凡納濱對蝦抗菌肽-CrustinB基因及其重組蛋白的制備與應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種可應用于魚蝦飼料添加劑或抗病藥物開發(fā)的凡納濱對蝦新型抗菌肽基因CrustinB的核酸序列、重組蛋白表達載體、菌株的制備方法及其應用。所述CrustinB的核酸序列長178bp，開放閱讀框架編碼197個氨基酸，推測蛋白分子量大小為19.3KDa，重組蛋白表達載體pYE?GAPα?CrustinB轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115可以獲得穩(wěn)定的表達CrustinB重組蛋白的菌株。采用本發(fā)明制備的表達菌株以及其表達的重組抗菌肽蛋白具有良好的抗菌效果，可應用于生產(chǎn)魚類和蝦類抗菌藥物、疫苗或飼料添加劑。
【專利說明】
凡納濱對虹抗菌肽-Crust i nB基因及其重組蛋白的制備與 應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種凡納濱對蝦抗菌肽-CrustinB基因 及其重組蛋白的制備與應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 漁業(yè)是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)重要組成部分，是人類蛋白食品重要來源。當前漁業(yè)生產(chǎn)過程中 面臨最大問題就是病害問題:各種細菌或者病毒病經(jīng)常引起起魚、蝦大量死亡，從而給養(yǎng)殖 業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。為了預防和控制魚、蝦病害發(fā)生，養(yǎng)殖戶不得不大量使用化學藥物進 行池塘消毒或者在飼料中添加抗生素類藥物。但是大量使用化學藥物或者抗生素類藥物會 帶來嚴重的生態(tài)破壞以及食品安全問題，因此，亟待開發(fā)可應用于現(xiàn)代漁業(yè)的無污染、無殘 留、安全有效的新型漁藥，減少化學藥物或者抗生素類藥物的使用。
[0003] 抗菌肽(Antimicrobial peptides)又叫抗微生物多肽或肽抗生素，是生物細胞特 定基因編碼，經(jīng)特定外界條件誘導產(chǎn)生的一類多肽?？咕脑趧又参矬w內(nèi)分布廣泛，是天然 免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，具有分子量小、熱穩(wěn)定、廣譜抗菌及無免疫原性等特點?？?菌肽作為傳統(tǒng)抗生素的替代物正越來越受到人們的關(guān)注，是目前國際學術(shù)研究的活躍領(lǐng)域 之一。
[0004] 與抗生素比較，抗菌肽有以下特點：不但可以抗革蘭氏陽性菌和陰性菌，甚至對寄 生蟲、真菌、病毒也具有抵抗作用;分子量小，容易被吸收，殺菌作用迅速，不易產(chǎn)生耐藥性； 抗菌濃度小，濃度單位一般在ymol/L水平。抗菌肽能耐受飼料制粒時的高溫，規(guī)?；l(fā)酵生 產(chǎn)抗菌肽時經(jīng)高溫濃縮工序，可充分殺滅酵母菌體而不導致抗菌肽失活，產(chǎn)品在推廣應用 后不會出現(xiàn)工程菌的擴散而導致環(huán)境生態(tài)問題，部分抗菌肽具有抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶 的能力，因此在抗病飼料添加劑研發(fā)方面具有重要的應用前景。
[0005] 抗菌肽普遍存在于脊椎動物或者無脊椎動物。與脊椎動物不同，無脊椎動物沒有 抗體為重要特征的特異性免疫系統(tǒng)，抵御病原入侵主要依賴非特異性免疫系統(tǒng)，抗菌肽作 為非特異性免疫系統(tǒng)重要組分在抵御病原入侵過程中扮演重要角色。凡納濱對蝦作為一種 重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖動物，在亞洲和美洲都有大量的養(yǎng)殖。凡納濱對蝦屬于無脊椎動物，其基因 組含有大量抗病相關(guān)基因，比如凝集素、抗菌肽、溶菌酶、過氧化物酶等基因。在凡納濱對蝦 已有不少抗病相關(guān)的基因或者分子被發(fā)現(xiàn)，某些基因的重組蛋白已經(jīng)被應用于魚蝦抗病藥 物開發(fā)并獲取了相關(guān)專利。
[0006] 在凡納濱對蝦或者其他甲殼類動物，已經(jīng)有許多抗菌肽基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并且公布 在NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心）上，但是本發(fā)明涉及到的抗菌肽基因 Crust inB為本發(fā) 明人首次發(fā)現(xiàn)且命名，在NCBI或者相關(guān)文獻尚沒有關(guān)于其核酸序列、重組蛋白的研究以及 應用報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種凡納濱對蝦抗菌肽-CrustinB基因及其重組蛋白的制 備方法與應用，解決當前漁業(yè)病害問題嚴重，化學藥物或者抗生素類漁藥引起的生態(tài)破壞 以及食品藥物殘留問題。
[0008] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0009] 一種凡納濱對蝦抗菌肽，包含具有與SEQ ID N0:2所示氨基酸序列至少95%同源 性的氨基酸序列。
[0010] 上述凡納濱對蝦抗菌肽的基因 CrustinB，包含具有與SEQ ID NO: 1所示核苷酸序 列至少95 %同源性的核苷酸序列。
[0011 ] -種表達載體，為將上所述的基因 CrustinB核酸表達序列連接到酵母表達載體 pYE-GAPa的EcoR I位點和Xba I位點之間，而得到的表達載體pYE-GAPa-CrustinB。
[0012] 一種上述凡納濱對蝦抗菌肽的制備方法，包括將如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序 列的DNA編碼序列克隆到表達載體中進行蛋白質(zhì)表達、純化，獲得凡納濱對蝦抗菌肽-CrustinB重組蛋白。
[0013] -種上述的CrustinB編碼基因及其變體的檢測及制備方法，其特征在于，包括以 下步驟：1)提取凡納濱對蝦總RNA，經(jīng)mRNA純化及反轉(zhuǎn)錄得cDNA; 2)設(shè)計引物，利用PCR方法 擴增編碼基因，獲得所述CrustinB的編碼基因或其變體;所述引物包括如SEQ ID N0:3所示 上游引物和如SEQ ID N0:4所示下游引物。
[0014] -種上述凡納濱對奸抗菌肽在制備魚奸抗菌藥物、疫苗或飼料添加劑中的應用。
[0015] -種上述表達載體在制備魚4下抗菌藥物、疫苗或飼料添加劑中的應用。
[0016] 相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：
[0017] 本發(fā)明提供了一種可應用于魚蝦飼料添加劑或抗病藥物開發(fā)的凡納濱對蝦新型 抗菌肽基因 CrustinB的核酸序列、重組蛋白表達載體、菌株的制備方法及其應用。本發(fā)明所 述CrustinB的核酸序列長178bp，開放閱讀框架編碼197個氨基酸，推測蛋白分子量大小為 19.3KDa，重組蛋白表達載體pYE-GAPa-CrustinB轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115可以獲得穩(wěn)定的表 達CrustinB重組蛋白的菌株。采用本發(fā)明制備的表達菌株以及其表達的重組抗菌肽蛋白具 有良好的抗菌效果，可應用于生產(chǎn)魚類和蝦類抗菌藥物、疫苗或飼料添加劑。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明采用的酵母表達載體P YE-GAPa質(zhì)粒圖譜。
[0019] 圖2是本發(fā)明pYE-GAPa-crustin B質(zhì)粒酶切鑒定。
[0020] 圖3是本發(fā)明將pYE-GAPa-crustin B電轉(zhuǎn)酵母細胞GS115結(jié)果。
[0021]圖4是本發(fā)明PCR鑒定陽性克隆菌。
[0022] 圖5是本發(fā)明小試表達SDS-PAGE電泳圖。
[0023] 圖6是本發(fā)明crustin-B蛋白WB鑒定結(jié)果。
[0024] 圖7是本發(fā)明crustin-B蛋白的葡萄球菌抑菌效果檢驗。
[0025] 圖8是本發(fā)明crustin-B蛋白的副溶血弧菌抑菌效果檢驗。
【具體實施方式】
[0026] 一、凡納濱對蝦抗菌肽:包含具有與SEQ ID N0:2所示氨基酸序列至少95%同源性 的氨基酸序列。
[0027] 二、凡納濱對蝦抗菌肽的基因 CrustinB:包含具有與SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列 至少95 %同源性的核苷酸序列。
[0028] 三、表達載體pYE-GAPa-CrustinB:基因 CrustinB核酸表達序列連接到酵母表達載 體pYE-GAPa的EcoR I位點和Xba I位點之間獲得。
[0029]四、凡納濱對蝦抗菌肽的制備方法:將如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的DNA編 碼序列克隆到表達載體中進行蛋白質(zhì)表達、純化，獲得凡納濱對奸抗菌肽-CrustinB重組蛋 白。
[0030]五、本發(fā)明CrustinB編碼基因及其變體的檢測及制備方法:包括以下步驟：1)提取 凡納濱對蝦總RNA，經(jīng)mRNA純化及反轉(zhuǎn)錄得cDNA;2)設(shè)計引物，利用PCR方法擴增編碼基因， 獲得所述CrustinB的編碼基因或其變體;所述引物包括如SEQ ID N0:3所示上游引物和如 SEQ ID N0:4所示下游引物。
[0031 ]六、本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)手段實現(xiàn)的：
[0032] (1)總RNA提取:分別從凡納濱對蝦取眼柄、腮、肝胰腺、心臟、胃、腸、后盲囊、肌肉、 神經(jīng)、表皮組織，混合后使用RNA提取試劑盒提取總RNA。
[0033] (2)轉(zhuǎn)錄組測序:將上述總RNA交由測序公司（華大基因）進行轉(zhuǎn)錄組測序，從而獲 得對蝦上述組織的轉(zhuǎn)錄組信息，同時獲得相關(guān)序列標簽信息(ESTs)。
[0034] (3)CrustinB部分核苷酸序列(EST)的獲得:使用生物軟件DNAStar中的EditSeq程 序查找上述序列的PolyA尾、特異引物序列及重疊區(qū)，用SeqMan程序去除序列之間的重疊部 分，并拼接得到全長cDNA序列。拼接后序列再用BlastX(http://www.ncbi .nlm.nib.gov/ BLAST/)進行同源性搜索、比對分析。通過同源搜索以及比對篩選出了具有抗菌肽特征的核 酸序列，將其中一個命名為CrustinB。
[0035] (4)基因完整核苷酸序列的獲得:根據(jù)凡濱對蝦CrustinB的EST序列，設(shè)計5'-RACE 和3 ' -RACE引物，通過RACE擴增以及測序分別獲得Crust inB5 '端和3 '端未知信息，通過對5 ' 端和3'端序列進彳丁拼接獲取完整CrustinB基因序列彳目息。
[0036] (5)編碼序列的獲得:使用EditSeq查找拼接后序列的開放讀碼框(ORF)，將開放讀 碼區(qū)翻譯成氨基酸序列，同時計算蛋白的分子量和理論等電點。用Signa IP預測翻譯后氨 基酸序列的信號肽及可能的切割位點。
[0037] (6)根據(jù)CrustinB序列，設(shè)計CrustinB蛋白編碼區(qū)擴增引物，在引物的兩端各設(shè)計 了保護性堿基，通過克隆位點EcoR I和Xba I連入酵母表達載體pYE-GAPa，轉(zhuǎn)入ToplO克隆 菌株。經(jīng)酶切及測序驗證無誤后，并抽提質(zhì)粒IOug以上。利用AVr II線性化重組質(zhì)粒pYE-GAPa，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,挑選5-10株陽性克隆，并通過PCR驗證，選擇1-2株陽性菌株進 行表達驗證。按照實驗預期:細胞培養(yǎng)過程中，CrustinB蛋白將會分泌表達至培養(yǎng)基中，通 過SDS-PAGE電泳檢測及WB驗證目的蛋白的表達情況，經(jīng)分析有檢測到目標蛋白的表達。 [00 38] (7)CrustinB蛋白的純化以及抗菌分析。將已證實可表達CrustinB蛋白的畢赤酵 母菌種接種到Y(jié)H)培養(yǎng)基(含胰蛋白胨2%、酵母提取物1%、葡萄糖2% )，按設(shè)定的培養(yǎng)條件 培養(yǎng)96小時后，將菌液1000 Orpm離心2min取上清液備用。將上清液樣品加到Ni-NTA層析柱 中，流速控制在15ml/小時左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況，用5 倍Ni-NTA體積的NTA-OBuf fer沖洗無法吸附到Ni -NTA的雜質(zhì)，再用5倍Ni -NTA體積洗脫液過 柱，收集含有目的蛋白的洗脫液。SDS-PAGE電泳檢測洗脫液是否含有目的蛋白或者雜蛋白， 利用冷凍干燥機將獲取的蛋白溶液進行濃縮，用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。
[0039] (8) Crust inB蛋白的抗菌效果分析。取30uL對數(shù)生長期細菌，加入到固體培養(yǎng)基平 板，混勾涂布到平板上；用滅菌紙片充分浸泡到濃度為(0.03mg/m 1)的CruSt inB蛋白溶液， 然后取出貼至平板上，培養(yǎng)12-20h。設(shè)立滅菌生理鹽水作為陰性對照，操作方法同CrustinB 蛋白實驗組，設(shè)立設(shè)立氨芐青霉素及鏈霉素藥敏紙片作為陽性對照，直接取藥敏紙片貼至 已經(jīng)涂布有細菌的平板上。
[0040] 以下結(jié)合實施例及其附圖對本發(fā)明技術(shù)方案作進一步非限制性的詳細說明。
[0041] 下述實施例中所用的方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見： 《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》（Sambrook，J·，RusselI，David ff., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 3rd edit ion，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由華大基因（深圳)科技有限公司合成。
[0042]本發(fā)明采用的pYE-GAPa載體、赤酵母GS115購自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司，pYE-GAPa載體的質(zhì)粒圖譜分別如圖所示;oligo dT、各種限制性內(nèi)切酶和Taq酶均購自TaKaRa公 司，T4DNA連接酶購自NEB公司，膠回收試劑盒和質(zhì)粒少量抽提試劑盒購自O(shè)MEGA公司，質(zhì)粒 大量抽提試劑盒購自Nucleo Bond公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均購自HyClone公司；轉(zhuǎn) 染試齊IjMagetran購自O(shè)rigene公司；倒置顯微鏡為Olympus產(chǎn)品，焚光倒置顯微鏡為Nikon公 司產(chǎn)品。SPF南美白對蝦(體重10.2 ± 0.33g )，取自廣西水產(chǎn)研究所南美白對蝦國家良種場。 pYE-GAPa質(zhì)粒(鐘鼎實驗保存），T0P10菌株(鐘鼎生物保種），GS115(購自life公司，鐘鼎實 驗保存），Protein Marker(鐘鼎生物自制），PVDF膜(購自美國Millipore公司），X光片（購自 美國柯達公司），ECL顯色液(購自中國普利萊公司），鼠抗His單抗(鐘鼎生物實驗室自制）， 兔抗鼠 HRP二抗（鐘鼎生物實驗室自制），Acr、Bi s、Tr is等（購自Sigma公司），SDS(購自 Amresco公司），Tyrptone、Yeast Extract(購自0X0ID公司），PCR反應管（購自Fisher公司）， 0.22以111無菌濾器和透析袋（購自附11丨口〇代公司），附2+104親和層析膠（2〇〇1113；[0公司） Agarose (購自上?；蚬荆珼NA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(購自AXYGEN公司），SACI (購自寶生物），常規(guī)生化試劑為國產(chǎn)分析純。若無特別說明，本發(fā)明采用的其他試劑均為市 售商品。
[0043]本發(fā)明通過以下步驟獲得：
[0044] (1)對蝦組織取樣：凡納濱對蝦，平均體重約為12克。取樣時，除了血淋巴外，還分 別取眼柄、腮、肝胰腺、心臟、胃、腸、后盲囊、肌肉、神經(jīng)、表皮，置于RNAlater液(美國ANBIN 公司）中-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0045] (2)總RNA提?。菏褂肨RI zol reagent提取總RNA，參照根據(jù)NanoDrop 1000 spectrophotometer和Agilent 2IOOBioanalyzer檢測提取總RNA的質(zhì)量以及完整性， 具體方法參照說明書。
[0046] (3)轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建：用Dnas e I消化總RNA樣品中存在的DNA片段，參照試劑盒（ .P_〇lyATt.]ract:?:mRNA Isolation Systems)說明，將mRNA從總RNA中純化出來。將mRNA隨機 打斷后反轉(zhuǎn)錄成cDNA:將mRNA與打斷試劑混勻，在加熱的條件下，并作用一定時間后乙醇沉 淀法回收打斷產(chǎn)物，配置第一鏈合成反應體系并合成cDNA。將cDNA末端修復為平末端，3'添 加(A)堿基，在平末端cDNA 5'及3'加接頭，膠回收一定片段大小的連接產(chǎn)物。使用PCR技術(shù) 擴增帶有接頭的DNA片段。反應結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行鑒定電泳，用膠回收試劑盒純化和回 收對目的片段，回收產(chǎn)物溶于適量Elution Buffer中，做好標記，至此文庫制備完成。
[0047] (4)轉(zhuǎn)錄組測序及基因識別：將建好的凡納濱對蝦文庫，根據(jù)測序操作流程在 454GS-FLX系統(tǒng)（Roche)上進行測序。經(jīng)測序后獲取相應的EST序列，使用組裝軟件 iAssembler(http://bioinfo，bti，Cornell · edu/tool/iAssembIer)對EST序列進行組裝。 使用G0(Gene Ontology)、KEGG數(shù)據(jù)庫對全部組裝序列進行功能歸類。歸類結(jié)果，其中一條 核酸序列CrustinB具有抗菌肽特征，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫搜索、比對，數(shù)據(jù)庫中沒有與之高度同源 的核酸序列，因此可認定為新發(fā)現(xiàn)的核酸序列。
[0048] (5)CrustinB基因全長擴增:根據(jù)獲得凡濱對蝦CrustinB EST序列，設(shè)計RACE引 物，以CrustinB的3 '及5 ' -RACE-Ready cDNA為模板，配制PCR體系分別進行第一輪和第二輪 PCR擴增，增產(chǎn)物交由華大基因科技有限公司進行測序;利用DNAstar軟件對測序結(jié)果進行 分析以及拼接，從而獲得包含完整開放閱讀框架(ORF)的CrustinB基因。
[0049] (6)pYE-GAPa-crustinB:本發(fā)明實例采用的載體pYE-GAPa質(zhì)粒圖譜如圖1所示，該 質(zhì)粒為環(huán)狀雙螺旋質(zhì)粒，空載質(zhì)粒含3080個堿基，喊含有一個博萊霉素篩選基因 Zeocin，多 克隆位點可以插入外源基因，多克隆位點上游含有6個組氨酸編碼序列，因此所表達的蛋白 含有6個組氨酸組成的蛋白標簽。
[0050] pYE-GAPa-crustinB質(zhì)粒構(gòu)建如SEQ ID N0:6所示，采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因 crustinB，雙酶切連接至pYE-GAPa載體的EcoR I和 Xba I之間；挑取陽性克隆子測序。
[0051 ] (7)pYE-GAPa-Crustin-B質(zhì)粒酶切鑒定：如圖2所示，圖中：M為核酸分子量標尺 Marker，由下至上每條條帶的大小分別為IOObp，250bp，500bp，750bp，1000 bp，1500bp， 2000bp，3000bp，5000bp; I為酶切后質(zhì)粒;2為酶切前質(zhì)粒。
[0052] (8)質(zhì)粒提取及線性化:將IOuL線性化質(zhì)粒pYE-GAPa-crustin-B加入到裝有80uL 畢赤酵母感受態(tài)酵母細胞的1.5mLEP管內(nèi)，混勻后加入到直徑為0.2cm電轉(zhuǎn)化杯中。電擊條 件為：電壓1700V、時間8mS、電擊2次。
[0053] (9)電轉(zhuǎn)酵母細胞GSl 15 :分別吸取50ul、IOOuL和200uL線性化質(zhì)粒pYE- Lvcrustin-B-capsid的混合液涂布于100ug/ml Zeocin抗生素 YPD平板上，30度恒溫培養(yǎng)48 小時，待平板長出菌落，用接種環(huán)挑取平板上生長的單菌，將它接入到裝有10ml YH)液體培 養(yǎng)基試管中（抗生素 Zeocin濃度100ug/ml)，30度，180rpm過夜培養(yǎng)，結(jié)果如圖3所示。
[0054] (10) PCR鑒定陽性克隆菌株：挑選6株陽性克隆，分別提取基因組DNA(編號為 123456)，使用5'pGAP priming和3'AOXlpriming引物對目的基因進行PCR鑒定，結(jié)果顯示均 為陽性。PCR鑒定陽性克隆子，預期條帶大小約1.0 K.。如圖4所示，圖中：M為DNA Marker，從 下到上各條帶分別為100，250，500，750，1000，2000bp; 1-6為陽性克隆子PCR條帶。
[0055] (ll)小試表達:crustin-B蛋白大小19.3KD，翻譯后氨基酸序如SEQIDN0:5所示。 取上述鑒定陽性的表達菌株(3號菌株)接入裝有9ml YPD(抗生素 Ze〇Cin200ug/mL)的試管 中，30度、220rpm培養(yǎng)24h后，取500uL接入到50ml YPD(抗生素 Zeocin 200ug/mL)液體培養(yǎng) 基中，30度、220rpm培養(yǎng)，每Oh，24h，48h，72h，96h時從培養(yǎng)基中取樣，lOOOOrpm、2min離心收 集上清液，使用SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖5所示。圖中：Lane M:protein marker;Lane I: pGAPZaA-〇&口81(1轉(zhuǎn)化63115菌株培養(yǎng)0小時;1^116 2$64?2&4-caps id轉(zhuǎn)化 GSl 15菌株培養(yǎng) 24小時；Lane 3:pGAPZaA-capsid轉(zhuǎn)化GS115菌株培養(yǎng)48小時；Lane 4:pGAPZaA-capsid轉(zhuǎn) 化GSl 15菌株培養(yǎng)72小時;Lane 5:pGAPZaA-capsid轉(zhuǎn)化GSl 15菌株培養(yǎng)96小時。經(jīng)分析結(jié) 果顯示24h，48h，72h，96h菌株均有陽性，選擇一株進行菌株放大培養(yǎng)，目的蛋白條帶如箭頭 所示。
[0056] (12)WB(Western blot)鑒定：取步驟（I 1)上清液樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié) 束后將凝膠剪裁至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡20min。按凝膠大小剪裁濾紙數(shù)塊及PVDF膜 一塊，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中I Omin。在轉(zhuǎn)膜裝置中由正極到負極按順序疊放24層濾紙、PVDF膜、 凝膠、24層濾紙并精確對齊，玻璃棒小心排除氣泡。放置完成后接通電源，恒流20V恒壓或 30mA恒流轉(zhuǎn)印1-2h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜取出，觀察預染marker是否轉(zhuǎn)移良好。用鑷子取 出PVDF膜，浸泡于I 3BS-T液中漂洗3次，每次5min。取出PVDF膜放到封閉液中，室溫平穩(wěn)搖動 2h。然后用PBST清洗PVDF膜三次，每次5min。將膜放入塑膠袋中，對膜的正面做好標記，然后 向袋內(nèi)滴加稀釋好的一抗，加入6-Histag單克隆抗體，37°C孵育Ih。將膜取出，用PBS-T清洗 三次，每次5miη。以同樣的方法將PVDF膜用羊抗鼠 IgG-HRP抗體孵育I-2h。二抗作用后，取出 膜以PBS-T清洗三次，每次3-5min。然后將膜放入塑膠袋中，滴加適量DAB顯色液避光顯色至 有清晰的目標蛋白帶出現(xiàn)，用ddH20終止反應，把膜置于濾紙上，待膜干透后拍照或封存。 [00 57] crustin-B蛋白WB鑒定結(jié)果如圖6所示，經(jīng)Western blot驗證，純化的蛋白被抗his 抗體識別，條帶大小與預期相符，證明crustin-B表達以及純化成功。圖中：Lane M:protein marker;Lane 1空白對照；Lane 2-5不同濃度的crustin-B蛋白樣品。
[0058] (13)CrustinB重組蛋白純化:將步驟（11)菌液5000rpmX IOmin離心，取上清液進 行蛋白純化。具體方法:將層析柱固定在支架上，關(guān)閉層析柱的帽子;輕微混勻Ni-NTA樹脂 填料(填料中含有等體積的30%乙醇），取4-5ml裝入層析柱中，靜置待填料全部自然沉降至 底部后，松開帽子讓30%乙醇流出，然后以8倍柱體積的buffer B平衡柱子一次;往平衡好 的柱子加入約8倍柱體積的蛋白溶液，調(diào)整帽子控制流速，在重力作用下自然過柱；用8倍柱 體積用buffer C沖洗柱子2次，收集流出液。用1倍柱體積的用buffer D洗脫柱子4次，收集 流出液;用1倍柱體積的buffer E洗脫柱子4次，收集流出液;取穿透液以及各梯度流出液進 行SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白質(zhì)在各管中分布情況。使用蛋白定量試劑盒測定蛋白的濃 度。
[0059] (H)CrustinB重組蛋白抑菌實驗:取30uL對數(shù)生長期細菌，加入到LB培養(yǎng)基，混勻 涂布到平板上；用滅菌紙片充分浸泡到濃度為(0.03mg/ml)的CrustinB蛋白溶液，然后取出 貼至平板上，培養(yǎng)20h。設(shè)立滅菌生理鹽水作為陰性對照，操作方法同CrustinB蛋白實驗組， 設(shè)立設(shè)立氨芐青霉素及鏈霉素藥敏紙片作為陽性對照，直接取藥敏紙片貼至已經(jīng)涂布有細 菌的平板上。
[0060] 分別用葡萄球和溶藻弧菌作為實驗菌株，通過抑菌圈實驗鑒定抑菌效果，結(jié)果分 別如圖7和8所示，圖中：B: crustin-B;NC:生理鹽水對照。與陰性對照相比，crustin-B對葡 萄球菌以及副溶血弧菌明顯具有抑菌作用。
[0061] 應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可 以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種凡納濱對蝦抗菌肽，其特征在于:包含具有與SEQ ID N0:2所示氨基酸序列至少 95%同源性的氨基酸序列。2. -種權(quán)利1所述凡納濱對蝦抗菌肽的基因 CrustinB，其特征在于:包含具有與SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列至少95%同源性的核苷酸序列。3. -種表達載體，其特征在于，所述的表達載體為將權(quán)利要求2所述的基因 CrustinB核 酸表達序列連接到酵母表達載體pYE-GAP α的EcoR I位點和Xba I位點之間，而得到的表達 載體pYE-GAP a-CrustinB。4. 一種權(quán)利要求1所述凡納濱對蝦抗菌肽的制備方法，其特征在于，包括將如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的DNA編碼序列克隆到表達載體中進行蛋白質(zhì)表達、純化，獲得凡納 濱對奸抗菌肽-CrustinB重組蛋白。5. -種權(quán)利要求2所述的CrustinB編碼基因及其變體的檢測及制備方法，其特征在于， 包括以下步驟：1)提取凡納濱對蝦總RNA，經(jīng)mRNA純化及反轉(zhuǎn)錄得cDNA;2)設(shè)計引物，利用 PCR方法擴增編碼基因，獲得所述CrustinB的編碼基因或其變體;所述引物包括如SEQ ID N0:3所示上游引物和如SEQ ID N0:4所示下游引物。6. -種權(quán)利要求1所述凡納濱對奸抗菌肽在制備魚奸抗菌藥物、疫苗或飼料添加劑中 的應用。7. -種權(quán)利要求3所述表達載體在制備魚奸抗菌藥物、疫苗或飼料添加劑中的應用。
【文檔編號】C07K14/435GK105859863SQ201610421494
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】黎銘, 馬春霞, 李朝政, 彭金霞, 何蘋萍, 陳曉漢
【申請人】廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學研究院