配方中加入卡那霉 素，使卡那霉素的終濃度為80_120mg/L，加入壯觀霉素，使壯觀霉素的終濃度為80-120mg/ L〇
[0021 ]優(yōu)點：
[0022] 本發(fā)明通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可在短時間內(nèi)得到毛狀根，節(jié)約研究 時間，并且轉(zhuǎn)化效率較高，可達(dá)60%~70%左右。
[0023]在液體培養(yǎng)基中枸杞毛狀根可以大量的繁殖生長，解決了取材的問題，且易于觀 察生長情況。
【附圖說明】
[0024]圖1為轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根照片。
[0025]圖2為轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根熒光檢測結(jié)果照片。
[0026]圖3為轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根液體培養(yǎng)照片。
[0027]具體實施方法
[0028]下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0029]RFP基因用SEQ·ID·N01所示，RFP基因（GenBank:AF506027·1)
[0030] 發(fā)根農(nóng)桿菌A4購買于NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心(http://www·biovector·net/)， 購買時間2014年9月。
[0031]本發(fā)明采用的枸杞樹 [0032]河北枸杞樹(商品化樹）；
[0033]新疆枸杞(商品化樹）
[0034]寧夏枸杞(商品化樹）
[0035] LB液體培養(yǎng)基的配方：1%蛋白胨+0·5%酵母提取物+1%Nacl;
[0036] LB固體培養(yǎng)基的配方：1%蛋白胨+0.5%酵母提取物+1%Nacl+1.5%瓊脂；
[0037]MS培養(yǎng)基:將MS基本培養(yǎng)基粉末+1 %瓊脂[0038]共培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS+3 %蔗糖+0.7 %瓊脂
[0039] 發(fā)根培養(yǎng)基:MS+IBA(h2mg/L。
[0040] 實施例1
[0041]-種轉(zhuǎn)基因河北枸杞毛狀根的基因轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：
[0042] (1)制備河北枸杞無菌葉片:將新鮮的長勢較好的河北枸杞葉片，清水沖洗干凈后 用無水乙醇擦拭表面，用體積濃度為73 %的乙醇水溶液消毒滅菌8min，滅菌蒸餾水漂洗4 次，接種于MS培養(yǎng)基上，25°C暗共培養(yǎng)獲得河北枸杞無菌葉片；
[0043] (2)發(fā)根農(nóng)桿菌A4活化:將發(fā)根農(nóng)桿菌A4在含抗生素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，28°C 暗處倒置培養(yǎng)42h后獲得單菌落，挑取單菌落于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基上，28°C、搖床轉(zhuǎn) 速200rpm暗培養(yǎng)42h，得到活化發(fā)根農(nóng)桿菌A4;所述發(fā)根農(nóng)桿菌A4的載體上含有35S:RFP基 因；所述RFP基因用SEQ.ID.NO1所示；
[0044] (3)侵染外植體、共培養(yǎng):將活化發(fā)根農(nóng)桿菌A4涂抹在劃口后的河北枸杞無菌葉片 的傷口處，放在共培養(yǎng)基上，在25°C，光照16h、暗培養(yǎng)8h，培養(yǎng)5d;
[0045] (4)發(fā)根培養(yǎng):將步驟(3)獲得的河北枸杞葉片更換到發(fā)根培養(yǎng)基上，封口膜封好， 25°C，光照16h，暗培養(yǎng)8h，培養(yǎng)28d，每7天更換一次發(fā)根培養(yǎng)基；
[0046] (5)熒光檢測；利用熒光顯微鏡檢測步驟(4)獲得的毛狀根中的RFP基因的紅色熒 光的存在與否；結(jié)果表明轉(zhuǎn)入帶有35S:RFP報告基因的植株根系可見整條根均有較強紅色 熒光即為轉(zhuǎn)基因河北枸杞毛狀根。（見圖1，圖2)
[0047]含抗生素的LB固體培養(yǎng)基是用下述方法制成:在LB固體培養(yǎng)基配方中加入卡那霉 素，使卡那霉素的終濃度為l〇〇mg/L，加入壯觀霉素，使壯觀霉素的終濃度為100mg/L。
[0048] 含抗生素的LB液體培養(yǎng)基是用下述方法制成:在LB液體培養(yǎng)基配方中加入卡那霉 素，使卡那霉素的終濃度為l〇〇mg/L，加入壯觀霉素，使壯觀霉素的終濃度為100mg/L。
[0049] 實施例2
[0050]-種轉(zhuǎn)基因新疆枸杞毛狀根的基因轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：
[0051] (1)制備新疆枸杞無菌葉片：將枸杞葉片，清水沖洗干凈后用無水乙醇擦拭表面， 用體積濃度為70 %的乙醇水溶液消毒滅菌10min，滅菌蒸餾水漂洗3次，接種于MS培養(yǎng)基上， 25°C暗共培養(yǎng)獲得新疆枸杞無菌葉片
[0052] (2)發(fā)根農(nóng)桿菌A4活化:將發(fā)根農(nóng)桿菌A4在含抗生素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，28°C 暗處倒置培養(yǎng)36h后獲得單菌落，挑取單菌落于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基上，28°C、搖床轉(zhuǎn) 速180rpm暗培養(yǎng)48h，得到活化發(fā)根農(nóng)桿菌A4;所