用于肝癌早期預(yù)警和篩查的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)（腫瘤篩查）領(lǐng)域，具體涉及一種可用于肝癌早期預(yù)警和 篩查的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 人原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC)指肝細胞或肝內(nèi)膽管細胞 發(fā)生的癌，為我國常見惡性腫瘤之一，其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中列第三位，僅次于 胃癌和食管癌。我國約有1. 2億乙型肝炎表面抗原攜帶者，每年約有300萬人可能從急性 乙型肝炎發(fā)展為慢性肝炎，死于肝病30萬人，其中12萬人死于HCC，在我國，乙型肝炎病 毒和丙型肝炎病毒感染是導(dǎo)致發(fā)展原發(fā)性肝癌（HCC)的最直接原因，大多數(shù)肝癌患者的發(fā) 病進展過程表現(xiàn)為慢性肝炎（chronichepatitis,CH)、肝硬化（livercirrhosis,LC)到 HCC的發(fā)展進程。而在全世界每年新發(fā)現(xiàn)的肝癌病人中，其中就有42. 5%發(fā)生在中國，因此 中國是一個肝癌大國。對于肝癌患者來說早期手術(shù)治療是根本的方法。目前早期對小肝癌 行肝葉切除，可有根治的希望。然而診斷較晚，事實上80%以上肝癌患者被診斷時腫瘤已進 入中晚期而失去手術(shù)機會。
[0003] 通過臨床研究表明，肝癌發(fā)現(xiàn)得越早，治療效果越好，能提高病人的預(yù)后及存活 率，因此早期預(yù)警篩查則顯得尤其重要。然而，目前臨床上早期篩查HCC的主要指標是血清 甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP)水平和影像學(xué)B超監(jiān)測，但是一部分HCC患者血清AFP 長期保持低水平（<20ng/ml)，而B超在檢測和進一步判斷結(jié)節(jié)的特征時有一定的局限性， 從而影響到肝癌早期診斷的靈敏性。但目前臨床上未有十分有效的早期檢測方法，因此建 立高靈敏，經(jīng)濟，簡便的分子技術(shù)篩查方法尤為重要。
[0004] 研究表明，肝細胞癌組織中存在多種腫瘤相關(guān)基因CpG島的甲基化，構(gòu)成其獨特 的甲基化譜，成為肝細胞癌的表觀遺傳標志，且在腫瘤發(fā)生的癌變前階段中，腫瘤相關(guān)因子 啟動子甲基化異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。有研究認為，部分抑癌基因的異常甲基 化在正常肝和慢性肝炎階段未發(fā)現(xiàn)，肝硬化（livercirrhosis，LC)開始出現(xiàn)，到HCC階段 有累加的趨勢，而部分癌基因則與之相反，正常肝和慢性肝炎階段至HCC階段甲基化程度 逐漸降低，這為腫瘤的早期診斷提供新的干預(yù)靶點。
[0005]RASSF相關(guān)區(qū)域家族 1A基因（ras-associationdomainfamily1A,RASSF1A)是 定位于腫瘤高頻雜合性丟失區(qū)域3p21. 3位點的抑瘤基因，編碼一個微管相關(guān)蛋白。該基 因在多種實體瘤組織中因啟動子高甲基化而表達沉默，是迄今為止在腫瘤組織中甲基化 程度最高的基因之一。pl6基因又叫MTS(multipletumorsuppressor1)基因，這是一種 細胞周期中的管家基因，直接參予細胞周期的調(diào)控，負調(diào)節(jié)細胞增殖及分裂，檢測P16基因 有無改變對判斷患者腫瘤的易感性以及預(yù)測腫瘤的預(yù)后，具有十分重要的臨床意義。胚肝 血影蛋白（embryonicliverfodrin，ELF)是一種新發(fā)現(xiàn)的β血影蛋白（β-Spectrin)， 在TGF-β信號通路中與Smad3/4相互作用，缺失ELF則Smad3/4不能定位。文獻報道，抑癌 基因ELF在正常肝組織中表達，而肝癌干細胞及肝癌組織中表達下調(diào)，并且在敲除ELF基因 的小鼠中，40%自發(fā)產(chǎn)生肝癌，表明ELF在肝癌發(fā)生的早期發(fā)揮重要作用，但ELF在肝癌組 織中表達下調(diào)的原因尚未明確。細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負調(diào)控因子（suppressorsofcytokine signaling，S0CS)家族是1997年以來被發(fā)現(xiàn)的JAK/STATs途徑負性調(diào)節(jié)因子，包括CIS和 S0CS1-7共8個成員，結(jié)構(gòu)相似，由N區(qū)、中央?yún)^(qū)SH2結(jié)構(gòu)域和C端SOCSbox盒組成，S0CS3 是調(diào)節(jié)機體諸多細胞因子信號的重要調(diào)控分子，在發(fā)育、免疫、腫瘤發(fā)生、代謝等許多生理 調(diào)節(jié)過程中具有重要作用。SFRP1屬于SFRP(secretedfrizzled-relatedprotein)基因 家族，為Wnt/frizzled信號的胞外調(diào)節(jié)物，通過與Wnt反應(yīng)或直接與frizzled反應(yīng)而調(diào)節(jié) Wnt信號的傳導(dǎo)，具有調(diào)節(jié)凋亡，在胚胎形成和腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作 用的功能，稱為分泌型凋亡相關(guān)蛋白（SARP)?；蚪M重復(fù)序列LINE1(longinterspersed nuclearelements)是一種分布在人類基因組內(nèi)的內(nèi)源性的易變基因序列。研究報道，大 約有4X105的LINE1重復(fù)拷貝存在于人類基因組，它們占據(jù)整個人類基因組的5%。LINE1 啟動子甲基化會抑制反轉(zhuǎn)座子激活和轉(zhuǎn)錄，所以L1的甲基化程度可以作為衡量基因組穩(wěn) 定性和癌基因活躍程度的標志之一。
[0006] 正常人循環(huán)血液中存在少量游離DNA(約10ng/ml)，而腫瘤患者血漿DNA水平遠遠 高于正常人（超過l〇〇ng/ml)。腫瘤患者循環(huán)血中游離DNA主要是腫瘤細胞凋亡或組織壞 死后釋放，并且保持有腫瘤細胞DNA的生物學(xué)特征改變。檢測外周血游離DNA中基因甲基 化的狀態(tài)可能反應(yīng)出患者腫瘤細胞的甲基化狀態(tài)。鑒于理想的分子標志物出現(xiàn)在疾病發(fā)生 的早期含量較低，所以迫切需要尋找高靈敏度和無創(chuàng)性的早期檢測手段。
[0007] 甲基化是蛋白質(zhì)和核酸一種重要的修飾，調(diào)芐基因的表達和關(guān)閉，與癌癥、衰老、 老年癡呆等許多疾病密切相關(guān)，是表觀遺傳學(xué)的重要研究內(nèi)容之一。DNA甲基化是指生物 體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase，DMT),以s-腺苷甲硫氨酸（SAM)為供體， 將甲基轉(zhuǎn)移到待定的堿基上的過程。他能通過結(jié)合甲基化結(jié)合域（MBD)等和組蛋白去乙酰 化能引起基因的表達沉默，在腫瘤形成中，DNA甲基化紊亂可表現(xiàn)為基因組整體的低甲基化 (hypomethylation)以及特定區(qū)域（如啟動子區(qū)域）高甲基化。而研究結(jié)果提示亞硫酸氫 鹽能使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶（C)脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶（U)，而甲基化的胞嘧啶保 持不變。由于尿嘧啶與胸腺嘧啶（T)相似，在DNA聚合反應(yīng)過程中可以作為胸腺嘧啶，根據(jù) 修飾后的差異DNA設(shè)計PCR引物，當進行PCR反應(yīng)時，在擴增后的產(chǎn)物中變成胸腺嘧啶，而 5-甲基胞嘧啶在亞硫酸氫鹽處理過程中不發(fā)生改變，經(jīng)PCR擴增后的產(chǎn)物依然是胞嘧啶， 最后對PCR產(chǎn)物進行分析就可判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化。
[0008]復(fù)合擴增基因座技術(shù)（multiplexploymerasechainreaction,m-PCR)也稱多 重PCR，是用多對引物同時對模板DNA上的多個區(qū)域進行擴增。一般PCR僅應(yīng)用一對引物， 通過PCR擴增產(chǎn)生一個核酸片段；多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系里加上多對引物，同時 擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。多重 PCR擴增體系中包含有化學(xué)修飾熱啟動Taq酶的MasterMix，可避免由非特異性擴增和引 物二聚體引起的非特異性產(chǎn)物的形成，適用于50-1500bp、多達30對引物的多重PCR擴增， 對不同的引物對能保證相近的擴增效率，可處理不同長度和GC含量的片段。它的特點主要 有三點：①高效性，在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)對有多個型別的目的基因進行分型②經(jīng)濟性，可最 大限度的節(jié)省檢材用量及試劑消耗。③簡便性，多個基因在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出，將大大 的節(jié)省時間，為臨床提供更多更準確的診斷信息。而本專利中主要用于RASSFlA、pl6、ELF、 S0CS3、SFRP1、LINE1六基因的甲基化反應(yīng)，而PCR產(chǎn)物檢測方法主要有兩種一PAGE銀染和 毛細管電泳。
[0009]PAGE(Polyacrylamidegelelectrophoresis)即聚丙稀酰胺凝膠電泳，是以聚丙 烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。其原理是因 為聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳（Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE);該技術(shù)選用非變性聚丙烯酰胺凝 膠，其在電泳的過程中，PCR產(chǎn)物能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)其分子量大小、形狀及其所附帶 的電荷量而逐漸呈梯度分開。銀染顯色中，在堿性條件下，用甲醛將蛋白帶上的硝酸銀（銀 離子）還原成金屬銀，以使銀顆粒沉積在PCR產(chǎn)物帶上，染色的程度與基團有關(guān)。
[0010] 毛細管電泳是以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣 品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分