鴨ccl4基因啟動(dòng)子的克隆及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程應(yīng)用和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一個(gè)鴨CCL4基因 啟動(dòng)子的擴(kuò)增和對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性的鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因的表達(dá)受一段位于其5 '端上游的DNA序列控制，該5 '端上游序列可被轉(zhuǎn)錄因 子和RNA酶識(shí)別，進(jìn)而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，該5'端上游序列通常被稱(chēng)為啟動(dòng)子。利用啟動(dòng)子可 W誘導(dǎo)蛋白在特定的時(shí)間、部位和特定條件下表達(dá)。
[0003] 啟動(dòng)子是重要的順式作用元件，在該段序列中存在一些特定序列被轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別 并結(jié)合，運(yùn)段序列決定基因的表達(dá)特異性和表達(dá)頻率。啟動(dòng)子一般可分為Ξ類(lèi):1、組成型啟 動(dòng)子，該類(lèi)啟動(dòng)子調(diào)控基因表達(dá)不受時(shí)空的限制;2、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，即在誘導(dǎo)劑的作用下啟 動(dòng)子才誘導(dǎo)基因表達(dá);3、組織特異性啟動(dòng)子，即該類(lèi)啟動(dòng)子在不同的組織調(diào)控的基因表達(dá) 存在差異。
[0004] 在植物中，人們利用組織或時(shí)期特異的啟動(dòng)子生產(chǎn)不同的產(chǎn)品取得了豐富的成 果，如抗蟲(chóng)棉花等。同樣在大型動(dòng)物中也取得了一定的成效，如利用乳腺特異的啟動(dòng)子指導(dǎo) 藥用蛋白在乳腺中超表達(dá)，可使基因工程藥物產(chǎn)業(yè)化。黃贊等成功利用山羊的0-酪蛋白基 因的啟動(dòng)子指導(dǎo)人凝血因子IX在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中高效表達(dá)。
[0005] 我國(guó)是鴨肉消費(fèi)大國(guó)，近年來(lái)我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)不斷發(fā)展，鴨的生產(chǎn)性能在不斷選育下 大幅提高，主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度快，料肉比低，產(chǎn)蛋率高。但隨著鴨生產(chǎn)性能的提高，養(yǎng)殖規(guī) 模的擴(kuò)大，養(yǎng)鴨業(yè)也面臨著各種疾病的威脅，如禽流感、鴨病毒性肝炎、傳染性漿膜炎等，鴨 的成活率大幅降低。通過(guò)提高生產(chǎn)管理水平或使用藥物和抗生素可在一定程度上減少損 失，但并不能從根本上解決問(wèn)題，同時(shí)藥物和抗生物的使用容易引起獸藥殘留、增加食品安 全風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)對(duì)鴨的抗病性進(jìn)行研究，通過(guò)基因改良手段培育出適應(yīng)當(dāng)前生產(chǎn)環(huán)境，具有一 定抗病力的鴨品種前景將極為廣闊。但能用于轉(zhuǎn)基因鴨制備且擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效表 達(dá)的啟動(dòng)子比較少，大大限制了轉(zhuǎn)基因鴨的發(fā)展，因此，獲得轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動(dòng)子成為急 需解決的問(wèn)題。因此本發(fā)明旨在構(gòu)建獲得適合在免疫組織中高效表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0006] 趨化因子是一系列小分子蛋白質(zhì)，主要在免疫組織中表達(dá)，通過(guò)受體介導(dǎo)粒細(xì)胞、 單核/巨隧細(xì)胞、淋己細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的趨化性遷移和活化，從而使細(xì)胞在炎癥部位具體、 活化W及組織損傷的修復(fù)等。(XL4是CC家族的一員，屬前炎癥趨化因子，在受體介導(dǎo)下， CCL4能吸引單核細(xì)胞、T淋己細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞，此外它還可能是機(jī)體清除有害微生物至關(guān) 重要的因子。
[0007] 到目前為止，仍沒(méi)見(jiàn)到研究鴨CCL4基因的啟動(dòng)子功能的報(bào)道。所W申請(qǐng)人對(duì)運(yùn)個(gè) 基因進(jìn)行了不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子功能的研究，W期能夠更好地利用該啟動(dòng)子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的在于分離克隆鴨CCL4基因啟動(dòng)子區(qū)域，并構(gòu)建不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子缺 失片段，對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行驗(yàn)證，w期獲得此基因啟動(dòng)子的具備較高啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控 區(qū)段。克服目前鴨基因工程中可利用的啟動(dòng)子數(shù)目的不足。
[0009] 本發(fā)明W鴨的血液基因組DNA為模板首先擴(kuò)增獲得CCL4基因第一外顯子上游 543bp的片段，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證其正確性，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)其是否可能為該基因的啟動(dòng)子。然后 W擴(kuò)增獲得的片段為模版擴(kuò)增獲得了 CCL4基因第一外顯子上游區(qū)域的817bp、631bp、 554bp、397bp、295bp共5個(gè)不同長(zhǎng)度的缺失片段，將運(yùn)些片段插入到蛋火蟲(chóng)巧光素酶報(bào)告系 統(tǒng)中構(gòu)建pGL3-Cl、pGL3-C2、pGL3-C3、pGL3-C4、pGL3-C5個(gè)真核表達(dá)載體，將運(yùn)些載體分別 轉(zhuǎn)染雞的淋己瘤DT40細(xì)胞，通過(guò)對(duì)報(bào)告系統(tǒng)的蛋火蟲(chóng)巧光素酶的相對(duì)活性進(jìn)行分析，比較 不同缺失片段的相對(duì)活性，通過(guò)分析確定擴(kuò)增的上述片段為啟動(dòng)子區(qū)域，并獲得該基因的 核屯、啟動(dòng)子區(qū)域。
[0010] 本發(fā)明通過(guò)W下技術(shù)實(shí)現(xiàn)：
[0011] 利用ht1:p: //pre. ensembl. org/Anas_platy;rhynchos/lnfo/Index捜索獲得CCL4 的上游調(diào)控序列，其核巧酸序列。利用TFSEARCH和TESS等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析核屯、啟 動(dòng)子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、TATA Box、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等分布情況。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)1對(duì) 引物和5對(duì)含有酶切位點(diǎn)的缺失引物(其核巧酸序列見(jiàn)表1)，利用高保真酶從自己?jiǎn)挝慌嘤?鴨(含連城白鴨血統(tǒng)）的基因組中PCR擴(kuò)增分離獲得CCL4基因上游序列，通過(guò)測(cè)序保證擴(kuò)增 序列的正確性，其序列如SEQ ID NO: 1所示。然后W此為模板利用5對(duì)缺失引物PCR擴(kuò)增后構(gòu) 建融合載體，申請(qǐng)人將其分別命名為pGL3-Cl、pGL3-C2、pGL3-C3、pGL3-C4、pGL3-C5。其片段 長(zhǎng)度分別為817bp、63化9、55469、39769、29化9，其核巧酸序列分別如56〇10^:2、569 10 N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、沈Q ID N0:6所示。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染雞的淋己瘤DT40細(xì)胞，雙巧 光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PGL3-C3的活性最高，同其它載體的活性相比具有極顯著的差異。 結(jié)果顯示553bp的PGL3-C3片段具備獨(dú)立的啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的功能。
[0012] 本發(fā)明的具體步驟如下：
[0013] 結(jié)合前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果選擇(XL4基因，在http://pre.ensembl .org/Anas_ platyrhynchos/Info/Index上獲得該基因的DNA序列，如沈Q ID NO: 10所示，根據(jù)此序列注 釋尋找其第一外顯子上游序列，并設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該序列，其核巧酸序列如SEQ ID N0:1所 示。利用TESS、TFSEARCH等生物信息學(xué)軟件對(duì)序列SEQ ID N0:1預(yù)測(cè)其核屯、啟動(dòng)子區(qū)域、轉(zhuǎn) 錄起始位點(diǎn)、TATA Box、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等分布情況。根據(jù)軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果設(shè)計(jì)缺失引 物，W鴨的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得5個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子區(qū)域，序列分別如序列表 SEQ ID N0:2-SEQ ID N0:6所示。將運(yùn)些啟動(dòng)子候選片段裝載到pGL3-basic雙巧光素酶報(bào) 告基因上游多克隆位點(diǎn)（載體圖及多克隆位點(diǎn)等信息見(jiàn)圖2)處，裝配成融合表達(dá)載體（圖 3)。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法將融合表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)入DT40細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)入海腎巧光素酶 報(bào)告基因 pRL-TK為內(nèi)參質(zhì)粒。本發(fā)明設(shè)置陰性對(duì)照pGL3-basiC(圖2)，陽(yáng)性對(duì)照pGL3- control。轉(zhuǎn)染4她后通過(guò)雙巧光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)報(bào)告基因 LUC進(jìn)行定量分析，進(jìn)而考察驗(yàn)證 該啟動(dòng)子的不同缺失片段在不同來(lái)源細(xì)胞中的啟動(dòng)功能。檢測(cè)結(jié)果表明pGL3-Cl、pGL3-C2、 PGL3-C3、在DT40細(xì)胞中有較強(qiáng)的表達(dá)，其中PGL3-C3最高，而其余兩個(gè)的表達(dá)量同陰性對(duì)照 pGL3-basic無(wú)顯著性差異，表明其無(wú)轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示554bp的PGL3-C3片段轉(zhuǎn)錄活性較 高且具備獨(dú)立的啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的功能。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0015] (1)本發(fā)明詳盡的驗(yàn)證了 CCL4啟動(dòng)子的各個(gè)區(qū)段在免疫來(lái)源細(xì)胞中啟動(dòng)基因表達(dá) 的能力，為CCL4基因的表達(dá)調(diào)控帶來(lái)了更深層次的認(rèn)知。
[0016] (2)本發(fā)明鑒定了啟動(dòng)子CCL4的核屯、區(qū)段，為基因工程和分子育種提供了新的特 異表達(dá)的啟動(dòng)子資源。
[0017] 更詳細(xì)的技術(shù)方案參見(jiàn)《【具體實(shí)施方式】》的內(nèi)容。
【附圖說(shuō)明】
[001引序列表SEQ ID NO: 1，公開(kāi)了本發(fā)明克隆的鴨CCL4的上游調(diào)控核巧酸序列，長(zhǎng)度為 89f5bp。
[0019] 序列表SEQ ID N0:2是從所述的SEQ ID NO: 1核巧酸序列克隆得到的一個(gè)缺失啟 動(dòng)子PGL3-C1的核巧酸序列，長(zhǎng)度為81化P。
[0020] 序列表SEQ ID N0:3是從所述的SEQ ID N0:1核巧酸序列克隆得到的一個(gè)缺失啟 動(dòng)子PGL3-C2的核巧酸序列，長(zhǎng)度為63化P。
[0021] 序列表SEQ ID N0:4是從所述的SEQ ID N0:1核巧酸序列克隆得到的一個(gè)缺失啟 動(dòng)子PGL3-C3的核巧酸序列，長(zhǎng)度為554bp。
[0022] 序列表SEQ ID N0:5是從所述的SEQ ID N0:1核巧酸序列克隆得到的一個(gè)缺失啟 動(dòng)子PGL3-C4的核巧酸序列，長(zhǎng)度為39化P。
[0023] 序列表SEQ ID N0:6是從所述的SEQ ID N0:1核巧酸序列克隆得到的一個(gè)缺失啟 動(dòng)子PGL3--巧的核巧酸序列，長(zhǎng)度為29化P。
[0024] 圖1:本發(fā)明的技術(shù)路線(xiàn)圖。
[0025] 圖2:表示載體pGL3-basic結(jié)構(gòu)示意圖，在多克隆位點(diǎn)的下方包含報(bào)告基因 luc+。
[0026] 圖3:構(gòu)建好的WpGL3-basic為骨架的融合載體簡(jiǎn)圖。(XL4的啟動(dòng)子系列缺失片段 來(lái)驅(qū)動(dòng)LUC基因表達(dá)，由圖中的deleted promoter來(lái)表示。Amp為氨節(jié)抗性篩選基因；luc+為 報(bào)告基因蛋火蟲(chóng)巧光素酶;MCS表示多克隆位點(diǎn);箭頭方向表示基因或啟動(dòng)子表達(dá)的方向。
[0027] 圖 4:融合載體PGL3-C1、PGL3-C2、PGL3--C3、P化 3-C4、P化3-C5 的 Mlu 巧日趾 01 雙酶 切鑒定圖。Μ表示DL marker 2000，1-5分別表示融合載體961^3-(：1、961^3-〔2、961^3--〔3、 P化3-C4、p化3-巧的雙酶切結(jié)果，上面較大的條帶為載體條帶，下端為缺失啟動(dòng)子條帶，條 帶長(zhǎng)度分別為81化P、63化P、554bp、39化P、29化P。
[002引圖5:由CCL4的系列缺失啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)LUC基因在DT40細(xì)胞中的表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 實(shí)施例1:鴨的CCL4基因的啟動(dòng)子候選片段及相應(yīng)缺失片段的獲得
[0030] 在pre.ensembl.o巧數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鴨(XL4基因全長(zhǎng)序列。通過(guò)注釋信息，找到其第一 外顯子序列，選取第一外顯子上游543bp的序列，在網(wǎng)站http://www.fruitf ly.org/cgi- bin/seq_tools/promoter . pi分析發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，在http ://www. cbrc . jp/ research/化/TFSEARCH.html上分析發(fā)現(xiàn)該序列具有大量轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)。通過(guò)設(shè)計(jì)了 一對(duì)特異引物（引物命名為CCL4PF和CCL4PR，其序列見(jiàn)表1)，擴(kuò)增了895bp序列，該序列包含 55化P 5'上游序列及14化P外顯子序列和2(K)bp第一內(nèi)含子。擴(kuò)增的序列命名為CCL4P。擴(kuò)增 片段檢測(cè)結(jié)果如圖2。
[0031] PCR反應(yīng)體系為：2.0μll0XLATaqBuffer，化12mMdNTP，0.5μll0μM引物 CCL4PF和(XL4PR，1U LA Taq酶，0.5μ1 DNA，加去離子水補(bǔ)至SOyLPCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù) 變性 4min，35 個(gè)循環(huán) 94°C 變性 4〇3,54.6°(：退火4〇3,72°(：延伸1111111，72°(：延伸1〇111111。引物如 表1所示
[0032] 表1本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物序列
[0033]
[0034] 表1說(shuō)明：紅色部分為酶切位點(diǎn)，(XL4pF 1-6為Mlul酶切位點(diǎn)，(XL4pRl為化〇1酶切 位點(diǎn);加粗部分為保護(hù)性堿基。
[0035] PCR產(chǎn)物回收純化:將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳20min 后紫外燈下將目的條帶(895bp)切下，放入1.5ml離屯、管中，然后經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(北 京百泰克生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品貨號(hào):DP1701)，按其說(shuō)明書(shū)回收純化PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn) 物保存至-20°C備用。
[0036] 回收產(chǎn)物連接:將回收產(chǎn)物按如下體系與載體pGEM-Teasy (購(gòu)自普洛麥格(北京） 生物技術(shù)有限公司，即美國(guó)Promega公司）連接。連接體系為：2.5μ1 2 XLigbuffer，0 .化1 pGEM-Teasy vector,0. ?5