粗甘油與木質(zhì)纖維素水解液共轉(zhuǎn)化生產(chǎn)微生物油脂的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于產(chǎn)油微生物的培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種粗甘油與木質(zhì)纖維素水解 液共轉(zhuǎn)化生產(chǎn)微生物油脂的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然界中某些微生物在特定條件下，能夠W碳水化合物、碳氨化合物、二氧化碳等 為碳源，在體內(nèi)合成并膽存大量油脂，凡是可W在胞內(nèi)積累油脂并超過(guò)細(xì)胞干重20%(w/w， 運(yùn)里w/w表示質(zhì)量比，下同）的微生物稱為產(chǎn)油微生物。某些產(chǎn)油微生物胞內(nèi)積累的油脂甚 至超過(guò)其細(xì)胞干重的70%。微生物油脂，尤其是產(chǎn)油真菌產(chǎn)生的油脂，其主要成份是甘油Ξ 醋，脂肪酸組成與商品化的動(dòng)植物油脂相似，WC14-C22長(zhǎng)鏈脂肪酸為主。相對(duì)于動(dòng)植物油 月旨，微生物油脂生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)與氣候限制，原料來(lái)源廣，基本不占用額外耕地資源， 易于實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)，是極具潛力的新型油脂資源。微生物油脂不僅可W作為食用油或其他 功能性油脂的替代品，還可W為生物柴油產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供原料。
[0003] 培養(yǎng)基中缺乏產(chǎn)油微生物生長(zhǎng)繁殖的必要成分或培養(yǎng)條件時(shí)，比如培養(yǎng)基中缺乏 氮、憐、硫、鐵、鋒和溶氧等時(shí)，產(chǎn)油微生物生長(zhǎng)繁殖被限制，會(huì)誘導(dǎo)油脂積累。通過(guò)氮限制實(shí) 現(xiàn)產(chǎn)油微生物油脂積累是最常用的策略。油脂發(fā)酵過(guò)程中，隨著氮源被耗盡，產(chǎn)油酵母生長(zhǎng) 受到抑制，碳水化合物主要導(dǎo)向油脂積累。然而，由于微生物油脂是胞內(nèi)產(chǎn)物，合成大量的 油脂，需要足夠量的菌體。因此，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)極其豐富時(shí)，碳水化合物不會(huì)導(dǎo)向油脂合成，當(dāng)營(yíng)養(yǎng) 過(guò)度匿乏，菌體數(shù)量受到限制，均不利于油脂的大量生產(chǎn)。
[0004] 2014年全球生物柴油生產(chǎn)量達(dá)到3000萬(wàn)噸，其生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物粗甘油超過(guò) 300萬(wàn)噸，已經(jīng)超過(guò)了市場(chǎng)的需求。雖然甘油是很多精細(xì)化工中必不可少的平臺(tái)化合物，但 粗甘油中存在著大量的酸、堿、無(wú)機(jī)鹽、甲醇、有機(jī)酸、甚至一些重金屬，不能夠被直接應(yīng)用 于化學(xué)工業(yè)，而且純化成本非常高。在一些國(guó)家和地區(qū)，粗甘油甚至被當(dāng)做廢水直接處理 掉，不僅造成了資源的浪費(fèi)，也引發(fā)了環(huán)境的污染。近年來(lái)，將生物柴油產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物粗甘 油轉(zhuǎn)化為微生物油脂，作為生物柴油的原料，成為了研究熱點(diǎn)。然而，由于粗甘油中氮源極 度匿乏，導(dǎo)致菌體幾乎不增殖，過(guò)少的菌體也不利于油脂的大量生產(chǎn)。目前主要通過(guò)添加適 量的氮源營(yíng)養(yǎng)，如酵母粉、蛋白腺、玉米漿W及其它富氮組分等，使產(chǎn)油微生物適量增殖，從 而大量合成油脂。
[0005] 木質(zhì)纖維素材料來(lái)源廣泛、是自然界中最豐富的可再生資源之一，全球年產(chǎn)高達(dá) 1500億噸，其化學(xué)成份主要是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。纖維素完全水解主要產(chǎn)物為葡萄 糖;半纖維素水解可得到木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等的混合物。利用木質(zhì)纖 維素水解液培養(yǎng)產(chǎn)油微生物，有可能大幅度降低原料成本，并使規(guī)?；苽湮⑸镉椭?原材料得到保障。然而，木質(zhì)纖維素原料通常氮含量高，另外其降解過(guò)程中添加水解酶，也 會(huì)引入一定量的氮源，導(dǎo)致水解液中C/^比很低，產(chǎn)油微生物W菌體增殖為主，油脂產(chǎn)量和 油脂得率非常低，當(dāng)前利用木質(zhì)纖維素水解液培養(yǎng)產(chǎn)油微生物存在油脂產(chǎn)量低的突出問(wèn) 題。
[0006] 因此目前產(chǎn)油微生物方法中，在粗甘油中添加氮源營(yíng)養(yǎng)額外增加了成本;而木質(zhì) 纖維素水解液的脫氮除憐則不僅增加了工藝流程，還會(huì)造成碳水化合物的損失。W上兩種 原料各自用于微生物油脂生產(chǎn)時(shí)，所需成本均較高。為了充分利用粗甘油和木質(zhì)纖維素資 源，需要找到一種更簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的方法，顯著提高油脂產(chǎn)量和得率，提高微生物油脂的技術(shù) 經(jīng)濟(jì)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種粗甘油與木質(zhì)纖維素水解液共轉(zhuǎn)化生 產(chǎn)微生物油脂的方法，旨在解決現(xiàn)有方法成本過(guò)高的技術(shù)問(wèn)題。
[0008] 在培養(yǎng)基中，過(guò)高或者過(guò)低的C/^比均不利于產(chǎn)油微生物積累油脂。粗甘油中由于 氮源極度匿乏導(dǎo)致C/^比過(guò)高，而木質(zhì)纖維素水解液中氮源豐富導(dǎo)致C/^比過(guò)低，兩者分別 作為原料獨(dú)立培養(yǎng)產(chǎn)油微生物時(shí)，油脂產(chǎn)量均很低，本發(fā)明提出一種粗甘油與木質(zhì)纖維素 水解液共轉(zhuǎn)化生產(chǎn)微生物油脂的方法，具體包括如下步驟：
[0009] 預(yù)處理木質(zhì)纖維素，按照2%-20%(w/w)的固液比，并添加適量的木質(zhì)纖維素降解 酶進(jìn)行降解反應(yīng)，得到木質(zhì)纖維素水解液，所述水解液中包含有由木質(zhì)纖維素降解得的可 發(fā)酵性生物質(zhì)糖；
[0010] 將粗甘油與所述木質(zhì)纖維素水解液按比例混合，得到產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基，將產(chǎn)油 微生物培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為4.0-9.0，然后滅菌備用;其中所述粗甘油所含碳源占總碳源質(zhì) 量的20%-90%，所述生物質(zhì)糖所含碳源占總碳源質(zhì)量的10%-80%，控制C/N比為35-400;
[0011] 取產(chǎn)油微生物并在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到產(chǎn)油微生物種子液；
[0012] 將所述產(chǎn)油微生物種子液接種至所述產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基中，接種量為2%-20% (v/v，體積比，下同，即種子液體積占產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基體積的2%-20%)，于20°C-37°C通 氣培養(yǎng)，直至發(fā)酵液中殘余甘油和糖的濃度低于5g/L，終止發(fā)酵，固液分離收集產(chǎn)油微生物 菌體。
[0013] 必要時(shí)，還可W在產(chǎn)油微生物培養(yǎng)添加一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，比如占產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基 總質(zhì)量0.01 %-2%的氮源、占產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基總質(zhì)量0.01 %-2%的憐源、占產(chǎn)油微生物 培養(yǎng)基總質(zhì)量0.01 %-1 %的硫源、占產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基總質(zhì)量0.001 % W內(nèi)的維生素，任取 其一或者它們之間的任意組合。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是：由于粗甘油中氮源極度匿乏，C/N比過(guò)高，木質(zhì)纖維素水解 液中氮源豐富，C/N比過(guò)低，兩者分別作為原料培養(yǎng)產(chǎn)油微生物時(shí)，油脂產(chǎn)量均很低。本發(fā)明 提供了一種培養(yǎng)產(chǎn)油微生物的新的方法，將粗甘油和木質(zhì)纖維素水解液混合，使碳源中粗 甘油中的碳源占碳源總量的20%-90 %，木質(zhì)纖維素中的碳源占碳源總量的10%-80%，合 理調(diào)整C/^比至35-400,使得甘油和碳水化合物均徹底轉(zhuǎn)化且主要導(dǎo)向油脂合成，從而實(shí)現(xiàn) 油脂的大量的積累；方法極其簡(jiǎn)單，顯著提高了原料的轉(zhuǎn)化率和微生物油脂生產(chǎn)的技術(shù)經(jīng) 濟(jì)性，具有廣闊應(yīng)用前景;該方法獲得的產(chǎn)油微生物具體含有一種或多種脂肪酸及其衍生 物，可用于制備生物柴油或其他高附加值產(chǎn)品；與粗甘油和木質(zhì)纖維素水解液分別作為原 料制備微生物油脂技術(shù)相比，本發(fā)明同時(shí)轉(zhuǎn)化利用粗甘油和木質(zhì)纖維素制備微生物油脂， 可節(jié)約設(shè)備及占地成本，具有非常好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行 進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限定 本發(fā)明。
[0016] 本發(fā)明通過(guò)將粗甘油和木質(zhì)纖維素混合調(diào)配，使混合物的C/^比適中，運(yùn)樣原料中 的甘油和碳水化合物均可徹底利用且主要導(dǎo)向油脂合成，從而實(shí)現(xiàn)油脂的大量的積累。方 法極其簡(jiǎn)單，從而避免了兩者各自作為原料油脂發(fā)酵過(guò)程中粗甘油中額外添加氮源營(yíng)養(yǎng)， W及木質(zhì)纖維素水解液的脫氮和/或除憐，大大降低了原料成本和過(guò)程操作成本，具有明顯 的綜合技術(shù)優(yōu)勢(shì)。
[0017] 本發(fā)明方法具體包括如下步驟：
[0018] 步驟S101、預(yù)處理木質(zhì)纖維素，按照2%-20%(w/w)的固液比，并添加適量的木質(zhì) 纖維素降解酶進(jìn)行降解反應(yīng)，得到木質(zhì)纖維素水解液，所述水解液中包含有由木質(zhì)纖維素 降解得的可發(fā)酵性生物質(zhì)糖。
[0019] 本步驟采用常用的物理、化學(xué)、物理化學(xué)或生物的方法預(yù)處理木質(zhì)纖維素，按照 2%-20%(w/w)的固液比，添加適量的木質(zhì)纖維素降解酶，將預(yù)處理的木質(zhì)纖維素中的纖維 素和半纖維素降解成可發(fā)酵性生物質(zhì)糖，包括但不限于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘 露糖、纖維寡糖、木寡糖、半乳糖醒酸等。
[0020] 本發(fā)明所適用的木質(zhì)纖維素為主要成份為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的生物質(zhì)材 料。包括玉米賴桿、玉米忍、稻草、稻殼和麥桿等農(nóng)業(yè)生物質(zhì)，樹(shù)木、枝權(quán)和銀末等林業(yè)生物 質(zhì)，甘薦渣、甜菜渣和甜高梁渣等工業(yè)生物質(zhì)，水葫蘆和碑子等雜草，柳枝稷和芒草等能源 植物中的一種或二種W上組合。所述木質(zhì)纖維素降解酶為具有降低碳水化合物聚合物的聚 合度的酶，包括纖維素酶、β-葡萄糖巧酶、木聚糖酶、β-木糖巧酶、果膠酶等的一種或它們的 組合。
[0021] 步驟S102、將粗甘油與所述木質(zhì)纖維素水解液按比例混合，得到產(chǎn)油微生物培養(yǎng) 基，將產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基的抑值調(diào)整為4.0-9.0,然后滅菌備用；其中所述粗甘油所含碳源 占總碳源質(zhì)量的20 %-90 %，所述生物質(zhì)糖所含碳源占總碳源質(zhì)量的10%-80%，控制C/^比 為35-400。
[0022] 本步驟將粗甘油與所述木質(zhì)纖維素水解液按比例混合，制備產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基。 所述粗甘油為各種動(dòng)植物油脂(如動(dòng)物油、屠宰場(chǎng)含油下腳料、大豆油、玉米油、藍(lán)麻油、菜 巧油、棟桐油等），地溝油和微生物油脂等與短鏈醇經(jīng)醋化或轉(zhuǎn)醋化工藝制備生物柴油過(guò)程 的副產(chǎn)物，主要成分為甘油水溶液，還含有一定量的酸、堿、甲醇和無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)。在產(chǎn)油微 生物培養(yǎng)基中不添加或添加少量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括氮源、憐源、硫源和維生素，如酵母粉、蛋白 腺、錠鹽、硫酸鹽、憐酸鹽、硫胺素等或它們的組合，其中氮源占產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基總質(zhì)量的 0.01 %-2%、憐源占產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基總質(zhì)量的0.01 %-2%、硫源占產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基總 質(zhì)量的〇.〇1%-1%、維生素占產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基總質(zhì)量的0.001%?內(nèi)。
[0023] 在選擇粗甘油與所述木質(zhì)纖維素水解液的混配比例時(shí)，粗甘油所含碳源占總碳源 質(zhì)量的20%-90 %，所述生物質(zhì)糖所含碳源占總碳源質(zhì)量的10%-80%，使得混合液中C/^比 為35-400,運(yùn)樣甘油和碳水化合物均徹底利用且主要導(dǎo)向油脂合成，從而實(shí)現(xiàn)油脂的大量 積累。
[0024] 然后調(diào)整產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基pH為4.0-9.0之間，然后滅菌備用。
[0025] 步驟S103、取產(chǎn)油微生物并在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到產(chǎn)油微生物種子液。
[00%]所述產(chǎn)油微生物為經(jīng)發(fā)酵后菌體油脂含量可超過(guò)細(xì)胞干重20 %的真核微生物，它 們包括但不限于下列之一：油脂酵母(如斯達(dá)油脂酵母Lipomyces starkeyi)、紅酵母(如圓 紅冬抱酵母加〇(1〇39〇1'1(1；[加11：01'11101(163、粘紅酵母加0(101：01'1113肖1111：；[]113和擲抱酵母 Sporobolo