Ace抑制十肽的賴氨酸甲基化衍生物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種ACE抑制十肽的賴氨酸甲基化衍生物及其制備方法。本發(fā)明ACE抑制十肽的賴氨酸甲基化衍生物：其命名為YQK(Me)FPQYLQY，其氨基酸序列為Tyr?Gln?Lys(Me)?Phe?Pro?Gln?Tyr?Leu?Gln?Tyr。本發(fā)明制備方法如下：稱取1g王樹脂放入反應(yīng)器中，加入二氯甲烷溶脹，加入序列中第一個(gè)氨基酸：1mmol當(dāng)量的L型酪氨酸；添加試劑鼓泡反應(yīng)后洗凈，然后依次Gln、Lys(Me)、Phe、Pro、Gln、Tyr、Leu、Gln、L?Tyr，反應(yīng)結(jié)束后得到粗肽產(chǎn)物。本發(fā)明在保持ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的降血壓活性的同時(shí)，提高了其熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性，以便于該ACE抑制十肽在工業(yè)化的生產(chǎn)及流通環(huán)節(jié)中能夠保持其活性。
【專利說(shuō)明】
ACE抑制十肽的賴氨酸甲基化衍生物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及利用甲基化技術(shù)對(duì)提取自酪蛋白的 ACE抑制十肽YQKFPQYLQY進(jìn)行修飾，從而提高該多肽的穩(wěn)定性。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代社會(huì)發(fā)展的不斷進(jìn)步，生活節(jié)奏的不斷加快，生活方式也隨之發(fā)生了很 大變化，高脂高糖高鹽食物的攝入越來(lái)越多，運(yùn)動(dòng)量卻逐漸減少，這種不良的生活方式導(dǎo)致 高血壓患病率逐年增加，且呈現(xiàn)一定的年輕化趨勢(shì)。
[0003] 高血壓有原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓兩種類型。原發(fā)性高血壓患者占總高血壓 患者的95%以上，由原發(fā)性高血壓所引起的腦卒中、冠心病等，在總患病率和總死亡率中所 占的比例日益增高。高血壓發(fā)病期間，人們往往會(huì)服用一些輔助性降壓藥，目前，常用的降 壓藥主要有受體阻滯劑、利尿降壓藥、鈣通道阻滯劑（CCB)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑 (ACEI)和血管緊張素 Π 受體拮抗劑(ARB)等。這些降壓藥物在一定程度上確實(shí)起到了降壓 的作用，但同時(shí)也會(huì)給服藥者帶來(lái)很大的毒副作用。例如利尿降壓藥可能會(huì)造成患者血糖、 血膽固醇、血尿酸和甘油三酯升高及血清鉀降低等危害。β-受體阻滯劑會(huì)引起眩暈、疲憊、 嗜睡、胃腸紊亂(惡心、腹瀉)等，還可以引起嚴(yán)重的心動(dòng)過(guò)緩、誘發(fā)急性心力衰竭或支氣管 哮喘、四肢冷厥及雷諾現(xiàn)象等。
[0004] 人們發(fā)現(xiàn)通過(guò)水解某些食品蛋白質(zhì)可以得到具有降壓效果的多肽，這種來(lái)源于天 然食品的ACE(angiotensin converting enzyme)抑制肽具有更高的安全性，而且對(duì)正常血 壓無(wú)降壓作用，因此成為了目前預(yù)防和治療高血壓最具開發(fā)價(jià)值的產(chǎn)品之一。
[0005] 在食源性生物活性肽中，又以乳源生物活性肽作用顯著。它是指與乳中某些蛋白 質(zhì)肽鏈的某些片段相同或相似，在乳中固有的或在乳蛋白降解過(guò)程中產(chǎn)生的具有生物活性 的肽類。隨著不同功能的乳源性活性肽的發(fā)現(xiàn)，對(duì)乳蛋白質(zhì)的研究已成為生理學(xué)界和營(yíng)養(yǎng) 學(xué)界的研究熱點(diǎn)。
[0006] 酪蛋白（casein)是乳中含量最豐富的蛋白質(zhì)，在其大分子中含有多種具有生物活 性的小分子片段，在不同蛋白酶的作用下，可釋放出具有不同功能的分子片段，ACE抑制十 肽就是其中的一種。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明，當(dāng)乳中酪蛋白在生物體內(nèi)或食品加工過(guò) 程中用酶消化時(shí)，可以產(chǎn)生大量ACE抑制十肽，這些ACE抑制十肽具有無(wú)副作用、安全性高和 易吸收等優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 本課題組前期通過(guò)對(duì)酪蛋白進(jìn)行胃蛋白酶及胰蛋白酶水解，從水解產(chǎn)物中分離純 化得到具有ACE抑制活性的片段，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，得到的ACE抑制十肽序列為YQKFPQYLQY。 (具體過(guò)程參看專利CN 103275176 A)
[0008] N-甲基-α-氨基酸是很多具有生物活性生物天然產(chǎn)物的重要組成部分。對(duì)α-氨基 酸的N-甲基化修飾會(huì)影響多肽與受體的相互作用，和沒(méi)經(jīng)過(guò)甲基化修飾的前體相比生物活 性可能會(huì)發(fā)生改變。同時(shí)，包含N-甲基氨基酸的多肽類似物具有更高的抗蛋白酶降解能力。 因此，N-甲基氨基酸常作為氨基酸和多肽衍生物構(gòu)象研究的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是保持ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的降血壓活性的同時(shí)，提高其熱穩(wěn) 定性、酸堿穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性，以便于該ACE抑制十肽在工業(yè)化的生產(chǎn)及流通環(huán)節(jié)中能夠 保持其活性。本發(fā)明將ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的第三個(gè)氨基酸賴氨酸進(jìn)行甲基化修飾后， 衍生物能夠滿足上述要求，因而該甲基化衍生物適合于加工為保健食品或藥品。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案如下：
[0011] -種ACE抑制十肽的賴氨酸甲基化衍生物的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行：
[0012] 1)稱取Ig王樹脂放入反應(yīng)器中，加入二氯甲烷溶脹半小時(shí)，然后抽掉二氯甲烷，加 入序列中第一個(gè)氨基酸：Immol當(dāng)量的L型酪氨酸，Immol的N,N-二異丙基碳二亞胺；Immol的 4_二甲氨基R比啶，6-10ml的富馬酸二甲脂溶液，用氮?dú)夤呐莘磻?yīng)3h;然后加入1mlR比啶，Iml 乙酸酐，反應(yīng)半小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗凈；
[0013] 2)加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，洗凈，并用茚三酮檢測(cè)；
[0014] 3)向反應(yīng)器中加入序列中第二個(gè)氨基酸谷氨酰胺(Gln)3mm〇l，3mm〇l 1-羥基苯并 三氮唑及N，N-二異丙基碳二亞胺，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)一小時(shí)，抽掉液體，用二甲基甲酰胺洗凈， 并用茚三酮檢測(cè)；
[0015] 4)依步驟2、3的方式依次加入序列中第三個(gè)氨基酸Ly s (Me )、第四個(gè)氨基酸Phe、第 五個(gè)氨基酸Pro、第六個(gè)氨基酸Gln、第七個(gè)氨基酸Tyr、第八個(gè)氨基酸Leu、第九個(gè)氨基酸 Gln、第十個(gè)氨基酸L-Tyr，直至最后第十個(gè)氨基酸L-Tyr反應(yīng)結(jié)束，其中第三個(gè)氨基酸為經(jīng) 過(guò)甲基化的賴氨酸；
[0016] 5)加6-10ml的95%三氟乙酸切割液，震蕩反應(yīng)2h，將氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)裂解 下來(lái)，得到粗肽產(chǎn)物；
[0017] 6)分析提純和質(zhì)譜檢測(cè)：用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)該序列分 子量的正確性，用高效液相色譜將粗肽提純至90%純以上；
[0018] 7)收集步驟6)純化好的目標(biāo)多肽溶液放入凍干機(jī)中進(jìn)行濃縮凍干，凍干成白色粉 末得到ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的賴氨酸甲基化衍生物。
[0019]所述ACE抑制十肽的賴氨酸甲基化衍生物:其命名為YQK (Me )FPQYLQY，其氨基酸序 列為 Tyr-Gln-Lys (Me)-Phe-Pro-Gln-Tyr-Leu-Gln-Tyr 〇
[0020] 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0021] 1.本發(fā)明是在前期研究所獲得的酪蛋白源ACE抑制十肽a2f(98-107):YQKFPQYLQY 的基礎(chǔ)上，對(duì)序列上的賴氨酸進(jìn)行甲基化修飾得到的新的ACE抑制十肽YQK (Me) FPQYLQY。經(jīng) 體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該多肽具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活力和降血壓功能。
[0022] 2.在ACE抑制十肽的甲基化修飾衍生物YQK(Me)FPQYLQY的制備上，不采用水解蛋 白一一純化多肽一一基團(tuán)修飾這一傳統(tǒng)技術(shù)路線，而是采用固相合成技術(shù)進(jìn)行化學(xué)合成， 其中賴氨酸先甲基化修飾，而后再連接到多肽序列上。
[0023] 3.本發(fā)明的活性多肽YQK(Me)FPQYLQY的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性較原 序列均有所提尚。穩(wěn)定性的提尚，使得修飾后的ACE抑制十妝在生廣加工、臧、運(yùn)輸和銷售 的過(guò)程中性質(zhì)更加穩(wěn)定，因而更適合開發(fā)為保健食品或藥物。同時(shí)，修飾后的ACE抑制十肽 酸堿穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性更好，使其在消化道內(nèi)更不易被人體消化酶所降解，從而能夠穩(wěn) 定發(fā)揮降血壓的作用。
[0024] 4.本發(fā)明的ACE抑制十肽的甲基化修飾衍生物YQK (Me) FPQYLQY制備方法簡(jiǎn)單，易 于提純，純度尚。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1所示為ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的ACE抑制率；
[0026] 圖2所示為ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的賴氨酸甲基化修飾衍生物YQK(Me)FPQYLQY 的ACE抑制率；
[0027]圖3所示為灌胃ACE抑制十肽YQKFPQYLQY對(duì)SHR大鼠血壓的影響；
[0028] 圖4所示為灌胃ACE抑制十肽YQKFPQYLQY對(duì)Wistar大鼠血壓的影響；
[0029]圖5所示為灌胃ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的賴氨酸甲基化修飾衍生物YQK(Me) FPQYLQY對(duì)SHR大鼠血壓的影響；
[0030] 圖6所示為灌胃ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的賴氨酸甲基化修飾衍生物YQK(Me) FPQYLQY對(duì)Wistar大鼠血壓的影響；
[0031] 圖7所示為ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的熱穩(wěn)定性結(jié)果；
[0032] 圖8所示為ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的賴氨酸甲基化修飾衍生物YQK(Me)FPQYLQY 的熱穩(wěn)定性結(jié)果；
[0033]圖9所示為ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的酸堿穩(wěn)定性結(jié)果；
[0034] 圖10所示為ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的賴氨酸甲基化修飾衍生物YQK(Me)FPQYLQY 的酸堿穩(wěn)定性結(jié)果；
[0035]圖11所示為ACE抑制十肽YQKFPQYLQY模擬胃液消化穩(wěn)定性結(jié)果；
[0036]圖12所示為ACE抑制十肽YQKFPQYLQY模擬腸液消化穩(wěn)定性結(jié)果；
[0037] 圖13所示為ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的賴氨酸甲基化修飾衍生物YQK(Me)FPQYLQY 的模擬胃液消化穩(wěn)定性結(jié)果；
[0038] 圖14所示為ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的賴氨酸甲基化修飾衍生物YQK(Me)FPQYLQY 的模擬腸液消化穩(wěn)定性結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0039]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0040] 實(shí)施例1 :ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的賴氨酸甲基化衍生物YQK(Me)FPQYLQY的制備 [0041] 1.稱取Ig wang樹脂放入反應(yīng)器中，加入DCM(二氯甲烷）溶脹半小時(shí)，然后抽掉 DCM，加入序列中第一個(gè)氨基酸：Immol當(dāng)量的L型酪氨酸，Immol的DIC(N，N-二異丙基碳二亞 胺）；Immol的4-二甲氨基吡啶，適量6-10ml的富馬酸二甲脂溶液，用氮?dú)夤呐莘磻?yīng)3h;然后 加入1ml吡啶，Iml乙酸酐，反應(yīng)半小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，用DMF(二甲基甲酰胺）、DCM洗凈；
[0042] 2.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，洗凈，茚三酮檢測(cè)；
[0043] 3.向反應(yīng)器中加入序列中第二個(gè)氨基酸：3111111〇1谷氨酰胺(6111)，3 111111〇11-羥基苯 并三氮唑及DIC，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)一小時(shí)，抽掉液體，用DMF洗凈，茚三酮檢測(cè)；
[0044] 4.依步驟2、3的方式依次加入序列中第三個(gè)氨基酸Lys (Me )、第四個(gè)氨基酸Phe、第 五個(gè)氨基酸Pro、第六個(gè)氨基酸Gln、第七個(gè)氨基酸Tyr、第八個(gè)氨基酸Leu、第九個(gè)氨基酸 Gln、第十個(gè)氨基酸L-Tyr，直至最后第十個(gè)氨基酸L-Tyr(L型酪氨酸)反應(yīng)結(jié)束，其中，第三 個(gè)氨基酸為經(jīng)過(guò)甲基化的賴氨酸(Lys);
[0045]具體步驟為:a.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，洗凈，茚三酮檢測(cè)；向 反應(yīng)器中加入序列中第三個(gè)氨基酸:3mmol Lys(Me)，3mmol 1-羥基苯并三氮唑及DIC，氮?dú)?鼓泡反應(yīng)一小時(shí)，抽掉液體，用DMF洗凈，茚三酮檢測(cè)；
[0046] b.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，洗凈，茚三酮檢測(cè)；向反應(yīng)器中加入 序列中第四個(gè)氨基酸:3mmol Phe，3mmol 1-羥基苯并三氮唑及DIC，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)一小時(shí)， 抽掉液體，用DMF洗凈，茚三酮檢測(cè)；
[0047] c.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，洗凈，茚三酮檢測(cè)；向反應(yīng)器中加入 序列中第五個(gè)氨基酸:3mmol Pro,3mmol 1-羥基苯并三氮唑及DIC，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)一小時(shí)， 抽掉液體，用DMF洗凈，茚三酮檢測(cè)；
[0048] d.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，洗凈，茚三酮檢測(cè)；向反應(yīng)器中加入 序列中第六個(gè)氨基酸:3mmol Gln，3mmol 1-羥基苯并三氮唑及DIC，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)一小時(shí)， 抽掉液體，用DMF洗凈，茚三酮檢測(cè)；
[0049] e.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，洗凈，茚三酮檢測(cè)；向反應(yīng)器中加入 序列中第七個(gè)氨基酸:3mmol Tyr，3mmol 1-羥基苯并三氮唑及DIC，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)一小時(shí)， 抽掉液體，用DMF洗凈，茚三酮檢測(cè)；
[0050] f..加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，洗凈，茚三酮檢測(cè)；向反應(yīng)器中加 入序列中第八個(gè)氨基酸：3mmol Leu，3mmol 1-羥基苯并三氮唑及DIC，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)一小 時(shí)，抽掉液體，用DMF洗凈，茚三酮檢測(cè)；
[0051] g.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，洗凈，茚三酮檢測(cè)；向反應(yīng)器中加入 序列中第九個(gè)氨基酸:3mmol Gln，3mmol 1-羥基苯并三氮唑及DIC，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)一小時(shí)， 抽掉液體，用DMF洗凈，茚三酮檢測(cè)；
[0052] h.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，洗凈，茚三酮檢測(cè)；向反應(yīng)器中加入 序列中第十個(gè)氨基酸:3mmol L-Tyr，3mmol 1-羥基苯并三氮唑及DIC，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)一小 時(shí)，抽掉液體，用DMF洗凈，茚三酮檢測(cè)；
[0053] 5.加一定量6-10ml的質(zhì)量百分比95 %三氟乙酸切割液，震蕩反應(yīng)2h，將氨基酸的 側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)裂解下來(lái)，得到粗肽產(chǎn)物；
[0054] 6.分析提純和質(zhì)譜檢測(cè)：用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)該序列分 子量的正確性，用高效液相色譜將粗肽提純至90%純以上；
[0055] 7.收集純化好的目標(biāo)多肽溶液放入凍干機(jī)中進(jìn)行濃縮凍干，凍干成白色粉末得到 ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的賴氨酸甲基化衍生物。
[0056] 實(shí)驗(yàn)例1
[0057]紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制十肽體外活性的具體步驟如下：
[0058] 取5mmol/L HHL溶液200yL與IOOyL ACE抑制十肽混合，置于37°C水浴中，預(yù)熱 5min，加入0. lU/mL ACE溶液20yL，于37°C恒溫水浴中反應(yīng)30min;然后，向反應(yīng)體系中加入 lmol/L HCl溶液250yL以終止反應(yīng)。再加入1.7mL，經(jīng)15s振蕩混勻后離心（4000r/min， 15min，4°C)，吸取1.0 mL乙酸乙酯層，在120°C的烘箱中經(jīng)30min蒸干，再將它重新溶于3mL的 去離子水中，在波長(zhǎng)228nm處測(cè)定吸光度。
[0059] 由公式XC￡：抑制率(％) = ?χ_100%計(jì)算ACE抑制十肽的抑制率，其中A代表反應(yīng) B - C 中ACE抑制劑與ACE同時(shí)存在下的吸光度;B代表反應(yīng)中不加抑制劑時(shí)的吸光度，即對(duì)照;C代 表ACE和HHL空白反應(yīng)的吸光度，即空白。
[0060] 采用上述的紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其賴氨酸甲基化修飾 衍生物YQK(Me)FPQYLQY的體外活性，其結(jié)果如圖1，2所示
[0061 ]由圖 1所擬合的一元二次方程y = -0 · 0004χ2+0 · 0392X-0 · 0047(R2 = 0 · 9687)，經(jīng)過(guò) 計(jì)算可得出ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的IC5q值為15.25yg/mL。
[0062] 由圖2所擬合的一元二次回歸方程為y = -0.0004x2+0.0418x-0.0895(R2 = 0.9850 )，經(jīng)過(guò)計(jì)算可得出ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的賴氨酸甲基化衍生物的IC5q值為16.81 yg/mL〇
[0063] 實(shí)驗(yàn)例2:
[0064] 用合成的ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其賴氨酸甲基化修飾衍生物YQK(Me)FPQYLQY 分別灌胃原發(fā)性高血壓大鼠（SHR)檢測(cè)其對(duì)SHR大鼠血壓的影響。選用12周齡的雄性SHR大 鼠32只，體重為(260 ± 15) g，自由采食飲水，保持環(huán)境溫度(23 ± I) °C，相對(duì)濕度60 % ± 5 %， 預(yù)飼養(yǎng)一周。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為空白組、低劑量組、中劑量組和高劑量 組，分別灌胃生理鹽水（10mL/Kg mb)、低、中、高劑量的合成產(chǎn)物(相對(duì)應(yīng)的灌胃劑量為1、3、 9mg/Kg mb)，另取Wistar大鼠10只，隨機(jī)分為2組，每組5只，分別作為空白組和正常對(duì)照組， 灌胃生理鹽水和高劑量的合成產(chǎn)物。采用BP-2006A型只能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)(北京軟隆科技有限 責(zé)任公司），測(cè)定大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)。測(cè)定前，將大鼠固定于鼠網(wǎng)保溫套中于39°C恒 溫預(yù)熱，使大鼠的尾動(dòng)脈擴(kuò)張，血流暢通。測(cè)定灌胃后I-Sh的尾動(dòng)脈血壓，連續(xù)測(cè)定3次，取 平均值。其對(duì)血壓的影響如圖3-圖6所示。
[0065]由圖3、圖5可以看出，ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其賴氨酸甲基化衍生物對(duì)原發(fā)性 高血壓大鼠（SHR)均具有很好的降血壓作用，與空白組相比具有顯著性差異(P〈0.05)，由圖 4、圖6可知，ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其賴氨酸甲基化衍生物對(duì)正常大鼠（Wistar大鼠）血 壓無(wú)影響(P>〇. 05)。
[0066]因此，無(wú)論體外還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其賴氨酸甲基化衍生物 YQK (Me) FPQYLQY均有較好的降血壓作用，經(jīng)過(guò)甲基化修飾后的肽片段的體外ACE抑制活性 略有下降，但其體內(nèi)降壓效果持平。
[0067] 實(shí)驗(yàn)例3
[0068]精確稱取一定量樣品配置成相同濃度，分別在4、20、37、60、80°(：條件下保溫 60min，然后分別測(cè)定ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其賴氨基酸甲基化修飾衍生物YQK (Me) FPQYLQY的ACE抑制率，其結(jié)果如圖7、8所示。YQKFPQYLQY及其氨基酸甲基化衍生物具有較好 的耐熱穩(wěn)定性，由圖7、8可以看出甲基化衍生物的ACE抑制率波動(dòng)幅度比原序列更小，經(jīng)甲 基化修飾后溫度穩(wěn)定性有所提尚。
[0069]精確稱取一定量樣品用pH值分別為1、3、5、7、9、11的磷酸緩沖溶液配制成相同濃 度，在4 °C條件下分別放置Oh、Ih、2h、3h，然后分別測(cè)定ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其賴氨酸 甲基化修飾衍生物的ACE抑制率，其結(jié)果如圖9、10所示。ACE抑制率均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，強(qiáng)酸強(qiáng) 堿條件下的樣品的抑制率下降較為明顯；酪蛋白源ACE抑制十肽YQKFPQYLQY在偏中性的條 件下活性穩(wěn)定性最強(qiáng)，強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下的活性損失較為明顯，尤其是PHl條件下處理處理3h 后與Oh相比ACE抑制活性下降最為明顯且具有顯著性差異。經(jīng)賴氨酸甲基化修飾后，衍生物 的酸堿穩(wěn)定性均有所提高，賴氨酸甲基化衍生物在堿性條件下ACE抑制活性比原序列 YQKFPQYLQY 更穩(wěn)定。
[0070]根據(jù)中國(guó)藥典第五部的要求，配制人工胃腸液。取人工胃液和人工腸液溶解ACE抑 制十肽成一定濃度。經(jīng)過(guò)人工胃液處理的樣品于37°C條件下放置0h、lh和2h，人工腸液處理 的樣品于37°C條件下放置Oh和4h，然后10000r/min，4°C條件下離心20min，取上清液，測(cè)定 上清液的ACE抑制活性，其結(jié)果如圖11-12所示。ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其賴氨酸甲基化 修飾衍生物經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后抑制率略有下降，其結(jié)果如圖13-14所示，但活性 差異不顯著(P>〇. 05 )，說(shuō)明ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其賴氨酸甲基化修飾衍生物具有良 好的耐胃蛋白酶及胰蛋白酶消化穩(wěn)定性。
[0071]由實(shí)驗(yàn)例1和實(shí)驗(yàn)例2可知原ACE抑制十肽YQKFPQYLQY經(jīng)賴氨酸甲基化修飾之后體 內(nèi)外的抑制活性均略有下降，但體內(nèi)的降壓效果與原序列相比是持平的;結(jié)合實(shí)驗(yàn)例3可知 ACE抑制十肽YQKFPQYLQY經(jīng)賴氨酸甲基化修飾后穩(wěn)定性均有所提高，尤其是酸堿穩(wěn)定性提 高較為明顯。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種ACE抑制十肽的賴氨酸甲基化衍生物的制備方法，其特征是，按照下述步驟進(jìn) 行： 1) 稱取lg王樹脂放入反應(yīng)器中，加入二氯甲烷溶脹半小時(shí)，然后抽掉二氯甲烷，加入序 列中第一個(gè)氨基酸：lmmol當(dāng)量的L型酪氨酸，lmmol的N，N-二異丙基碳二亞胺;lmmol的4-二 甲氨基吡啶，6-10ml的富馬酸二甲脂溶液，用氮?dú)夤呐莘磻?yīng)3h;然后加入lml吡啶，lml乙酸 酐，反應(yīng)半小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗凈； 2) 加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保護(hù)基，洗凈，并用茚三酮檢測(cè)； 3) 向反應(yīng)器中加入序列中第二個(gè)氨基酸谷氨酰胺(Gln)3mmol，3mmol 1-羥基苯并三氮 唑及N，N-二異丙基碳二亞胺，氮?dú)夤呐莘磻?yīng)一小時(shí)，抽掉液體，用二甲基甲酰胺洗凈，并用 茚三酮檢測(cè)； 4) 依步驟2、3的方式依次加入序列中第三個(gè)氨基酸Lys(Me)、第四個(gè)氨基酸Phe、第五個(gè) 氨基酸Pro、第六個(gè)氨基酸Gin、第七個(gè)氨基酸Tyr、第八個(gè)氨基酸Leu、第九個(gè)氨基酸Gin、第 十個(gè)氨基酸L-Tyr，直至最后第十個(gè)氨基酸L-Tyr反應(yīng)結(jié)束，其中第三個(gè)氨基酸為經(jīng)過(guò)甲基 化的賴氨酸； 5) 加6-10ml的95 %三氟乙酸切割液，震蕩反應(yīng)2h，將氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)裂解下來(lái)， 得到粗肽產(chǎn)物； 6) 分析提純和質(zhì)譜檢測(cè)：用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)該序列分子量 的正確性，用高效液相色譜將粗肽提純至90%純以上； 7) 收集步驟6)純化好的目標(biāo)多肽溶液放入凍干機(jī)中進(jìn)行濃縮凍干，凍干成白色粉末得 到ACE抑制肽YQKFPQYLQY的賴氨酸甲基化衍生物。2. -種如權(quán)利要求1方法得到的ACE抑制十肽的賴氨酸甲基化衍生物：其特征是，其命 名為 丫0〖(]\16)卩?(>)￥1^￥，其氨基酸序列為171-6111-1^8(]\16)-?116-?1'〇-6111-171-1^11-6111-丁5^ 〇
【文檔編號(hào)】C07K1/20GK105859836SQ201610239278
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月15日
【發(fā)明人】薛璐, 胡志和, 王會(huì), 王曉丹
【申請(qǐng)人】天津商業(yè)大學(xué)