一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcript1nactivator-1 ike effectornuclease,TALEN)技術(shù)、鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat ,CRISPR)技術(shù)是目前基因組編輯領(lǐng)域的三大技術(shù)。目前，TALEN和ZFN是發(fā)展比較成熟的兩種定點(diǎn)突變技術(shù)，但是，這兩種技術(shù)在構(gòu)建載體過(guò)程可識(shí)別特異位點(diǎn)的核酸酶較為繁瑣，每一個(gè)位點(diǎn)需要構(gòu)建兩個(gè)相應(yīng)的核酸酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法。
[0004]本發(fā)明提出了一種以CRI SPR/Cas9基因編輯技術(shù)打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，包括以下步驟:
[0005]SI，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)分別將香味基因各個(gè)外顯子及內(nèi)含子處能被Cas9識(shí)別的序列打靶，然后對(duì)基因組DNA序列切割后引發(fā)DNA修復(fù)，從而產(chǎn)生缺失突變，獲得功能缺失的Badh2基因；
[0006]S2，將粳稻、秈稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，用成熟胚、幼穗和子房等為外植體誘導(dǎo)獲得二倍體愈傷組織，用花藥、花粉和未受精子房等為外植體誘導(dǎo)獲得單倍體愈傷組織，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將打靶載體導(dǎo)入愈傷組織細(xì)胞；
[0007]S3，將打靶載體導(dǎo)入到二倍體愈傷組織的細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性愈傷，分化成苗，鑒定遺傳轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株，從Tl群體分離得到香稻品系;將打靶載體導(dǎo)入到單倍體愈傷組織的細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性愈傷，用秋水仙素加倍，分化成苗，鑒定遺傳轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株，最終得到香稻品系O
[0008]優(yōu)選的，所述基因敲除靶點(diǎn)應(yīng)設(shè)在起始密碼子附近或其下游的外顯子區(qū)域，靶序列一般由19個(gè)堿基構(gòu)成，靶序列前面必須是堿基G作為轉(zhuǎn)錄的起始信號(hào)，而靶序列末端的PAM序列必須是NGG，且靶序列必須具有唯一性。
[0009]優(yōu)選的，將所述構(gòu)建好的載體質(zhì)粒DNA利用農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌，并抽質(zhì)粒驗(yàn)證表達(dá)載體的目的片段。
[0010]優(yōu)選的，所述粳稻、秈稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，獲得香味水稻植株，以下以鄂早17為例:
[0011](I)以鄂早17成熟胚，幼穗和子房等外植體的愈傷組織(二倍體)為受體，將打靶載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入到二倍體受體細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)篩選后再分化成苗，從Tl群體中篩選出純合的帶香味的植株。
[0012](2)以鄂早17為材料進(jìn)行花藥，花粉和未受精子房等外植體愈傷組織(單倍體)為受體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將香味基因Badh2的打靶載體導(dǎo)入到單倍體愈傷組織中，用潮霉素篩選后，利用秋水仙素加倍處理，再分化成植株，這樣得到帶有香味基因的純合二倍體植株。
[0013]本發(fā)明中提到的CRISPR/Cas9是第三代基因編輯技術(shù)，其工作原理是細(xì)菌抵御降解入侵的噬菌體等外源DNA時(shí)，在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下，CRISPR被轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的RNA前體，然后加工成一系列短的含有保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟crRNA，最終識(shí)別并結(jié)合到與其互補(bǔ)的外源DNA序列上發(fā)揮剪切作用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)每個(gè)針對(duì)特異位點(diǎn)的crRNA只有十幾個(gè)堿基，整個(gè)載體較小。而TALEN和ZFN技術(shù)操作比較繁瑣，成本昂貴，特別是TALEN技術(shù)在構(gòu)建過(guò)程中需要大量的分子克隆和測(cè)序操作，一般實(shí)驗(yàn)室都無(wú)法操作。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需要設(shè)計(jì)打靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩條單核苷酸鏈，與需要打靶的目的片段進(jìn)行替換，構(gòu)建相應(yīng)的載體即可。此技術(shù)不僅具有可拓展性，而且構(gòu)建載體的過(guò)程只需要幾步就可以完成，操作簡(jiǎn)單方便，一般實(shí)驗(yàn)室都可操作，本發(fā)明不僅以傳統(tǒng)的外植體愈傷組織為受體材料，同時(shí)還以花藥，未受精子房等外植體的愈傷組織(單倍體)為受體材料，將外源基因轉(zhuǎn)化后加倍即可得到純合的陽(yáng)性植株，與常規(guī)的雜交育種方法相比，該方法大大節(jié)省了人力物力以及時(shí)間成本。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解說(shuō)。
[0015]本發(fā)明提出的一種以CRI SPR/Cas9基因編輯技術(shù)打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，包括以下步驟:
[0016]S1、利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)分別將香味基因各個(gè)外顯子及內(nèi)含子處能被Cas9識(shí)別的序列打靶，然后對(duì)基因組DNA序列切割后引發(fā)DNA修復(fù)，從而產(chǎn)生缺失突變，獲得功能缺失的Badh2基因；
[0017]S2、將粳稻、秈稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，用成熟胚、幼穗和子房等為外植體誘導(dǎo)獲得二倍體愈傷組織，用花藥、花粉和未受精子房等為外植體誘導(dǎo)獲得單倍體愈傷組織，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將打靶載體導(dǎo)入愈傷組織細(xì)胞；
[0018]S3、將打靶載體導(dǎo)入二倍體愈傷組織細(xì)胞，篩選、鑒定陽(yáng)性植株，從Tl群體分離得到香稻品系；將打靶載體導(dǎo)入到單倍體愈傷組織的細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性愈傷，用秋水仙素加倍，分化成苗，鑒定遺傳轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株，最終得到香稻品系。
[0019]本發(fā)明中，所述基因編輯的靶序列應(yīng)設(shè)在起始密碼子附近或其下游的外顯子中，靶序列一般由19個(gè)堿基構(gòu)成，靶序列前面必須是堿基G作為識(shí)別起始信號(hào)，而靶序列后面的PAM序列必須是NGG，且靶點(diǎn)序列必須具有唯一性;將所述構(gòu)建好的載體質(zhì)粒DNA利用農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌，并抽質(zhì)粒驗(yàn)證表達(dá)載體的目的片段。
[0020]本發(fā)明中，所述粳稻、秈稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，獲得香味水稻植株，以下以鄂早17為例:
[0021](I)以鄂早17成熟胚，幼穗和子房等外植體的愈傷組織(二倍體)為受體，將打靶載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入到二倍體受體細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)篩選后再分化成苗，從Tl群體中篩選出純合的帶香味的植株。
[0022](2)以鄂早17為材料進(jìn)行花藥，花粉和未受精子房等外植體愈傷組織(單倍體)為受體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將香味基因Badh2打靶載體導(dǎo)入到單倍體愈傷組織中，用潮霉素篩選后，利用秋水仙素加倍處理，再分化成植株，這樣得到帶有香味的純合二倍體植株。
[0023]遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)又稱為轉(zhuǎn)基因技術(shù)，是20世紀(jì)70年代從分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新技術(shù)，它是應(yīng)用DNA重組技術(shù)，綜合采用了物理，化學(xué)以及生物學(xué)技術(shù)有目的的將外源基因或DNA片段導(dǎo)入到受體植物的細(xì)胞中。目前，應(yīng)用比較廣泛的主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)上有廣泛的應(yīng)用，該方法在導(dǎo)入外源DNA片段時(shí)在結(jié)構(gòu)上是完整的，轉(zhuǎn)化效率較高，技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單。而基因槍法轉(zhuǎn)化成本較高，如果外源片段DNA較大時(shí)則很難通過(guò)該方法轉(zhuǎn)移，所以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前植物遺傳轉(zhuǎn)化的首選，作為水稻遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，傳統(tǒng)方法都是以成熟胚，子房和幼穗外植體的二倍體愈傷組織為受體材料，雖然轉(zhuǎn)化效率較高，但后代需要自交才能分離出陽(yáng)性植株，時(shí)間成本尚O
[0024]本發(fā)明中利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得Badh2基因，與TALEN和ZFN技術(shù)相比，操作過(guò)程簡(jiǎn)單方便，節(jié)約成本，一般實(shí)驗(yàn)室都可操作，而且用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將香味基因Badh2打靶載體分別導(dǎo)入到二倍體和單倍體細(xì)胞組織中，與常規(guī)的雜交育種相比，大大節(jié)約了時(shí)間成本，是一種新的獲得香稻品系的分子育種方法。
[0025]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，其特征在于，包括以下步驟: SI，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)分別將香味基因各個(gè)外顯子及內(nèi)含子處能被Cas9識(shí)別的序列打靶，然后對(duì)基因組DNA序列切割后引發(fā)DNA修復(fù)，從而產(chǎn)生缺失突變，獲得功能缺失的Badh2基因； S2，將粳稻、秈稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料:用成熟胚、幼穗和子房等為外植體誘導(dǎo)獲得二倍體愈傷組織，用花藥、花粉和未受精子房等為外植體誘導(dǎo)獲得單倍體愈傷組織，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將打靶載體導(dǎo)入愈傷組織細(xì)胞； S3，將打靶載體導(dǎo)入到二倍體愈傷組織的細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性愈傷，分化成苗，鑒定遺傳轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株，從Tl群體分離得到香稻品系;將打靶載體導(dǎo)入到單倍體愈傷組織的細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性愈傷，用秋水仙素加倍，分化成苗，鑒定遺傳轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株，最終得到香稻品系。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，其特征在于，所述基因敲除靶序列應(yīng)設(shè)在起始密碼子附近或其下游的外顯子區(qū)域，靶序列一般由19個(gè)堿基構(gòu)成，靶序列前面必須是堿基G作為轉(zhuǎn)錄的起始信號(hào)，而靶序列后面的PAM序列必須是NGG，且靶序列必須具有唯一性。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，其特征在于，將所述構(gòu)建好的載體質(zhì)粒DNA利用農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌，并抽質(zhì)粒驗(yàn)證表達(dá)載體的目的片段。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，其特征在于，所述粳稻、秈稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，獲得香味水稻植株。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)打靶Badh2基因獲得香稻品系的方法，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)分別將香味基因各個(gè)外顯子及內(nèi)含子處能被Cas9識(shí)別的序列打靶，然后對(duì)基因組DNA序列切割后引發(fā)DNA修復(fù)，從而產(chǎn)生缺失突變，獲得功能缺失的Badh2基因。將秈稻、粳稻和糯稻的愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料：用成熟胚、幼穗和子房等為外植體誘導(dǎo)獲得二倍體愈傷組織，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將打靶載體導(dǎo)入愈傷組織細(xì)胞，篩選、鑒定陽(yáng)性植株，從T1群體分離得到香稻品系；用花藥、花粉和未受精子房等為外植體誘導(dǎo)獲得單倍體愈傷組織，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將打靶載體導(dǎo)入到愈傷組織的細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性愈傷，用秋水仙素加倍，分化成苗，鑒定遺傳轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株，最終得到香稻品系。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/82
【公開(kāi)號(hào)】CN105505979
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510856814
【發(fā)明人】居超明, 鄧燕, 徐國(guó)成, 吳文華
【申請(qǐng)人】湖北大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月28日