用于檢測腸細胞屏障機能障礙的方法和組合物的制作方法
【專利說明】用于檢測腸細胞屏障機能障礙的方法和組合物 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及用于檢測與腸易激綜合癥（IBS)和炎癥性腸?。↖BD)有關的細胞屏障 機能障礙的方法和組合物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 腸易激綜合癥(IBS)是一種常見臨床病況，特征在于腸頻率、一致性的改變和腹部 不適。使用Rome II標準的流行病學研究顯示在北美洲IBS的流行從5%變化到12%，在亞洲 從1 %到22%和在歐洲從1 %到8%。在大多數(shù)研究中觀察到女性占優(yōu)，特別是西方國家。IBS 的主要驅動者之一可能是異常的腸上皮細胞(IEC)擠壓。
[0004] 炎癥性腸?。↖BD)是一組大腸和小腸的發(fā)炎病況。IBD的主要類型是克羅恩疾病和 潰瘍性結腸炎。IBS和IBD二者可以歸因于或者由于異常的腸上皮細胞（IEC)擠壓而惡化，從 而導致了患者的細胞屏障機能障礙。

【發(fā)明內容】

[0005] 在一種實施方案中，本發(fā)明包括一種檢測患者的腸易激綜合癥（IBS)或者炎癥性 腸病（IBD)的方法，其在于：（a)用探針染色患者的腸、口咽或者口腔上皮細胞，該探針具有 共輒到半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-I抑制劑上的可檢測的標記劑，和(b)相對于分別來自正 常人的類似染色的腸、口咽或者口腔上皮細胞，檢查該染色的腸、口咽或者口腔上皮細胞的 可檢測的標記劑的升高水平的存在，作為與患者腸、口咽或者口腔上皮細胞有關的半胱氨 酸蛋白酶-1超過正常水平的證據。
[0006] 患者腸上皮細胞（IEC)，口咽上皮細胞(OEC)或者口腔上皮細胞(BEC)中半胱氨酸 蛋白酶-1水平的升高是與患者的腸易激綜合癥（IBS)或者炎癥性腸?。↖BD)有關的細胞屏 障機能障礙的指征。
[0007] 在一種實施方案中，患者IEC獲自來自于患者的腸內壁的活組織檢查或者體腔吸 出，用熒光標記劑體外染色，并且分析熒光水平。在另外一種實施方案中，患者OEC獲自患者 的口咽細胞的牙齒活組織檢查或者體腔吸出，用熒光標記劑體外染色，并且分析熒光水平。 在又一實施方案中，患者BEC是通過例如輕輕的藥簽擦拭面頰來獲得的，用熒光標記劑體外 染色，并且分析熒光水平。熒光檢測可以通過熒光顯微鏡法，熒光板閱讀器，流式細胞測量 法或者適于檢測和測量熒光水平的其他方法來進行。
[0008] 在另一種通用實施方案中，OEC或者BEC中半胱氨酸蛋白酶-1水平升高可以診斷克 羅恩疾?。↖BD的一種主要類型）。
[0009] 所述探針可以是半胱氨酸蛋白酶-1抑制劑例如四肽YVAD和熒光染料的共輒物。一 種示例性的探針具有結構Alexa Fluor 488-GGGG-YVAD-FMK。
[0010] 在一種示例性實施方案中，將細胞用下面的來染色：（a)第一探針，其包含共輒到 半胱氨酸蛋白酶-1抑制劑上的第一可檢測的標記劑，和(b)第二探針，其包含共輒到半胱氨 酸蛋白酶_3&7抑制劑上的，不同于第一標記劑的第二可檢測的標記劑。分析所述細胞來測 定與半胱氨酸蛋白酶-1有關的標記劑相對于與半胱氨酸蛋白酶_3&7有關的標記劑的比率。 健康受測試者的半胱氨酸蛋白酶-1與半胱氨酸蛋白酶_3&7標記劑之比相比于具有IBS或 IBD的受測試者明顯更低，例如低了至少40%。一種示例性第二探針是半胱氨酸蛋白酶-3/7 抑制劑I和熒光染料的共輒物，它的峰值吸收和發(fā)射波長不同于第一探針熒光染料。
[0011] 當IEC中的半胱氨酸蛋白酶-1的水平明顯高于正常水平時，所述方法可以用于指 征通過半胱氨酸蛋白酶-1抑制劑、抗炎藥、益生菌劑或者這些試劑的組合的患者治療。
[0012] 在另一種通用實施方案中，IEC、0EC或BEC是原位染色的，并且通過探針基共聚焦 激光顯微內鏡(PCLE)來觀察。
[0013] 在其他方面，本發(fā)明包括一種檢測患者腸細胞屏障機能障礙的方法，其包括步驟： 通過探針基共聚焦激光顯微內鏡(PCLE)獲得患者的IEC的原位圖像，和計算所述圖像中的 IEC，來確定成像的IEC中的間隙的數(shù)目。約每百細胞大于2的間隙密度是細胞屏障機能障礙 的指征，并且可以用作患者通過例如益生菌劑治療的指征。
[0014] 還公開的是一種用于檢測腸細胞屏障機能障礙的探針組合物。該組合物包括(a) 第一探針，其包含共輒到半胱氨酸蛋白酶-1抑制劑上的第一可檢測的標記劑，和(b)第二探 針，其包含共輒到半胱氨酸蛋白酶_3&7抑制劑上的，不同于第一標記劑的第二可檢測的標 記劑。該第一探針可以是四肽YVAD和熒光染料的共輒物，例如探針具有結構Alexa Fluor488-GGGG-YVAD-FMK。該第二探針可以是半胱氨酸蛋白酶-3/7抑制劑I和不同于第一 探針的熒光染料的共輒物。
[0015] 當結合附圖來閱讀本發(fā)明下面的詳細說明時，本發(fā)明的這些和其他目標和特征將 變得顯而易見。
【附圖說明】
[0016] 圖1.在極化的T84單層中，IEC誘導的細胞擠壓的半胱氨酸蛋白酶-1活化。（a)在尼 日利亞菌素處理的（50μΜ)培養(yǎng)的T84細胞中，活化的半胱氨酸蛋白酶-1代表性FLICA 1染色 (綠色）。紅色，ZO-I染色;藍色，DAPI，綠色，F(xiàn)LICAl染色（比例尺，δΟμπι)。^)在尼日利亞菌素 處理的（50μΜ)Τ84細胞中增加的活性半胱氨酸蛋白酶-l(plO)表達。（c)用尼日利亞菌素處 理的Τ84細胞的TEM外觀:染色質集中在核膜周圍，細胞質中的致密體的小的和大的透明液 泡，和增加的基質密度的完好的線粒體。A，頂部表面，B，基部表面，N，核(比例尺，2μπι)。 [00 17]圖2.在半胱氨酸蛋白酶-1活化之后，極化的單層改變的滲透性。（a)用尼日利亞菌 素處理的，用Ac-YVAD-CMK反轉的T84單層的TER(±S.D.)中與劑量相關的降低(在尼日利亞 菌素25μΜ時）。（b)TER的時間相關的降低，其是通過用尼日利亞菌素處理的，用Ac-YVAD-CMK 反轉的T84單層的ECIS來測量的（在尼日利亞菌素25μΜ時）。（c)Flu〇resbtite?YG微球和大 腸桿菌TMW2.497沿著用尼日利亞菌素 ΙΟμΜ處理一整夜的單層的移動。紅色，ZO-I染色；中心 圖像綠色，Iym微球，右側圖像綠色，大腸桿菌TMW2 · 497 (比例尺，50μπι)。數(shù)據表示的是三個 的獨立實驗。*Ρ〈〇.〇5。
[0018] 圖3.在IL-1OKO中與WT小鼠比較的增加的半胱氨酸蛋白酶-1活化。（a)通過免疫印 跡分析的在IL-10K0中增加的活性半胱氨酸蛋白酶-l(plO)表達。（b)IL-10K0(N = 5)的腸組 織中增加的活性IL-1 β。（ c)來自WT和IL-1OKO小鼠的PCNA染色的腸區(qū)的代表性圖像（比例 尺，50μπι)。（ d)每個嚙齒動物腸組織的腺窩的陽性PCNA染色細胞的數(shù)目。*P〈0.05。
[0019] 圖4.1L-1OKO小鼠中到內腔微粒和微生物的增加的滲透性。（a) 口服的FITC-右旋 糖苷向血液樣品中的滲透(N=4)。（b) 口服的0.5ymFluoresbrite?微球在血液樣品中的存 在0=6)。（幻大腸桿菌TMW 2.497向肝臟和脾臟的迀移0=4)。（(1)進入小鼠腸的擠壓區(qū)的 大腸桿菌TMff 2.497的代表性圖像。*P〈0.05，#P〈0.0 l。
[0020] 圖5.半胱氨酸蛋白酶-1對于體內微球的IEC擠壓和滲透的調節(jié)。（a)用Ac-YVAD-CMK I Omg/kg在IL-1OKO小鼠中對于IEC擠壓的治療，其是通過使用共聚焦顯微內鏡經時測 量的上皮間隙密度來測定的(N=S)Jb) 口服的0.5ymFluoresbrite?微球在IL-10K0小鼠血 液樣品中的存在(N=6)。（c)綠膿桿菌的IV類型菌毛0.33mg/kg口強飼法1天，對于WT小鼠的 IEC擠壓的影響(N=3)，其是通過間隙密度來測定的。*P〈0.05。
[0021] 圖6.患者的IEC的半胱氨酸蛋白酶-1和半胱氨酸蛋白酶_3&7活化。（a)黏膜活組織 檢查樣品的代表性活化的半胱氨酸蛋白酶-1和半胱氨酸蛋白酶_3&7染色，白色箭頭表示 陽性染色的IEC(比例尺，50μπι)。（b)在對照(N=3)和IBD (N = 3)患者的黏膜活組織檢查樣品 中，F(xiàn)LICA 1或者3&7染色的細胞校正到上皮細胞總數(shù)（土 S.DJ13(C)來自由IBD患者的腸道 吸出物所制備的細胞團塊的代表性上皮和免疫細胞(H&E染色，放大倍率400X)。（ d)對照(N =7)和IBD(N=Il)患者的內腔吸出物中，擠出的IEC(±S.D.)的數(shù)目。（e)在內腔吸出物中， 活化的半胱氨酸蛋白酶-1與半胱氨酸蛋白酶_3&7的比例。*P〈0.05。
[0022]圖7.在無癥狀對照(N = 3)和IBD患者(N = 3)的黏膜組織中活化的半胱氨酸蛋白酶 1和IL-Ιβ表達。（a)與對照患者相比，通過ELISA所測量的在IBD中增加的活性IL-Ιβ表達。 (b)免疫印跡分析，其證實了活性IL-Ιβ在IBD患者末端回腸中增加的表達。（c)通過免疫印 跡分析，在IBD患者中增加的活性半胱氨酸蛋白酶-l(plO)表達。*P〈0.05。
[0023]圖8.來自患者的末端回腸的代表性pCLE圖像，其被用于計數(shù)上皮細胞和間隙。在 這個圖像中未觀察到間隙。白色箭頭表示用于細胞計數(shù)的單個上皮細胞。
[0024]圖9.患者末端回腸的pCLE圖像。a)來自健康對照患者（左邊)和具有IBS的患者(右 邊)的末端回腸的代表性圖像。標記了絨毛的固有層和內腔。白色箭頭表示兩個相鄰的上皮 間隙，其作為上皮細胞壁的超致密區(qū)而出現(xiàn)。b)在對照患者分析中所用的三個連續(xù)的pCLE 圖像。C)在IBS患者分析中所用的三個連續(xù)的pCLE圖像。比例尺:20μπι。
[0025]圖10.比較了對照患者和IBS患者的末端回腸中的上皮間隙密度（中值土四分差）。 上皮間隙密度表達為上皮間隙數(shù)目/1000個計數(shù)的細胞。*表示P〈〇. 001。
[0026] 圖11顯示了在來自正?；颊吆涂肆_恩疾病患者的牙齒活組織檢查的口咽上皮細 胞中，半胱氨酸蛋白酶-1表達的水平，其是通過免疫印跡分析測定的。
【具體實施方式】
[0027] A.通過半胱氨酸蛋白酶-1染色檢測細胞屏障機能障礙的方法
[0028] Al.半胱氨酸蛋白酶-1介導的IEC擠壓導致在上皮單層中的破裂
[0029]為了調查半胱氨酸蛋白酶-1-誘導的IEC擠壓的形態(tài)，我們將尼日利亞菌素（一種 公知的Nlrp 3-依賴的炎性體活化劑)施用到極化的T84單層上。使用FLICAl