一種利用巖藻糖提高馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶酶活力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶化學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種利用巖藻糖提高馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶酶活力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]富馬酸(Fumaricacid)，又稱反丁稀二酸、延胡索酸，是一種天然存在的有機(jī)酸，廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工、涂料、增塑劑等領(lǐng)域。如在食品方面，可用作口味純正的酸味劑、風(fēng)味增強(qiáng)劑。在醫(yī)藥方而，可以用于生產(chǎn)解毒藥二琉基丁二酸鈉等，富馬酸鐵則廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)上治療人體的小紅血球貧血病。目前，富馬酸的生產(chǎn)大都通過(guò)石化方法由馬來(lái)酸酐制備得到，然而化學(xué)合成法存在成本高、副產(chǎn)物多及可能造成的環(huán)境污染等問(wèn)題，這使得人們的目光逐漸轉(zhuǎn)向環(huán)境友好的生物法來(lái)制備富馬酸。
[0003]馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶(EC5.2.1.1 ,Maleate cis-trans Isomerase,MaiA)是一種能夠?qū)ⅠR來(lái)酸(順丁烯二酸)催化轉(zhuǎn)化成富馬酸(反丁烯二酸)的異構(gòu)酶，能夠在碳碳雙鍵不斷裂的情況下，實(shí)現(xiàn)順式丁烯二酸向反式丁烯二酸的異構(gòu)化，屬于天冬氨酸、谷氨酸消旋酶超家族。
[0004]酶作為一種生物催化劑，對(duì)環(huán)境十分敏感，易受物理、化學(xué)和生物等因素的影響而失活，如何提高酶的穩(wěn)定性及酶活力已成為酶學(xué)反應(yīng)研究的重點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種利用巖藻糖提高馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶酶活力的方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]本發(fā)明首先提供了巖藻糖在提高馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶酶活力中的應(yīng)用。
[0008]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種利用巖藻糖提高馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶酶活力的方法，具體為在馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶參與的酶解反應(yīng)體系中添加巖藻糖。
[0009]巖藻糖(fucose)是六碳糖的一種，又稱6-脫氧-L-半乳糖，并可以看做是一種甲基戊糖。自然界存在的巖藻糖絕大多數(shù)為L(zhǎng)-巖藻糖，D構(gòu)型的巖藻糖僅作為稀有糖，發(fā)現(xiàn)于一些糖甘類(lèi)化合物中。已知巖藻糖的生理效應(yīng)體現(xiàn)在:1、神經(jīng)傳導(dǎo)；2、免疫調(diào)節(jié);3、抑制癌癥之生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移;4、呼吸道感染之預(yù)防與治療;5、膠原蛋白之調(diào)節(jié)。
[0010]本發(fā)明經(jīng)大量客觀試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在溶液中可能會(huì)由于疏水作用而發(fā)生聚集引發(fā)變性，酶的活性中心在一定條件下可能發(fā)生聚集作用而導(dǎo)致活性失活。巖藻糖比一般六碳糖在第六碳原子上少一個(gè)羥基，所以巖藻糖比其他單糖親水性弱，而疏水性強(qiáng)一些。由于這種特性，巖藻糖可能與酶的活性中心結(jié)合起到穩(wěn)定酶活性結(jié)構(gòu)的作用，同時(shí)這種特性也可能有助于底物和產(chǎn)物進(jìn)出酶的活性中心，從而加快酶的反應(yīng)速率，提高酶的穩(wěn)定性。
[0011]添加時(shí)，所述巖藻糖可直接添加固體也可配制成水溶液添加。在反應(yīng)體積較小的反應(yīng)體系中，若直接加入巖藻糖固體其添加量很小，為了便于稱量，可先配制成高濃度的巖藻糖水溶液，用移液槍進(jìn)行添加，例如:在500yL反應(yīng)體系中，要使巖藻糖終濃度為0.5mmol/L，添加0.5yL、0.5mol/L的巖藻糖水溶液即可。
[0012]發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所述巖藻糖相對(duì)于酶解反應(yīng)體系的添加濃度為0.3?1.0mmol/L時(shí)，馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶的酶活力顯著提高。
[0013]當(dāng)所述巖藻糖相對(duì)于酶解反應(yīng)體系的添加濃度為0.5mmol/L時(shí)，酶活力最高，在37°C、pH 8.4的酶解反應(yīng)條件下，其酶活力比未添加巖藻糖的酶活力提高了26%。
[0014]進(jìn)一步地，所述酶解反應(yīng)條件為20?50°C，pH3.5?9.0。
[0015]為了更好的促進(jìn)馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶進(jìn)行酶解，所述酶解反應(yīng)的條件為37°C，pH8.4。在該溫度和pH條件下，更加適宜馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶發(fā)揮酶解功能。
[0016]進(jìn)一步地，所述酶解反應(yīng)體系中，馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶的濃度為20?200U，反應(yīng)底物的濃度為100?2500mmol/L。該濃度條件下，馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶催化馬來(lái)酸轉(zhuǎn)化為富馬酸的效率較高，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到90 %以上。
[0017]作為優(yōu)選，所述酶解反應(yīng)體系中，馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶的濃度為20?50U，反應(yīng)底物的濃度為100?1000mmol/L。該濃度條件，能夠最好的發(fā)揮巖藻糖提高酶活力的作用。
[0018]進(jìn)一步地，所述反應(yīng)底物為馬來(lái)酸或馬來(lái)酸鹽。
[0019]更進(jìn)一步地，所述馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶來(lái)源于假單胞菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)或含有馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶基因或其突變體基因的工程菌的培養(yǎng)物或分泌物。
[0020]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶購(gòu)自江南大學(xué)，由來(lái)源于粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)的馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶編碼基因重組大腸桿菌BL21表達(dá)產(chǎn)生。
[0021]本發(fā)明還提供了一種以馬來(lái)酸為原料生產(chǎn)富馬酸的方法，包括如下步驟:
[0022]I)將比活為50U/mg的馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶酶液，用緩沖液稀釋至pH8.4，加入pH8.4濃度為lmol/L的馬來(lái)酸溶液中；
[0023]所述馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶酶液與馬來(lái)酸溶液的體積比為9:1;
[0024]2)加入巖藻糖，使巖藻糖相對(duì)于整個(gè)反應(yīng)體系的濃度為0.3?1.0mmol/L;
[0025]3)35?40°C反應(yīng)15?30min，用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，收集濾液進(jìn)行處理，得到富馬酸。
[0026]作為優(yōu)選，所述緩沖液為pH8.4，50mmol/L的NaHP04_KH2P04緩沖液。
[0027]本發(fā)明的有益效果在于:
[0028]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶參與的酶解反應(yīng)體系中添加巖藻糖，能夠提高馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶酶活力。因此提供一種利用巖藻糖提高馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶酶活力的方法，所述方法簡(jiǎn)單易行，在馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶反應(yīng)過(guò)程中具有可以節(jié)約酶用量，提高反應(yīng)效率的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中不同濃度巖藻糖對(duì)馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶酶活力的影響示意圖。
[0030]圖2本發(fā)明實(shí)施例3中添加巖藻糖對(duì)馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶反應(yīng)穩(wěn)定性的影響示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明