作為生物標(biāo)記物的miRNA-124的制作方法
【專利說明】作為生物標(biāo)巧物的m i RNA-124
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及特別是與病毒感染結(jié)合的生物標(biāo)記物領(lǐng)域。
[0002] 更具體而言，本發(fā)明設(shè)及用作病毒感染的診斷標(biāo)記物的新型生物標(biāo)記物。更具體 而言考慮的病毒感染是需要RNA剪接的病毒感染，且特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染例如HIV和AID 相關(guān)狀況。本發(fā)明還設(shè)及關(guān)于所述感染且特別是HIV和AIDS相關(guān)狀況的治療的隨訪標(biāo)記物。
[0003] 在高等真核生物中，信使RNA不W其功能形式直接轉(zhuǎn)錄，而是作為前信使RNA轉(zhuǎn)錄， 所述前信使RNA必須經(jīng)歷許多加工事件，W便可由細(xì)胞翻譯機制閱讀。剪接是允許消除不需 要的序列（內(nèi)含子），并連接有意義的序列（外顯子）的過程。高度協(xié)調(diào)的剪接事件在稱為剪 接體的大復(fù)合物中發(fā)生。該功能大復(fù)合物(megacomplex)是蛋白質(zhì)和RNA的精屯、裝配，其需 要鑒定外顯子-內(nèi)含子邊界。外顯子規(guī)律地可變剪接，意指它們或包括在最終成熟mRNA轉(zhuǎn)錄 物中或從最終成熟mRNA轉(zhuǎn)錄物中排除。近期的廣泛測序研究觀察到:超過90%的基因經(jīng)歷 可變剪接?？勺兗艚拥膍RNA的產(chǎn)生被反式作用蛋白質(zhì)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，所述反式作用蛋白質(zhì)與前 mRNA自身上的順式作用位點結(jié)合。此類蛋白質(zhì)包括促進(jìn)特定剪接位點的使用的剪接激活 物，和降低特定位點的使用的剪接阻遏物，分別結(jié)合在剪接增強子位點上（內(nèi)含子剪接增強 子，ISE和外顯子剪接增強子，ESE)和剪接沉默子位點上（內(nèi)含子剪接沉默子，ISS和外顯子 剪接沉默子，ISS )。
[0004] 特別是來自逆轉(zhuǎn)錄病毒科的病毒是全世界疾病的主因之一。可W在逆轉(zhuǎn)錄病毒科 中區(qū)分出=個亞科:腫瘤病毒、慢病毒和泡沫病毒。
[0005] 因為腫瘤病毒可W與癌癥和惡性感染相關(guān)，所W它們被運樣命名。可W提及例如 致白血病病毒（例如禽白血病病毒(ALV)、鼠白血病病毒(MULV)也稱為莫洛尼病毒、貓白血 病病毒(FELV)、人白血病病毒例如HTLV巧肌TLV2、猿猴白血病病毒或STLV、牛白血病病毒或 BLV、靈長類動物D型腫瘤病毒、其為乳腺腫瘤的誘導(dǎo)劑的B型腫瘤病毒、或引起快速癌癥的 腫瘤病毒(例如勞斯肉瘤病毒或RSV)。
[0006] 泡沫病毒對于給定細(xì)胞類型或給定物種表現(xiàn)相當(dāng)?shù)偷奶禺愋裕⑶宜鼈冇袝r與免 疫抑制現(xiàn)象相關(guān);運是例如對于猿猴泡沫病毒(或SFV)的情況。
[0007] 因為慢病毒例如HIV負(fù)責(zé)緩慢進(jìn)展的病理狀況，所W它們被運樣命名，所述病理狀 況非常頻繁地設(shè)及免疫抑制現(xiàn)象，包括AIDS。
[000引已知病毒且特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒例如HIV依賴RNA剪接和剪接調(diào)節(jié)，W便在受感染個 體的細(xì)胞和組織內(nèi)傳播和散布。
[0009]近來，已利用HIV是需要RNA剪接W表達(dá)關(guān)鍵病毒蛋白質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒的運一事實 來開發(fā)基于剪接抑制的新型策略，W對抗病毒感染且特別是AIDS(W0 2010/143169)。事實 上，HIV-I基因組表達(dá)9化的初級轉(zhuǎn)錄物，其不僅充當(dāng)子代病毒的基因組RNA，還生成40種不 同的hiRNAdHIV-I使用四個多重可變5'剪接位點和八個多重可變3'剪接位點，W生成剪接的 mRNA種類。運些剪接的mRNA可W分成兩類:多重剪接的（2化)和單一剪接的（地WRNAdHIV-I 可變剪接的調(diào)節(jié)主要由于亞最佳剪接位點的存在而發(fā)生，所述亞最佳剪接位點減少通過剪 接信號的細(xì)胞剪接機制的識別。在病毒剪接位點處的剪接進(jìn)一步通過ESE、ESS和ISS的存在 得到調(diào)節(jié)。
[0010] 在運個背景下，已開發(fā)了哇嘟衍生物，特別是8-氯-N-[4-(S氣甲氧基）苯基]哇 嘟-2-胺，其已顯示在nM濃度范圍下抑制HIV-I和HIV-2T細(xì)胞向性實驗室株的外周血單核細(xì) 胞(PBMC)W及不同亞型的臨床分離物中的復(fù)制(WO 2010/143169)。
[0011] 微小RNA(miRNA)，最廣泛的非編碼組，是一類約22nt非編碼RNA，其通過與祀mRNA 轉(zhuǎn)錄物的非編碼區(qū)化TR)結(jié)合來抑制基因表達(dá)化ai等人，化ture Genetics,第30卷，no.4， 第363-364頁，2002;Badel等人，Cell,第 136卷，no.2,第215-233頁，2009) emiRNA基因代表 約1-2%的已知真核生物基因組。預(yù)測提出每種miRNA可W祀向超過200種轉(zhuǎn)錄物，并且單一 mRNA可W通過多重miRNA得到調(diào)節(jié)（LIND0W，DNA Cell Biol.,第26卷（5)，第339-351 頁， 2007) DiniRNA由內(nèi)源發(fā)夾形轉(zhuǎn)錄物生成且通過與祀mRNA的堿基配對而起作用，運導(dǎo)致mRNA 切割或翻譯阻遏，取決于堿基配對的程度。兩個加工事件導(dǎo)致成熟的miRNA形成:首先，將初 生miRNA轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)加工成70個核巧酸的前體(pre-miRNA)，其從核中輸出且在細(xì) 胞質(zhì)中被切割，W生成短的（長約22個核巧酸）成熟miRNA化邸，EMBO J.，第21卷，第4663-4670頁，2002) DiniRNA可W位于基因間或基因內(nèi)。當(dāng)基因間時，它們的表達(dá)與其他miRNA作為 簇進(jìn)行協(xié)調(diào)(Altuvia等人，Nucleic Acids Research,第33卷，no.8,第2697-2706頁，2005， OzsoIak等人，Genes and Development，第22卷，no . 22,第3172-3183頁，2008)。當(dāng)基因內(nèi) 時，即置于蛋白質(zhì)編碼基因內(nèi)（幾乎唯一地在內(nèi)含子內(nèi)），它們通常從與它們的宿主基因相 同的鏈化 iu 等人，Cell Research,第 18 卷，no. 10,第 985-996 頁，2008 ,Kim 等人，EMBO 化 urnal，第26 卷，no. 3,第775-783 頁，2007)且 W相關(guān)聯(lián)水平(Baskerville等人，RNA，第11 卷，no. 3,第 241-247 頁，2005)表達(dá)。
[0012] miRNA近期已設(shè)及病毒感染中的宿主和病原體的復(fù)雜串?dāng)_，并且被認(rèn)為在病毒發(fā) 病機理中起主要作用(NAIR，Trends in Microbiol.，第14卷，第169-175頁，2006)。事實上， 病毒是使用細(xì)胞機制用于其存活和復(fù)制的專性細(xì)胞內(nèi)寄生物，因此運種依賴性使得它們對 宿主基因調(diào)節(jié)機制敏感。細(xì)胞miRNA可W參與抗病毒防御機制，但在一些情況下，還可W是 病毒正調(diào)節(jié)物。另一方面，病毒自身也可W產(chǎn)生miRNAW調(diào)節(jié)細(xì)胞過程或病毒基因。設(shè)及 HIV-I感染的miRNA可W根據(jù)其生物發(fā)生起源定義為HIV-I編碼的或宿主編碼的；它們還可 W根據(jù)其功能定義為感染的阻遏物或激活物。它們可W進(jìn)一步根據(jù)它們是直接祀向HIV-I 轉(zhuǎn)錄物還是間接影響HIV-I進(jìn)行分類，通過祀向設(shè)及病毒生命周期的宿主因子，或祀向HIV-IRNA基因組和HIV-I感染必需的宿主因子兩者。幾個數(shù)據(jù)證明HIV-I感染由于miRNA生物發(fā) 生干擾而總體影響miRNA途徑，W及通過miRNA表達(dá)概況修飾而個別影響miRNA途徑巧ouzet 等人，Biochim Bio地ys Acta.2011 Nov-Dec; 1809(11-12) :686-693))。此外，宿主miRNA 已描述為調(diào)節(jié)HIV-I。
[0013] 給定藥物或疫苗成功開發(fā)的一個關(guān)鍵因素是有效和快速評價其功效的可能性。事 實上，給定藥物或疫苗在其治療窗內(nèi)進(jìn)行施用是重要的，W便避免不需要的來自太高劑量 的效應(yīng)，或避免由于太低劑量的功效缺乏。另外，必須確保將適當(dāng)藥物或疫苗施用于適當(dāng)患 者，并且該患者事實上響應(yīng)藥物或疫苗。因此，僅僅將給定患者和給定藥物或疫苗聯(lián)系在一 起不一定足W獲得有利的療效。因此關(guān)鍵是有適當(dāng)?shù)墓ぞ?，例如特異性生物?biāo)記物W依靠， 用于評價藥物或疫苗的功效。
[0014] 因此，存在對新型和靈敏的工具的需要，所述工具用于評價病毒感染，并且特別是 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，并且更特別是HIV(人免疫缺陷病毒)感染，W及此類狀況的治療功效。
[0015] 存在對新型生物標(biāo)記物的需要，所述生物標(biāo)記物用于評價對病毒感染，并且特別 是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，并且更特別是HIV感染的治療功效。
[0016] 存在對用于評價哇嘟衍生物功效的新型和靈敏的工具的需要，所述哇嘟衍生物是 病毒特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒例如HIV，并且更特別是HIV-I和HIV-2的抑制劑。
[0017] 存在對用于評價患者對哇嘟衍生物的應(yīng)答性的新型生物標(biāo)記物的需要，所述哇嘟 衍生物用于預(yù)防或治療病毒感染，并且特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，并且更特別是HIV感染。
[0018] 存在對用于評價哇嘟衍生物的治療功效的新型生物標(biāo)記物的需要，所述哇嘟衍生 物用于預(yù)防或治療病毒感染，并且特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，并且更特別是HIV感染。
[0019] 還存在對用于篩選藥物候選物或疫苗的新型生物標(biāo)記物的需要，所述藥物候選物 或疫苗有效預(yù)防和/或治療病毒感染，并且特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，并且更特別是HIV感染。
[0020] 本發(fā)明有意滿足運些需要。
[0021] 根據(jù)其目的之一，本發(fā)明設(shè)及至少一種miRNA作為病毒感染或所述病毒感染的治 療性處理功效的生物標(biāo)記物的用途，所述至少一種miRNA是miR-124。
[0022] 出乎意料的是，如下文實施例中詳述的，本發(fā)明人已觀察到:在由HIV毒株特別是 ADA-M R5 HIV毒株感染的PBMC中，miR-124的表達(dá)水平相對于未受感染的PBMC是減少的。
[0023] 更重要的是，本發(fā)明人已出乎意料地觀察到：用哇嘟衍生物例如式(I)或（II)的哇 嘟衍生物，且特別是8-氯-N-[4-(S氣甲氧基）苯基]哇嘟-2-胺處理外周血單核細(xì)胞 (PBMC)，所述PBMC由HIV毒株特別是ADA-M R5 HIV感染，導(dǎo)致病毒的去除和miR-124表達(dá)的 急劇增加(相對于對照13倍）。哇嘟衍生物可W在WO 2010/143169中所述的化合物中選擇且 如下文進(jìn)一步描述。相應(yīng)地，所述病毒感染的治療性處理可W是用哇嘟衍生物的處理。
[0024] 相應(yīng)地，miR-124自身展現(xiàn)為有力工具，換言之展現(xiàn)為生物標(biāo)記物，用于監(jiān)控患如 下感染的個體內(nèi)的病毒感染，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染例如HIV感染，W及用于監(jiān)控由病毒特 別逆轉(zhuǎn)錄病毒感染例如由HIV感染的個體，并且用于監(jiān)控用抗病毒藥物治療的此類個體，所 述抗病毒藥物特別是如下詳述的式(I)或（II)的哇嘟衍生物，并且特別是8-氯-N-[4-(S氣 甲氧基)苯基]哇嘟-2-胺。
[0025] 因此，通過提供確認(rèn)患者接受適當(dāng)藥物或疫苗治療的工具，即就劑量和時間而言， 通過監(jiān)控miR-124的表達(dá)水平，能夠跟蹤人研究試驗或?qū)θ搜芯繉嶒瀳?zhí)行質(zhì)量控制，或者監(jiān) 控對藥物方案或疫苗的患者順應(yīng)性。miR-124生物標(biāo)記物還可W用于優(yōu)化給藥方案。因此， miR-124生物標(biāo)記物可W與例如患者治療的管理、臨床試驗和基于細(xì)胞的研究結(jié)合使用。
[0026] 根據(jù)其另一個目的，本發(fā)明設(shè)及至少一種miRNA作為病毒感染的生物標(biāo)記物的用 途，所述至少一種miRNA是miR-124，所述病毒優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒，并且更優(yōu)選人免疫缺陷病毒 巧 IV)。
[0027] 根據(jù)其另一個目的，本發(fā)明設(shè)及至少一種miRNA作為用于篩選藥物候選物或疫苗 候選物的生物標(biāo)記物的用途，所述至少一種miRNA是miR-124,所述藥物候選物或疫苗候選 物推測有效預(yù)防和/或治療病毒感染，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，并且更特別是HIV感染。 [00%]根據(jù)其另一個目的，本發(fā)明設(shè)及至少一種miRNA作為用于評價候選化合物改變細(xì) 胞或蛋白質(zhì)的生理活性的生物效應(yīng)，特別是藥理學(xué)潛力的生物標(biāo)記物的用途，所述至少一 種miRNA是miRNA-124。
[0029]在運方面，本文已顯示miR-124的表達(dá)水平在多種化合物的施用后改變，已知所述 多種化合物具有藥理活性。因此，本發(fā)明人已顯示miR-124構(gòu)成了候選化合物的潛在藥理活 性的有關(guān)生物標(biāo)記物。
[0030] 特別地，推測有效預(yù)防和/或治療病毒感染的藥物候選物或疫苗候選物可W是哇 嘟衍生物。
[0031] 特別地，推測有效預(yù)防和/或治療病毒感染的藥物候選物或疫苗候選物可W是式 (I)的哇嘟衍生物或其藥學(xué)可接受的鹽之一：
[0033] 其中
[0034] -n是1或2并且R獨立地代表氨原子、面素原子或選自下述的基團(tuán)：（C廣C3)烷基；-Mi化基團(tuán)，其中化和R2獨立地是氨原子或(C1-C3)烷基；（C1-C3)氣烷氧基;-N02基團(tuán)；苯氧基； 和(C1-C4)烷氧基，
[00對 -R'是氨原子、面素原子或選自（C1-C4)烷基和(C1-C4)烷氧基的基團(tuán)，
[0036] -R"是氨原子或（打-C4)烷基。
[0037] 推測有效預(yù)防和/或治療病毒感染的藥物候選物或疫苗候選