基于微生物發(fā)酵的n-乙酰-d-氨基葡萄糖的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)醫(yī)藥加工工藝技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種基于微生物發(fā)酵的N-乙酷-D-氨 基葡萄糖的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] N-乙酷-D-氨基葡萄糖，英文名稱N-Acetylglucosamine，分子結(jié)構(gòu)式為：
[0003]
[0004] 化學(xué)名稱:2-(乙酷氨基)-2-脫氧-D-葡萄糖。
[000引 N-乙酷-D-氨基葡萄糖是一種較高甜度的還原性單糖，在生物體內(nèi)具有許多重要 的生理功能，臨床上是治療風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物，亦作為食品抗氧化劑、嬰幼兒 食品添加劑和糖尿病患者的甜味劑W及用于化妝品，在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和精細(xì)化工領(lǐng)域有 極其重要的意義。
[0006] 目前生產(chǎn)N-乙酷-D-氨基葡萄糖主要有兩種工藝，一種工藝是郵蟹殼經(jīng)酸脫巧，堿 脫脂和蛋白質(zhì)而加工成甲殼素，再由甲殼素經(jīng)鹽酸酸解成D-氨基葡萄糖鹽酸鹽，然后再由 D-氨基葡萄糖鹽酸鹽加醋酢乙酷化反應(yīng)而制得，但是工藝中有易制毒化學(xué)品醋酢，有毒品 擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，甲殼素的原料是郵蟹殼，其供應(yīng)易受季節(jié)變化而受到影響。另一種工藝是甲殼 素通過甲殼素酶的作用制得N-乙酷-D-氨基葡萄糖，但甲殼素酶價(jià)格昂貴，使得生產(chǎn)成本太 高而難W實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，且現(xiàn)有工藝在純化過程中濃縮時(shí)溫度較高，容易使產(chǎn)品部分氧化變 性而使產(chǎn)品得率降低和含量下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷，提供一種基于微生物發(fā)酵的N-乙 酷-D-氨基葡萄糖的制備方法，利用可再生資源，能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，降低了生產(chǎn)成 本，在除蛋白工序中，加入殼聚糖進(jìn)行絮凝，使得在發(fā)酵工藝中難W去除的小分子蛋白質(zhì)及 氨基酸得到了有效的去除，在濃縮時(shí)通過加入酒精降低了溶液的沸點(diǎn)，從而最大限度地保 護(hù)產(chǎn)品不被氧化變性。
[000引為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基于微生物發(fā)酵的N-乙酷-D-氨基葡萄糖的 制備方法，包括：
[0009] 將保藏工程菌種的甘油管置于常溫下融化形成混合液;所述工程菌種為產(chǎn)N-乙 酷-D-氨基葡萄糖代謝短桿菌；
[0010] 用接種環(huán)薩取所述混合液涂布于含有鏈霉素和安普霉素的平板或斜面，37°C培養(yǎng) 18~24小時(shí)，完成菌種活化；
[0011]挑取活化后得到的工程菌單菌落于裝液量lOml LB的Ξ角瓶中，37°C振蕩培養(yǎng)8小 時(shí)，得到一級(jí)種子;所述Ξ角瓶為50ml或者100ml，所述Ξ角瓶中還包括鏈霉素50mg/L和安 普霉素50mg/l;
[001引將101111-級(jí)種子接種于裝液量1L二級(jí)種子培養(yǎng)基的化搖瓶中，34°C振蕩培養(yǎng)16~ 20小時(shí)，00600 = 2~4,并4~5瓶，接入3000L種子罐中，得到二級(jí)種子;所述二級(jí)種子培養(yǎng)基 包括：含量為14g/L的K此P04,0.02g/L的CaCl2,21g/L的K此P04 · 3出0，lg/L的巧樣酸鋼· 2此0，7.5g/L的硫酸錠，0.25g/L的MgS04 · 7此0，20g/L的葡萄糖和0.1 ml/L的1000倍微量元 素母液;所述搖瓶中還包括50mg/L的鏈霉素和50mg/L的安普霉素；
[0013] 在種子罐中加入鏈霉素50mg/L，攬拌;其中，攬拌轉(zhuǎn)速為22化pm，通風(fēng)比1:0.8;
[0014] 在3000化發(fā)酵罐中將發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，并加入滅菌后的葡萄糖，截止后體積 為21000升，加氨水調(diào)抑至6.9，再將所述二級(jí)種子接種于所述3000化發(fā)酵罐中發(fā)酵；
[001引 37°C，攬拌速度0~150轉(zhuǎn)/分鐘，溶氧保持在20 % W上，用氨水控制抑在6.9，通風(fēng) 比 1:0.5，罐壓：0.051口曰；
[0016] 當(dāng)葡萄糖耗完后，W2g/L.h的速度補(bǔ)加葡萄糖，保持比生長(zhǎng)速率為0.3~0.6;
[0017] 檢測(cè)0D600，當(dāng)00600 = 10± 1，W6.5g/L.h的速度補(bǔ)加650g/L的葡萄糖母液；
[0018] 當(dāng)0D600 = 25±1時(shí)，加入誘導(dǎo)劑開始誘導(dǎo)；所述誘導(dǎo)劑為異丙基硫代半乳糖巧 IPTG，終濃度為0.2mM;
[0019] 37°C培養(yǎng)，其中，葡萄糖濃度保持在5g/L~lOg/l;
[0020] 監(jiān)測(cè)發(fā)酵罐溶氧，待溶氧開始下降后，減慢補(bǔ)加葡萄糖的速度，使葡萄糖濃度至 5g/LW下，直至溶氧為0;
[0021] 待溶氧回升至30%~50%，控制添加葡萄糖速度W使發(fā)酵液中葡萄糖濃度保持在 3g/L~5g/L;
[0022] 每隔4小時(shí)取樣一次，檢測(cè)N-乙酷-D-氨基葡萄糖的含量，至含量增加量為小于 0.5 %時(shí)，停止發(fā)酵，得到所述N-乙酷-D-氨基葡萄糖的發(fā)酵液；
[0023] 將所述發(fā)酵液進(jìn)行經(jīng)65°C1小時(shí)滅菌，經(jīng)陶瓷膜或板框過濾去除菌體，并水洗濾出 的菌體濃縮液，至所述菌體濃縮液中N-乙酷-D-氨基葡萄糖含量低于2%;
[0024] 加入1 %的305活性炭室溫?cái)埌?0~60分鐘脫色后過濾；
[0025] 加入0.3%~2%的無(wú)機(jī)酸和/或有機(jī)酸至濾液中，攬拌均勻；
[0026] 向攬拌均勻的濾液中加入殼聚糖或殼聚糖的溶液，使加入后料液中的殼聚糖所占 比例為0.2%~2%;
[0027] 再向料液中加入5%~30%無(wú)機(jī)堿液和/或有機(jī)堿，將料液的pH調(diào)至7.8~8.2，使 殼聚糖完全絮凝析出，靜置0.5~2小時(shí)；
[0028] 經(jīng)抽濾或離屯、，將濾液抽入膽存罐中；
[0029] 濾液經(jīng)離子交換混床后，在濾液中加入5%~30%的無(wú)水酒精，攬拌均勻，經(jīng)50°C ~60°C減壓濃縮至有晶體析出時(shí)，靜置12小時(shí)；
[0030] 將析出的結(jié)晶物料移入過濾槽進(jìn)行抽濾或移入離屯、機(jī)進(jìn)行離屯、，得白色固體物 料；
[0031] 將白色固體物料移入漂洗槽中，加入濃度在95% W上的酒精進(jìn)行漂洗，然后再進(jìn) 行離屯、；
[0032] 將再次離屯、后的物料移入真空干燥箱中，60°C~70°C真空干燥，得白色結(jié)晶粉末， 即為制備得到的N-乙酷-D-氨基葡萄糖。
[0033] 優(yōu)選的，在所述將保藏工程菌種的甘油管置于常溫下融化形成混合液之前還包 括：
[0034] 挑取抗性平板上生長(zhǎng)的工程菌單菌落，加入抗性LB培養(yǎng)基中形成菌液，于37°C培 養(yǎng)8~12小時(shí)；
[0035] 向培養(yǎng)好的菌液中加入1/2體積的50%滅菌甘油混勻，分裝至無(wú)菌的保菌管里，每 管1ml，置于-80°C保藏;其中，加入后的甘油終濃度為16.7%。
[0036] 優(yōu)選的，在所述將保藏工程菌種的甘油管置于常溫下融化形成混合液之前還包 括:挑取抗性平板上生長(zhǎng)的工程菌單菌落，加入抗性LB培養(yǎng)基中形成菌液，于37°C培養(yǎng)8~ 12小時(shí)；
[0037] 向培養(yǎng)好的菌液中加入1/2體積的50%滅菌甘油混勻，分裝至無(wú)菌的保菌管里，每 管1ml，置于-20°C保藏，并每半年至少活化一次;其中，加入后的甘油終濃度為16.7%。
[0038] 優(yōu)選的，所述工程菌單菌落為產(chǎn)N-乙酷-D-氨基葡萄糖代謝短桿菌；
[0039] 所述加入抗性LB培養(yǎng)基中形成菌液的培養(yǎng)時(shí)間為9~10小時(shí)。
[0040] 優(yōu)選的，所述濾液經(jīng)離子交換混床后，在濾液中加入無(wú)水酒精，加入的量所占總比 例為10%~25%。
[0041 ]優(yōu)選的，所述34°C振蕩培養(yǎng)的時(shí)間為16~19小時(shí)。
[0042] 優(yōu)選的，在所述將發(fā)酵培養(yǎng)基移入3000化發(fā)酵罐中進(jìn)行滅菌之前，所述方法還包 括：
[0043] 按照初始體積21000升的量加入含量為6.67旨/1的1(出?〇4,3.55旨/1的一水巧樣酸， 0.025g/L的CaCl2 ·此0,0.25g/L的消泡劑，2.5g/L的MgS〇4 · 7此0,5g/L的葡萄糖和Iml/L的 1000倍微量元素，配制發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0044] 優(yōu)選的，所述將所述二級(jí)種子接種于所述發(fā)酵罐中，37°C進(jìn)行攬拌的攬拌速度具 體為10~100轉(zhuǎn)/分鐘。
[0045] 優(yōu)選的，所述無(wú)機(jī)酸包括:鹽酸、硝酸、憐酸或硫酸中的任意一種或多種的組合;所 述有機(jī)酸包括：甲酸、乙酸、丙酸、下酸、乳酸、馬來(lái)酸、巧樣酸、酒石酸或班巧酸中的任意一 種或多種的組合。
[0046] 優(yōu)選的，所述無(wú)機(jī)堿液包括:氨氧化鋼溶液、氨氧化鐘溶液、碳酸鋼溶液、碳酸鐘溶 液、碳酸氨鋼溶液、碳酸氨鐘溶液或氨水中的任意一種或多種的組合;所述有機(jī)堿包括：乙 醇鋼、甲胺、乙胺、乙醇胺、乙二胺、二甲胺、Ξ甲胺、Ξ乙胺、丙胺、異丙胺、Ξ乙醇胺、1,3-丙 二胺、1,2-丙二胺或Ξ丙胺中的任意一種或多種的組合。
[0047] 本發(fā)明實(shí)施例提供的基于微生物發(fā)酵的N-乙酷-D-氨基葡萄糖的制備方法，先將 經(jīng)過特殊保存的工程菌種進(jìn)行兩級(jí)培養(yǎng)，然后將發(fā)酵培養(yǎng)基移入發(fā)酵罐中，同時(shí)加入滅菌 后的葡萄糖，再將二級(jí)培養(yǎng)的種子接種于發(fā)酵罐中，嚴(yán)格控制發(fā)酵參數(shù)直至發(fā)酵充分，然后 將過濾后的發(fā)酵液進(jìn)行脫色、加殼聚糖絮凝除蛋白、過濾和加酒精濃縮結(jié)晶，最后洗涂、烘 干得到N-乙酷-D-氨基葡萄糖。生產(chǎn)利用了可再生資源，價(jià)格便宜，也不受季節(jié)性因素的影 響，采用無(wú)毒的天然高分子材料殼聚糖作絮凝劑，不僅可有效去除小分子蛋白質(zhì)和氨基酸， 還可W吸附和馨合重金屬，有效提高了產(chǎn)品的含量，降低了產(chǎn)品中的雜質(zhì)。濃縮結(jié)晶中加入 一定量的酒精，降低了待濃縮液體的沸點(diǎn)，從而降低了結(jié)晶時(shí)的溫度，使N-乙酷-D-氨基葡 萄糖與氧氣的接觸減少，進(jìn)而最大限度地保護(hù)了 N-乙酷-D-氨基葡萄糖不被氧化變色，降低 了產(chǎn)品產(chǎn)生其他雜質(zhì)的概率。
【附圖說明】
[0048] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的基于微生物發(fā)酵的N-乙酷-D-氨基葡萄糖的制備方法 流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面通過附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述