從萬(wàn)壽菊中分離純化槲皮萬(wàn)壽菊素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從萬(wàn)壽菊中分離純化槲皮 萬(wàn)壽菊素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 萬(wàn)壽菊，又名金菊花，學(xué)名Tagetes erecta，菊科萬(wàn)壽菊屬，為一年生草本 植物，除具有觀賞價(jià)值外，還具有很好的藥用價(jià)值。萬(wàn)壽菊花中所含的槲皮萬(wàn)壽菊素 (Quercetagetin)是萬(wàn)壽菊所特有的黃酮類化合物，具有抗炎、抗過敏、降血壓、抗心律失 常、抗血小板凝集、抗氧化等作用，其分子式為C 15H1(A，分子量318. 237,結(jié)構(gòu)式如下：
[0003]
[0004] 論文"萬(wàn)壽菊素和槲皮萬(wàn)壽菊素的分離和結(jié)構(gòu)鑒定"（廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)1990年第 18卷第1期）提出利用有機(jī)溶劑提取及重結(jié)晶的方法可以得到槲皮萬(wàn)壽菊素結(jié)晶，但是該 結(jié)晶是通過多次萃取和多次重結(jié)晶得到的，不僅操作復(fù)雜，工作量大，成本高，更為重要的 是，該方法不具備重復(fù)性，不適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)問題，提供一種從萬(wàn)壽菊中分離 純化槲皮萬(wàn)壽菊素的方法，該方法直接以萬(wàn)壽菊花為原料，采用二維高效液相色譜進(jìn)行分 離純化，經(jīng)過工藝摸索和參數(shù)優(yōu)化，得到的槲皮萬(wàn)壽菊素純度可以達(dá)到99%以上。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0008] -種從萬(wàn)壽菊中分離純化槲皮萬(wàn)壽菊素的方法，該方法包括以下步驟：
[0009] (1)以萬(wàn)壽菊干花為原料，干燥后磨成粉末狀得到萬(wàn)壽菊粗粉，用乙醇浸泡或者回 流提取，然后過濾，取濾液重復(fù)1-3次，最終所得濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干得粗提物，粗提物 再溶于甲醇-水二元混合溶劑中，進(jìn)行減壓抽濾，得到粗提物濃度為50-500mg/mL的提取 液；
[0010] (2)對(duì)提取液進(jìn)行一維液相色譜分離：采用的色譜柱為反相色譜柱DAISO C1S，采 用的流動(dòng)相為A相水、B相甲醇的二元流動(dòng)相，進(jìn)樣量為100-1000 μ L/針，連續(xù)進(jìn)樣，流 動(dòng)相流速為6-16mL/min，洗脫方式為Β相濃度50-55% (即按體積百分比Β相50-55%、 A相45-50%混合而成的液體，下同理）等度洗脫20min，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器、檢測(cè)波長(zhǎng) 200-260nm，根據(jù)紫外吸收光譜收集6-12分鐘洗脫液作為目的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得 到一維液相組分；
[0011] (3)使用甲醇-水二元混合溶劑溶解一維液相組分，溶解至濃度為50-100mg/mL ;
[0012] (4)進(jìn)行二維液相色譜分離：采用的色譜柱為Acchrom X-Amide色譜柱，采用的流 動(dòng)相為A相水、B相乙腈的二元流動(dòng)相，進(jìn)樣量為10-500 μ L/針，連續(xù)進(jìn)樣，流動(dòng)相流速為 2-4mL/min，洗脫方式為Β相濃度92-98%等度洗脫40min，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器、檢測(cè)波長(zhǎng) 200-260nm，根據(jù)紫外吸收光譜收集27-33分鐘洗脫液作為目的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干， 得到目的產(chǎn)物槲皮萬(wàn)壽菊素。
[0013] 作為優(yōu)選，所述步驟（1)、（3)中甲醇-水二元混合溶劑中甲醇體積分?jǐn)?shù)為 90-99 %，進(jìn)一步優(yōu)選為95 %。
[0014] 作為優(yōu)選，所述步驟（2)中色譜柱的尺寸為直徑20mm、長(zhǎng)度250mm，其中填料粒徑 為8 μπι，使用時(shí)柱溫為室溫或25-40°C，進(jìn)一步優(yōu)選為30°C。
[0015] 作為優(yōu)選，所述步驟（2)中等度洗脫方式為B相濃度53%等度洗脫20min。
[0016] 作為優(yōu)選，所述步驟（4)中色譜柱的尺寸為直徑10mm、長(zhǎng)度250mm，其中填料粒徑 為8 μπι，使用時(shí)柱溫為室溫或25-40°C，進(jìn)一步優(yōu)選為30°C。
[0017] 作為優(yōu)選，所述步驟（4)中洗脫方式為B相濃度95%等度洗脫40min。
[0018] 由于本發(fā)明原料萬(wàn)壽菊中的物質(zhì)極性比較集中，所以我們選用二維高效液相色譜 進(jìn)行有效組分的提取。
[0019] 在一維分離的條件選擇上：首先，所分的樣品量較大，所以挑選甲醇-水作為流動(dòng) 相進(jìn)行分離，既成本較低，又毒性較小，適合大規(guī)模生產(chǎn)所用；其次，在該樣品中所含的槲皮 萬(wàn)壽菊素含量較大，C18柱可以對(duì)其進(jìn)行分離，并結(jié)合甲醇-水流動(dòng)相，可以在等度的條件 下就完成樣品的一維分離，并得到較高的純度，且柱殘留較少；最后，通過對(duì)樣品進(jìn)行梯度 洗脫試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)樣品中所含的物質(zhì)極性較為相近，出峰時(shí)間集中，而采用本發(fā)明等度洗 脫的方式可以很好地完成初步分離，經(jīng)過條件摸索發(fā)現(xiàn)53%甲醇-47%水是最佳的洗脫條 件，可以一維分離收集到最高純度的槲皮萬(wàn)壽菊素，并且等度洗脫的方式利于開展連續(xù)多 次上樣，既減少了色譜柱出峰的死時(shí)間，又節(jié)約了沖柱及平衡時(shí)間，可以在更短的時(shí)間內(nèi)完 成槲皮萬(wàn)壽菊素的粗分離，適合于擴(kuò)大到工業(yè)生產(chǎn)。
[0020] 在二維分離的條件選擇上：首先，一維分離所得到的槲皮萬(wàn)壽菊素已具有較高的 純度，且其中所含的雜質(zhì)較少，但是這些雜質(zhì)的極性與性質(zhì)和槲皮萬(wàn)壽菊素極其接近，而 X-Amide柱具備將這些組分進(jìn)行分離的能力，分離度好，選擇性高，柱效高；其次，一維分離 所得樣品量已經(jīng)變少，使用乙腈-水來(lái)進(jìn)行分離，可以使X-Amide柱更好地發(fā)揮作用；最后， 經(jīng)過梯度洗脫試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)較好的洗脫條件為92-98%乙腈，而理論塔板數(shù)最高、出峰時(shí)間最 合適的是95%乙腈-5%水等度洗脫，這樣的二維分離可以得到99%以上純度的槲皮萬(wàn)壽 菊素。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)中相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和顯著效果：
[0022] (1)直接以萬(wàn)壽菊干花為原料，藥材來(lái)源廣；
[0023] (2)方法簡(jiǎn)單易行，可操作性強(qiáng)，儀器自動(dòng)化程度高，常溫常壓下就可進(jìn)行，重復(fù)性 好，得到的物質(zhì)組分批次之間一致性高，經(jīng)工藝放大后可以運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)；
[0024] (3)通過各工藝條件的良好協(xié)同作用和工藝參數(shù)的優(yōu)化，可以分離得到純度99% 以上的槲皮萬(wàn)壽菊素；
[0025] (4)重復(fù)性好，批次間一致性程度高，加上本發(fā)明萬(wàn)壽菊樣品中物質(zhì)極性比較集 中，適合采用連續(xù)進(jìn)樣的方式，不僅有效減少了柱洗脫時(shí)間，可以在更短的時(shí)間內(nèi)完成萬(wàn)壽 菊中槲皮萬(wàn)壽菊素單體的制備，分離周期短，分離效率高，是一種縮短樣品制備時(shí)間的的理 想方法。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1所示的是本發(fā)明實(shí)施例1從萬(wàn)壽菊中分離純化槲皮萬(wàn)壽菊素的一維高效液相 色譜圖；
[0027] 圖2所示的是本發(fā)明實(shí)施例1從萬(wàn)壽菊中分離純化槲皮萬(wàn)壽菊素的二維高效液相 色譜圖；
[0028] 圖3所示的是本發(fā)明實(shí)施例1所得到的目的組分的分析型高效液相色譜圖；
[0029] 圖4所示的是本發(fā)明實(shí)施例1所得到的目的組分的核磁共振分析圖，其中（a)為 1D1CNMR 譜（Me0D，150MHz)的數(shù)據(jù)圖譜，（b)為 1D13HNMR 譜（Me0D，600MHz)的數(shù)據(jù)圖譜， (c)為HMBC數(shù)據(jù)圖譜，（d)為DEPT 135數(shù)據(jù)圖譜；
[0030] 圖5所不的是本發(fā)明實(shí)施例2從萬(wàn)壽菊中分離純化槲皮萬(wàn)壽菊素的一維高效液相 色譜圖；
[0031] 圖6所示的是本發(fā)明實(shí)施例2從萬(wàn)壽菊中分離純化槲皮萬(wàn)壽菊素的二維高效液相 色譜圖；
[0032] 圖7所示的是本發(fā)明實(shí)施例3從萬(wàn)壽菊中分離純化槲皮萬(wàn)壽菊素的一維高效液相 色譜圖；
[0033] 圖8所示的是本發(fā)明實(shí)施例3從萬(wàn)壽菊中分離純化槲皮萬(wàn)壽菊素的二維高效液相 色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。應(yīng)該指出，以下具體說(shuō)明都是例示 性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ) 具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0035] 實(shí)施例1 :
[0036] 本實(shí)施例從萬(wàn)壽菊中分離純化槲皮萬(wàn)壽菊素的方法，包括以下步驟：
[0037] 以萬(wàn)壽菊干花為原料，磨成粉末狀后用乙醇提取旋蒸得到干燥的萬(wàn)壽菊粗粉 后稱取5g，溶于50mL 95 %的甲醇-水溶液，制得萬(wàn)壽菊提取物溶液，濃度為100mg/mL， 過0.45 μπι微孔濾膜，進(jìn)行一維液相色譜制備。一維液相色譜采用反相色譜柱DAIS0 C1S (250mmX 20mm i. d.，8 μ m)，流動(dòng)相采用的為有機(jī)相與水相混合，其中Α相是水，Β相是甲 醇，等度洗脫方式出相濃度53%等度2〇11^11。采用紫外檢測(cè)器21〇11111和26〇11111為雙選擇吸 收波長(zhǎng)，制備溫度為室溫，進(jìn)樣量為500 μ L/針，流動(dòng)相流速為12mL/min，根據(jù)紫外吸收光 譜收集圖1