具持續(xù)控制血糖含量功能的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供能顯著降低血液中的血糖含量并具持續(xù)作用的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白的新分子藥物結(jié)構(gòu)：rGLP?12/HSA/GLP?12。特別是，本發(fā)明還提供了利用基因工程技術(shù)構(gòu)建酵母工程菌來表達(dá)生產(chǎn)這種重組融合蛋白。該等重組融合蛋白的發(fā)明提供了，1)可降低血液中血糖的含量，減體重和用于糖尿病和心血管疾病的治療；2)可在體內(nèi)外大大延長胰高糖素類肽的壽命，以達(dá)到其在血液中的最大穩(wěn)定性和可持續(xù)作用于血糖控制的長效功能；和3)可利用酵母菌達(dá)到低成本規(guī)模化生產(chǎn)和制備工藝和技術(shù)。CGMCC No964520140911
【專利說明】
具持續(xù)控制血糖含量功能的重組人血清白蛋白/胰高糖素 類肽融合蛋白
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明是中國專利 ZL02142881. 6、ZL200410042814. 8 和 ZL200710057571. 9 的繼 續(xù)申請(qǐng)。本發(fā)明涉及基因重組及表達(dá)的人血清白蛋白融合蛋白及其制備方法，并涉及單一 融合蛋白或不同融合蛋白組合使用的方法。特別涉及利用酵母菌表達(dá)生產(chǎn)由人血清白蛋白 與胰高糖素類肽形成不同分子結(jié)構(gòu)的重組融合蛋白，作用于2型糖尿病患者高血糖癥狀的 控制，減輕體重的制劑以及心血管疾病的預(yù)防和治療并具持續(xù)作用的長效藥用功能。
【背景技術(shù)】
[0002] 人血清白蛋白（HSA)是一種可溶性單體蛋白質(zhì)，構(gòu)成血液中蛋白總量的一半。白 蛋白作為一種基本載體，攜帶傳遞脂肪酸、類固醇和激素分子等，其穩(wěn)定的惰性性質(zhì)是維持 血壓的一個(gè)重要因素。血清白蛋白是一種球狀非糖基化的、分子量為65千道爾頓、具有585 個(gè)氨基酸的血清蛋白質(zhì)。這一蛋白（白蛋白前體）再通過高爾基體的轉(zhuǎn)化加工，去除引導(dǎo) 多肽，而分泌到細(xì)胞外。血清白蛋白有35個(gè)半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一個(gè)有17個(gè)二 硫鍵的單體（參見Brown JR，"白蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用"Pergamon，紐約，1977)。當(dāng)沒有 分泌多肽時(shí)，在酵母細(xì)胞內(nèi)的白蛋白產(chǎn)物是錯(cuò)配狀態(tài)，將失去90 %的抗原性（與血漿中自 然狀態(tài)白蛋白相比），并且形成不溶性的白蛋白聚合體，不具有白蛋白的生物活性。現(xiàn)在用 于臨床的白蛋白均是從人血漿中提取的。利用微生物重組表達(dá)白蛋白（rHSA)的生產(chǎn)已在 專利EP330451、EP361991和于在林、富巖中國授權(quán)專利ZL2004010057313. 7中公開。
[0003] 白蛋白是血液中的主要成分，在人體內(nèi)含量為每升血液含40克，其半衰期壽命 為14-20天。在藥物制劑組成中，白蛋白也常被用作藥物的穩(wěn)定劑，尤其是生物藥和疫苗 的制造。綜上所述，利用基因工程技術(shù)，將人血清白蛋白與治療性蛋白質(zhì)基因融合在酵母 菌或脊椎動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)為重組融合蛋白后，該融合蛋白將具有極大的優(yōu)勢使之可抵御生 物體內(nèi)酶解作用，并可使治療性蛋白質(zhì)在體內(nèi)體外的壽命大大提高，也就是可增加治療性 蛋白質(zhì)在血清中和儲(chǔ)存時(shí)的穩(wěn)定性和較長的半衰期，達(dá)到蛋白藥物的長效化，還可以較高 的藥物劑量使用，大大減少給藥頻率，在重大疾病臨床治療中獲得更好的治療效果。該項(xiàng) 蛋白藥物長效化技術(shù)平臺(tái)，新藥物分子結(jié)構(gòu)和基因工程生產(chǎn)酵母工程菌菌種和脊椎動(dòng)物細(xì) 胞表達(dá)株的構(gòu)建分別在于在林、富巖中國授權(quán)發(fā)明專利ZL02142881. 6、ZL200410042814. 8 和ZL200710057571.9中獲得公開；新長效藥物的生產(chǎn)工藝、注射用制劑配方、口服 用制劑配方和生產(chǎn)工藝，已經(jīng)在富巖、于在林中國授權(quán)發(fā)明專利ZL200410057313. 7、 ZL200810089645. 1、ZL200910210379. 8和中國發(fā)明專利申請(qǐng)公布號(hào)CN103520706A中分別 獲得公開，在此引為參考文獻(xiàn)。
[0004] 血糖是當(dāng)人體血液中的糖含量維持高水平而不能被正常代謝掉，產(chǎn)生的血糖高現(xiàn) 象，稱為高血糖癥，是2型糖尿病患者的典型癥狀。為控制高血糖，患者為此需要終身用藥。 就糖尿病病理機(jī)制開展的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖經(jīng)口服后，對(duì)胰島素分泌的促進(jìn)作用明顯高于 靜脈注射葡萄糖，這種額外的效應(yīng)被稱為"腸促胰素效應(yīng)"，而后科學(xué)家進(jìn)一步研究證實(shí)，這 種"腸促胰素效應(yīng)"所產(chǎn)生的胰島素占進(jìn)食后胰島素總量的50%以上。而2型糖尿病患者 口服葡萄糖后，這種腸促胰素作用大大減退。這提示，腸促胰素系統(tǒng)異?？赡苁?型糖尿病 的發(fā)病機(jī)制之一。研究確認(rèn)腸促胰素是人體內(nèi)一種腸源性激素，在進(jìn)食后，該類激素可促進(jìn) 胰島素分泌，發(fā)揮葡萄糖濃度依賴性降糖作用。該腸促胰素實(shí)際就是由人內(nèi)源胰高糖素類 肽（Glucagon-Like P印tide-1，GLP-1)和糖依賴性胰島素釋放肽（GIP)組成，其中GLP-1 在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著更為重要的作用。
[0005] GLP-1由胰高血糖素原基因表達(dá)，在胰島α細(xì)胞中，胰高血糖素原基因的主要表 達(dá)產(chǎn)物是胰高血糖素肽。而在腸黏膜的L細(xì)胞中，前激素轉(zhuǎn)換酶（PC1)將胰高血糖素原 剪切為其羧基端的肽鏈序列，即GLP-1。GLP-1有2種生物活性形式，分別為GLP-1 (7-37) 和GLP-1 (7-36)，這兩者僅有一個(gè)氨基酸序列不同，GLP-1約80%的生物活性來自 GLP-l(7-36)。GLP-1還具有保護(hù)β細(xì)胞的作用，促進(jìn)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄、胰島素的合成和 分泌，并可刺激胰島β細(xì)胞的增殖和分化，抑制胰島β細(xì)胞凋亡，增加胰島β細(xì)胞數(shù)量。 此外，GLP-1還可作用于胰島α細(xì)胞，強(qiáng)烈地促進(jìn)胰高血糖素的釋放，并作用于胰島δ細(xì) 胞，促進(jìn)生長抑素的分泌，生長抑素又可作為旁分泌激素參與促進(jìn)胰高血糖素的分泌。研究 證明，GLP-1可通過多種機(jī)制明顯地改善2型糖尿病動(dòng)物模型或患者的血糖情況，其中促進(jìn) 胰島β細(xì)胞的再生和修復(fù)，增加胰島β細(xì)胞數(shù)量的作用尤為顯著，這為2型糖尿病的治療 提供了一個(gè)非常好的前景。
[0006] GLP-1具有葡萄糖濃度依賴性降糖作用作為一種腸源性激素，GLP-1是在營養(yǎng)物 質(zhì)特別是碳水化合物的刺激下才釋放入血的，其促胰島素分泌作用呈葡萄糖濃度依賴性， Nauck等對(duì)10例血糖控制不佳的2型糖尿病患者進(jìn)行了研究，并在空腹?fàn)顟B(tài)下分別給予患 者GLP-1或安慰劑，結(jié)果顯示，患者在輸注GLP-1后，其胰島素和C肽水平顯著增加，胰高血 糖素水平顯著降低，空腹血糖水平在4小時(shí)后變?yōu)檎?。在血糖水平正常后，雖然仍持續(xù) 輸注GLP-1，患者的胰島素水平卻不會(huì)再升高，血糖水平也維持穩(wěn)定，不再進(jìn)一步下降。這說 明GLP-1具有葡萄糖濃度依賴性降糖作用，即只有在血糖水平升高的情況下，GLP-1才發(fā)揮 降糖作用，而在血糖水平正常時(shí)，則不會(huì)使其進(jìn)一步降低。GLP-1的這種葡萄糖濃度依賴性 降糖特性是其臨床應(yīng)用安全性的基礎(chǔ)與保障，從而免除了人們對(duì)現(xiàn)有糖尿病治療藥物及方 案可能造成患者嚴(yán)重低血糖的擔(dān)心。
[0007] 研究表明GLP-1具有減輕體重的功效。20例2型糖尿病患者在參與研究，接受 GLP-1治療6周后，體重平均減輕了 1. 9kg。研究者認(rèn)為，GLP-1是通過多種途徑產(chǎn)生降低 體重的作用，包括抑制胃腸道蠕動(dòng)和胃液分泌，抑制食欲及攝食，延緩胃內(nèi)容物排空。此外， GLP-1還可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（特別是下丘腦），從而使人體產(chǎn)生飽脹感和食欲下降。除 此之外，GLP-1還具有許多其他生物學(xué)特性及功能，例如，GLP-1可能發(fā)揮降脂、降壓作用， 從而對(duì)心血管系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)作用；它還可通過作用于中樞增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶功能，保護(hù)神經(jīng)。 GLP-1來源于回腸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的胰高糖素原，它通過刺激葡萄糖依賴的胰島素分泌和 胰島素生物合成、胰島增殖、再生和抗凋亡作用以及抑制胰高糖素分泌而控制血糖水平。 GLP-1還抑制上消化道運(yùn)動(dòng)。
[0008] 高血糖可引起微血管病變，使患者的微循環(huán)有不同程度的異常。隨著病程的延長 和治療不及時(shí)會(huì)促使微血管病變的加重和發(fā)展，使患者致盲、致殘。微血管病變主要表現(xiàn)在 視網(wǎng)膜、腎、心肌、神經(jīng)組織及足趾，使患者身受病痛折磨。
[0009] 然而，要將GLP-1應(yīng)用于臨床也面臨著問題，那就是人體自身產(chǎn)生的GLP-1極易被 體內(nèi)的二肽基肽酶IV(DPP-IV)的降解，其血漿半衰期不足2分鐘，必須持續(xù)靜脈滴注或持 續(xù)皮下注射才能產(chǎn)生療效，這大大限制了 GLP-1的臨床應(yīng)用。為解決這一難題，學(xué)者們已經(jīng) 提出兩種方案，一是開發(fā)GLP-1類似物，讓其既保有GLP-1的功效，又能抵抗血液中生物酶 的降解，并由此形成一些每天給藥的GLP-1類似的藥物；串聯(lián)的GLP-1也可以延長GLP-1的 血液半衰期。二是開發(fā)小分子DPP-IV抑制劑化合物，使體內(nèi)自身分泌的GLP-1不被降解。 目前，這兩方面研究都已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。
[0010] 利拉魯肽（Liraglutide)由諾和諾德制藥集團(tuán)公司研發(fā)，作為一種新型長效 GLP-1類似物，與人GLP-1具有97%的序列同源性，人GLP-1可以結(jié)合并激活GLP-1受體。 GLP-1受體為天然GLP-1的靶點(diǎn)，GLP-1是一種內(nèi)源性腸促胰島素激素，能促進(jìn)胰島β細(xì) 胞增生和分化，明顯保護(hù)并改善胰島β細(xì)胞功能。與人GLP-1分子結(jié)構(gòu)相比有兩處差別， 首先氨基酸肽鏈中C16脂肪酸鏈在第26位上通過谷氨酸連接到賴氨酸上。其次，在第34 位上的賴氨酸被精氨酸所替代，以確保C16側(cè)鏈只能結(jié)合在第26位上。脂肪酸側(cè)鏈可以 使利拉魯肽在血夜中與白蛋白可逆性地結(jié)合，使利拉魯肽的作用時(shí)間延長，且增強(qiáng)對(duì)DPP-4 酶降解的抵抗，脂肪酸側(cè)鏈還可以使利拉魯肽分子在注射部位自交聯(lián)成七聚體，從而延緩 其自皮下吸引，使其作用時(shí)間可長達(dá)接近24小時(shí)，每天注射一次并且可在任意時(shí)間注射， 與進(jìn)餐無關(guān)。同時(shí)利拉魯肽應(yīng)用簡單方便，1天1次即可提供24h血糖控制，且低血糖發(fā)生 風(fēng)險(xiǎn)小，成為了治療2型糖尿病的新型藥物。追求長效和高效的GLP-1多肽治療藥物是研 究者的方向。
[0011] 本發(fā)明人使用發(fā)明人具有發(fā)明專利權(quán)的重組人血清白蛋白融合蛋白技術(shù)在完成 將人粒細(xì)胞刺激因子、白介素、干擾素 a 2a、干擾素 a 2b、促紅素、HGH等20余個(gè)治療用蛋白 質(zhì)多肽直接連接到人血清白蛋白氨基酸肽鏈的C端后，又將2個(gè)GLP-1多肽（7-36)串聯(lián)后 直接連接到人血清白蛋白的C-端肽鏈，以及將2個(gè)GLP-1多肽（7-36)串聯(lián)后直接連接到人 血清白蛋白的N-端肽鏈，然后分別在畢赤酵母菌中表達(dá)，獲得了在高給藥劑量下，可達(dá)到1 周給藥1次的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白。GLP-1的氨基酸序列是未發(fā)生 氨基酸替換的天然序列。
[0012] 其后，美國人類基因組學(xué)公司（HGSI)公開了其所研發(fā)的Albugon，后稱 Albiglutide也是將2個(gè)人GLP-1蛋白質(zhì)的第7-36個(gè)氨基酸肽鏈串聯(lián)，但其中的第8位氨 基酸Ala，因?yàn)槭桥c第7位His-Ala連接是DPP-IV酶切的喜好位點(diǎn)，因此，就將第8位的Ala 變更為Gly (第34位則與諾和諾德的利拉魯肽修改K為R氨基酸不同，仍然維持天然的氨 基酸K)后直接連接和融合在N端人血清白蛋白，進(jìn)一步在S. ceravinia酵母菌中表達(dá)得到 重組人胰高糖素類肽2/血清白蛋白融合蛋白。隨后該新藥由英國GSK制藥集團(tuán)公司收購， 開展和完成了臨床試驗(yàn)I-III期研究。該新藥的臨床上使用劑量達(dá)50mg/針，每周給藥1 次，遠(yuǎn)優(yōu)于諾和諾德公司市場上銷售中的利拉魯肽（每天注射給藥1次）。至本發(fā)明提交 日，GSK公司已經(jīng)獲得歐洲藥監(jiān)局和美國藥監(jiān)局批準(zhǔn)上市銷售?；贏lbiglutide是2型 糖尿病患者的終身用藥，該融合蛋白藥物的上市銷售，顯示出重組人血清白蛋白融合蛋白 作為藥物使用，特別是作為長效藥臨床應(yīng)用，是沒有免疫原性擔(dān)憂問題了，僅是持續(xù)重組人 血清白蛋白融合蛋白在臨床上的治療療效是否符合臨床治療需求。高劑量GLP-1融合蛋白 的使用也再次證明體內(nèi)血液中過量的GLP-1不會(huì)產(chǎn)生低血糖現(xiàn)象，患者用藥的安全性表現(xiàn) 非常好。
[0013] 據(jù)此，本發(fā)明是在發(fā)明人已經(jīng)完成的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽2融合蛋 白（2個(gè)GLP-1多肽串聯(lián)后插入到人血清白蛋白氨基酸肽鏈的C端后所形成的融合蛋白） 和重組人胰高糖素類肽 2/血清白蛋白融合蛋白（2個(gè)GLP-1多肽串聯(lián)后插入到人血清白蛋 白氨基酸肽鏈的N端，所形成的融合蛋白）的酵母菌工程菌構(gòu)建和動(dòng)物藥效學(xué)評(píng)價(jià)工作的 基礎(chǔ)上，繼續(xù)圍繞著延長GLP-1多肽的血液半衰期，減少臨床注射用藥的劑量為研發(fā)方向， 以發(fā)明人擁有的重組人血清白蛋白融合蛋白藥物長效化技術(shù)平臺(tái)依托，在人血清白蛋白的 N端和C端同時(shí)各將2個(gè)GLP-1多肽串聯(lián)后的多肽無縫連接融合，獲得了一個(gè)意想不到的 更為優(yōu)秀的，生物活性更好的長效化胰高糖素類肽融合蛋白分子結(jié)構(gòu)。該融合蛋白可以以 更低藥物劑量，獲得更好、更長效的高血糖降低的臨床要求。新發(fā)明的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，在 體內(nèi)外的生物活性和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示其比類似的GLP-1藥物（如諾和諾德的利拉魯肽）的每 天給藥，可大大延長到每7天或每14天給藥一次。也比、GSK的Albiglutide的每周給藥 1次，給藥劑量為50mg，可以達(dá)到，使用劑量在10mg左右，就可達(dá)到7天給藥1次，或較高劑 量給藥后，可以達(dá)到14天給藥1次，將為患者帶來顯著的益處。這個(gè)發(fā)明將可極大地有利 于2型糖尿病患者的血糖控制，特別是2型糖尿病患者使用GLP-1類藥物是需要終身用藥 的時(shí)，面臨的問題（長期、點(diǎn)擊量給藥可能產(chǎn)生的抗體的問題）。
[0014] 本發(fā)明獲得了一個(gè)遠(yuǎn)優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)和現(xiàn)有研發(fā)中的GLP-1類似物藥物的分子結(jié) 構(gòu)和用途。本發(fā)明的研究結(jié)果還表明多種重組人血清白蛋白融合蛋白中的治療用蛋白質(zhì) (功能性）都可以使用這個(gè)技術(shù)，將2個(gè)治療性蛋白質(zhì)串聯(lián)后，分別或同時(shí)融合在人血清白 蛋白的兩端，來獲得較單一治療用蛋白質(zhì)分子與人血清白蛋白融合有更好的臨床上藥用治 療效果。當(dāng)通過給藥方式將重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白導(dǎo)入體內(nèi)（皮下注 射、靜脈灌注）進(jìn)入血液中，胰高糖素類肽融合蛋白可將血糖含量給予控制，可顯著降低血 液中的血糖含量，達(dá)到緩解和治療2型糖尿病患者的高血糖癥。
[0015] 重組人血清白蛋白融合蛋白形成長效重組蛋白藥物的技術(shù)是發(fā)明人的平臺(tái)專利 技術(shù)。它是將傳統(tǒng)治療性蛋白質(zhì)的基因與人血清白蛋白基因利用基因工程技術(shù)，將其相 連、重組，白蛋白修飾，并在酵母菌內(nèi)表達(dá)生產(chǎn)，從而獲得長效重組蛋白基因藥物。于在林自 1993年起就開始對(duì)這一系統(tǒng)進(jìn)行研究，并形成了多項(xiàng)研究結(jié)果。本專利技術(shù)表達(dá)重組蛋白 藥物由于不含有外源連接蛋白（Linker)，而可直接作為臨床治療用藥，而不產(chǎn)生抗體反應(yīng)， 在已有的動(dòng)物試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)（數(shù)千人次）中證明了這一點(diǎn)。這是一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán) 的新長效蛋白質(zhì)藥物研發(fā)技術(shù)平臺(tái)。新藥物分子結(jié)構(gòu)發(fā)明專利ZL021428816《對(duì)多種細(xì)胞 具刺激增生作用的人血清白蛋白重組融合蛋白》（人主要各種血細(xì)胞刺激因子、生長激素、 生長因子、白介素等）、ZL2004100428148《長效的人干擾素類似物》（已知干擾素種類）、和 ZL200710057571. 9《對(duì)多種皮膚細(xì)胞修復(fù)具長效性的人血清白蛋白重組融合蛋白》（重要的 各種皮膚細(xì)胞生長因子）等已分別獲得中國和美國發(fā)明專利（US7, 244, 833、US7, 442, 371、 US7, 572, 437、US8, 084, 021 和 US8, 603, 973)的正式授權(quán)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]
【發(fā)明人】通過研究和多次反復(fù)試驗(yàn)，在發(fā)明人已經(jīng)完成的治療用蛋白質(zhì)基因無縫連 接在人血清白蛋白基因的C端，形成多種長效化的治療用重組人血清白蛋白融合蛋白的基 礎(chǔ)發(fā)明后（包括重組人血清白蛋白與人血細(xì)胞刺激生成因子、人生長因子、生長激素、皮膚 細(xì)胞生長因子、GLP-1融合蛋白等），又完成構(gòu)建在人血清白蛋白基因 N端無縫連接治療用 蛋白質(zhì)基因，構(gòu)建長效化重組人血清白蛋白融合蛋白（人干擾素、人GLP-1)，其是與美國 HGSI的Albugon(Albiglutide),重組人胰高糖素類肽2/人血清白蛋白融合蛋白（rGLP-l 2/ HSA)的分子結(jié)構(gòu)完全相同的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研發(fā)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完成本發(fā)明，首次新構(gòu)建了在 人血清白蛋白的N端和C端同時(shí)含有治療用蛋白質(zhì)藥物分子。由4個(gè)GLP-1多肽和人血清 白蛋白形成的1個(gè)新的胰高糖素類肽融合蛋白新藥物分子結(jié)構(gòu)，并獲得意想不到的藥物作 用新功能。這個(gè)新一代的GLP-1類似物新藥分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是，在人血清白蛋白基因的N端 和C端分別各有由2個(gè)GLP-1多肽基因正向串聯(lián)在一起形成融合基因。由此完成的融合蛋 白新基因，經(jīng)分子克隆技術(shù)插入到畢赤酵母菌的基因組序列中，由此構(gòu)建了能表達(dá)重組人 血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白（rGLP-l 2/HSA/GLPl2)的畢赤酵母基因工程菌。該酵 母工程菌經(jīng)大規(guī)模高密度發(fā)酵驗(yàn)證可穩(wěn)定持續(xù)地表達(dá)生產(chǎn)該等融合蛋白。經(jīng)規(guī)模化發(fā)酵， 重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白分泌到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，經(jīng)發(fā)明人研發(fā)的技術(shù) 分離純化技術(shù)獲得符合制藥要求的原料藥（原液）。初步純化的原料藥在動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 證明了含有4個(gè)GLP-1多肽的重組人血清白蛋白多肽融合后，這個(gè)自然界中沒有，一個(gè)全新 人工發(fā)明的融合蛋白分子結(jié)構(gòu)，可顯著顯示降低動(dòng)物體內(nèi)血液中的血糖含量，并比僅在人 血清白蛋白的C端或N端含有2個(gè)GLP-1多肽串聯(lián)的重組人血清白蛋白融合蛋白的生物活 性要有顯著增強(qiáng)和更長的血液半衰期，可望達(dá)到每7-14天給藥1次，維持體內(nèi)穩(wěn)定的血糖 濃度。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)該新分子結(jié)構(gòu)融合蛋白具有與比治療性蛋白單體更強(qiáng)的摩爾生物活性。 而更適用于臨床上用于2型糖尿病患者疾病的治療或?yàn)閱渭儨p肥目要求目的用途，由此完 成了本發(fā)明。
[0017] 本發(fā)明所涉及的人胰高糖素類肽（GLP-1)，包括但不局限于，GLP-1 (氨基酸序列 7-36)、GLP-1 (氨基酸序列7-37)、單分子GLP-1試驗(yàn)顯示不如雙分子GLP-1串聯(lián)后穩(wěn)定和 也不影響與GLP-1特異受體結(jié)合的能力。同時(shí)，GLP-1蛋白質(zhì)多肽中的氨基酸替換，發(fā)生此 等氨基酸替換的也可達(dá)到為了增強(qiáng)GLP-1生物活性、為了延長其在血液半衰期、為了增強(qiáng) GLP-1多肽與細(xì)胞GLP-1受體結(jié)合強(qiáng)度的目的。發(fā)生氨基酸修飾或改變所形成的各種GLP-1 分子結(jié)構(gòu)，通稱為"GLP-1類似物"，均可以與人血清白蛋白形成融合蛋白。下面就GLP-1類 似物的特性分別簡述如下：
[0018] 1、人胰高糖素類肽（GLP-1) :GLP_1是由人胰高血糖素基因編碼，并由腸道L細(xì)胞 分泌的一種肽類激素，其生理能有利于降低餐后血糖并使血糖維持在恒定水平。完整的全 長氨基酸序列的GLP-1不適合用作開展各種研究工作和獲得臨床藥物，而其N端的7-36氨 基酸是GLP-1生物活性部分。因此，藥物研發(fā)確定集中在這30個(gè)氨基酸序列。
[0019] 2、人胰高糖素類肽（GLP-1)類似物：在GLP-1蛋白質(zhì)的氨基酸全長肽鏈中，僅氨基 酸第7-36或7-37氨基酸肽鏈區(qū)域才具有控制人體血糖的調(diào)節(jié)作用。因此這個(gè)區(qū)間的氨基 酸短肽鏈被用于開發(fā)和形成多種藥用產(chǎn)品。可形成藥用的GLP-1的7-37片段，稱為GLP-1 類似物。同時(shí)該區(qū)域的氨基酸肽鏈?zhǔn)强梢愿鶕?jù)不同臨床藥用目的來設(shè)計(jì)個(gè)別氨基酸的替 換、刪除和增加，或者個(gè)別氨基酸可與不同的化合物連接，達(dá)到不同的藥物設(shè)計(jì)目的。特別 是研究表明GLP-1多肽中的第8位氨基酸由Gly來替換Ala時(shí)，這樣的GLP-1類似物與人 體細(xì)胞上的GLP-1受體結(jié)合效果最好，由此形成了以后多種GLP-1類似物的原型藥物分子 結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。初期形成的藥物有百時(shí)美施貴寶和阿斯利康的百泌達(dá)（艾塞那肽）和 Bydureon (艾塞那肽），以及賽諾菲的Lyxumia (利西拉肽），都是每天給藥或需要靜脈滴注 給藥來達(dá)到治療目的。半衰期一般2min-4小時(shí)不等。其后諾和諾德開發(fā)成功了利拉魯肽 就是與人GLP-1分子結(jié)構(gòu)（7-36)相比有兩處差別，首先氨基酸肽鏈中C16脂肪酸鏈在第26 位上通過谷氨酸連接到賴氨酸K上。其次，在第34位上的賴氨酸K被精氨酸R所替代，以 確保C16側(cè)鏈只能結(jié)合在第26位上。脂肪酸側(cè)鏈可以使利拉魯肽在血夜中與白蛋白可逆 性地結(jié)合，使利拉魯肽的作用時(shí)間延長，且增強(qiáng)對(duì)DPP-4酶降解的抵抗，脂肪酸側(cè)鏈還可以 使利拉魯肽分子在注射部位自交聯(lián)成七聚體，從而延緩其自皮下吸引，使其作用時(shí)間可長 達(dá)接近24小時(shí)。
[0020] 3、GLP-1類似物融合蛋白：美國Eli Lilly (禮來）制藥集團(tuán)司研發(fā)的 dulaglutide是2個(gè)GLP-1多肽串聯(lián)后與人Fc抗體片段形成融合蛋白，目前正在開展臨床 試驗(yàn)III期研究中，該融合蛋白達(dá)到每周給藥1次，除血糖獲得控制外，體重也獲得顯著控 制，而對(duì)照藥甘精胰島素組體重均有所增加。
[0021] 4、人血清白蛋白C-端直接融合2個(gè)串聯(lián)的GLP-1多肽所形成的融合蛋白：本發(fā)明 人將2個(gè)GLP-1多肽以串聯(lián)的方式直接經(jīng)基因工程技術(shù)無縫連接到人血清白蛋白氨基酸肽 鏈的C末端，而形成的重組人血清白蛋白/61^-1 2融合蛋白。在這個(gè)分子結(jié)構(gòu)中與發(fā)明人 的其它重組人血清白蛋白融合蛋白的較高相同，人血清白蛋白的氨基酸肽鏈這的氨基酸沒 有任何改變，與天然狀態(tài)完全一致，GLP-1的7-36氨基酸序列中也僅是第8個(gè)氨基酸給予 替換，由Gly替換了 Ala。并且將這兩個(gè)GLP-1類似物直接串聯(lián)。由此形成了重組人血清白 蛋白/胰高糖素類肽2融合蛋白。
[0022] 5、人血清白蛋白N-端直接連接2個(gè)串聯(lián)的GLP-1多肽，并且使用人血清白蛋白的 分泌肽來分泌成熟的重組胰高糖素類肽 2/白蛋白融合蛋白。這個(gè)融合蛋白的氨基酸序列 與美國HGSI公司的設(shè)計(jì)Albugon，經(jīng)GSK公司全資收購后改名為Albiglutide的藥物分子 結(jié)構(gòu)完全相同。
[0023] 胰高糖素類肽在人體血液中的半衰期僅有2-5分鐘，不利于直接在需要中返回其 生物學(xué)功能，近年來的研究均是集中于延長達(dá)到GLP-1的生物學(xué)作用功能。GLP-1的血液半 衰期，或者是篩選或合成小分子化合物來特別抑制酶解GLP-1的生物酶的活性，達(dá)到使得 GLP-1的血液中的半衰期獲得延長提高GLP-1的穩(wěn)定性。將串聯(lián)的GLP-1肽鏈分別連接到 人血清白蛋白的N端或C端都可以獲得GLP-1的長效化，那么任何能獲得更長效、可使用更 低劑量融合蛋白，而達(dá)到更理想的臨床治療目的效果，是本發(fā)明的目的。
[0024] 因此，本發(fā)明涉及如下幾個(gè)方面：
[0025] 1)重組人血清白蛋白與胰高糖素類肽融合蛋白
[0026] 本發(fā)明提供一種用基因工程方法生產(chǎn)的人血清白蛋白（HSA)和胰高糖素類肽 (GLP-1)所形成的融合蛋白，該融合蛋白是由核苷酸編碼的HSA和一種GLP-1類似物的雙 分子、多分子肽鏈經(jīng)串聯(lián)后形成的多重復(fù)合結(jié)構(gòu)，然后分別與人血清白蛋白的N端、C端或 同時(shí)直接連接，連接部位設(shè)有或不設(shè)有連接肽，連接的長度可以是1-50個(gè)氨基酸，也可以 是帶有GLP-1重復(fù)氨基酸序列或是無縫連接形成的融合蛋白，即rGLP-h VHSA/GLP-li n、或 rGLP-h n/HSA或rHSA/GLP-h n形成的融合蛋白，η = 2至10,即2-10個(gè)GLP-1多肽的重 復(fù)。根據(jù)本發(fā)明的方法，任何一種GLP-1或其變異體均可與HSA形成一種重組人血清白蛋 白融合蛋白。
[0027] 本發(fā)明的GLP-1可以是下列GLP-1類似物蛋白質(zhì)類別中的任何一員，包括但不 局限于，胰島素、類 GLP-1、希拉毒蜥 Exendin-3、Exendin-4(rExendin_4)、GLP-1 類似物、 GLP-1天然氨基酸序列、GLP-1氨基酸序列發(fā)生變異、替換、刪減、增加、等。
[0028] GLP-1可以直接以N末端與HSA的C-末端相連以構(gòu)成融合蛋白，或可在HSA和 GLP-1之間增加一個(gè)連接肽（Linker)，以構(gòu)成融合蛋白：rHSA/L/GLP-l2或GLP-12/L/HSA(L =連接肽）。連接肽長度可為2-100,常用的是10-50個(gè)氨基酸，優(yōu)選的是14-30個(gè)氨基酸。 連接短肽可以使HSA和GLP-1之間有更大的變化空間并有更好的柔韌性或剛性，或因更大 的變化空間使GLP-1與受體的結(jié)合更容易些。連接肽的結(jié)構(gòu)可為（G 4S)ln，n可以是2-100。 連接肽的加入可能使融合蛋白在作為藥物的使用時(shí)產(chǎn)生額外的免疫原性，因此，最優(yōu)選的 是在HSA和GLP-1之間不設(shè)有連接肽。
[0029] 融合蛋白可以是分泌型的，其可與特異識(shí)別抗人血清白蛋白抗體相結(jié)合。融合蛋 白也可與特異識(shí)別GLP-1的抗體相結(jié)合。
[0030] 融合蛋白的分泌肽可使用人血清白蛋白的分泌肽或其自然界中存在的多肽或是 人工合成的具有將融合蛋白分泌到宿主細(xì)胞外功能的多肽。
[0031] 具體地，本發(fā)明利用遺傳工程方法構(gòu)建了一條核苷酸鏈，該核苷酸鏈編碼一種HSA 與人GLP-1類似物所形成的融合蛋白（rGLP-l2/HSA/GLP-l2)，編碼該融合蛋白的核苷酸鏈 中的人血清白蛋白序列與Seq ID No. 7有至少90%的序列同源性，優(yōu)選的該核苷酸鏈與Seq ID No. 7有95%的序列同源性。由該核苷酸鏈編碼的成熟肽的氨基酸序列為Seq ID No. 8 具有至少95%的序列同源性。編碼該融合蛋白的核苷酸鏈中的胰高糖素類肽GLP-1序列與 Seq ID No. 3有至少90%的序列同源性，優(yōu)選的該核苷酸鏈與Seq ID No. 3有95%的序列 同源性。由該核苷酸鏈編碼的蛋白質(zhì)多肽的氨基酸序列為Seq ID No. 4有至少90%的序 列同源性，優(yōu)選的該蛋白質(zhì)氨基酸序列與Seq ID No. 4有95%的序列同源性。其中編碼該 融合蛋白的核苷酸鏈中的胰高糖素類肽GLP-1序列，可以是單獨(dú)的GLP-1肽鏈，可以是2個(gè) GLP-1肽鏈串聯(lián)后構(gòu)成雙重復(fù)，可以是η個(gè)GLP-1肽鏈的串聯(lián)重復(fù)序列，但是試驗(yàn)表明1個(gè) GLP-1和3個(gè)或3個(gè)以上的GLP-1串聯(lián)與GLP-1受體相結(jié)合的能力都顯著比2個(gè)GLP-1串 聯(lián)時(shí)的結(jié)合能力都要低得多。因此優(yōu)選地是2個(gè)GLP-1的串聯(lián)。串聯(lián)后的GLP-1多肽鏈可 以是處于人血清白蛋白的Ν端，也可以是處于人血清白蛋白的C端，優(yōu)選地是同時(shí)在人血清 白蛋白的Ν和C端各有1個(gè)串聯(lián)的GLP-1，并且是直接連接，之間不設(shè)有連接肽（Linker)。
[0032] 與上述的核苷酸有一定程度的序列相似性的核苷酸是指：例如，能編碼一種 rGLP-l2/HSA/GLP-l2融合蛋白，并在相似的核苷酸序列之間具有至少95%的序列同源性的 核苷酸。其包括核苷酸鏈上每百個(gè)核苷酸有5個(gè)點(diǎn)突變，并也是編碼rGLP-l 2/HSA/GLP-l2 融合蛋白的核苷酸序列。換句話講，任何核苷酸鏈與上述編碼rGLP-l2/HSA/GLP-l2融合蛋 白的核苷酸鏈具有95%的序列同源性，即，即便有多達(dá)5%的核苷酸個(gè)體可以被替換、刪減 或插入等，均與本發(fā)明所指的核苷酸序列相同。無論是在核苷酸序列的5'或3'端，或在兩 端之間的任何位點(diǎn)發(fā)生的突變，還是以單體或多體發(fā)生的突變均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0033] 實(shí)踐上，任何特指的核酸分子，只要具有90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的相 似性，就在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。而且由核苷酸序列編碼的glp-i2/hsa/glp-i2融合蛋白也 可由常規(guī)已知的計(jì)算機(jī)軟件，如Bestfit軟件（Wisconsin)序列分析軟件包來獲得。Bestfit 應(yīng)用區(qū)域同源性比較方法（文獻(xiàn)：Smith和Waterman，應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展，2 :482-489(1981)來 尋找兩個(gè)序列之間最佳的同源序列。當(dāng)應(yīng)用該軟件或其它任何具有類似的DNA序列對(duì)比分 析時(shí)，某一特定的序列如與本發(fā)明所提出的序列有95%以上的序列同源性，均視為與本發(fā) 明所述的序列相同源。
[0034] GLP-1基因序列可以從不同組織來源的總RNA中用PCR擴(kuò)增的方法獲得，也可以 用人工合成全DNA序列的方法來獲得。人工合成的基因在其核苷酸編碼同一氨基酸是可采 用表達(dá)系統(tǒng)偏好、喜好的核苷酸編碼序列。rGLP-l 2/HSA/GLP-l2融合蛋白表達(dá)重組酵母菌 已保藏。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC);保藏編號(hào)： CGMCC No. 9645 ;分類命名：巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris ;保藏單位地址：北京中科院 微生物所；保藏日期：2014年9月11日。作為本發(fā)明中的rGLP-l2/HSA/GLP-l 2融合蛋白的 代表作。
[0035] 在室溫或更高的溫度下，HSA和GLP-1形成的融合蛋白與GLP-1單體相比，在同樣 條件下，具有2倍以上，優(yōu)選達(dá)5倍或10倍或更優(yōu)選達(dá)20倍以上的貯存期和半衰期。
[0036] 本發(fā)明還涉及用白蛋白作為載體，攜帶治療性的蛋白質(zhì)藥物，如GLP-1來來在臨 床上用于血糖控制、心血管、體重控制等疾病或異常的治療或改善為目的的人，如21型糖 尿病患者可用于終身用藥來控制高血糖癥狀、心血管疾病異常患者，以及以控制體重、減輕 體重為目的的人。在本發(fā)明中，rGLP-l 2/HSA/GLP-l2融合蛋白可以用于脊椎動(dòng)物，優(yōu)選地是 人類，并通過不同途徑，包括但不局限于涂抹、噴涂、口服、非經(jīng)腸胃、腹腔膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng) 脈內(nèi)、皮下、舌下、肌內(nèi)、腸內(nèi)、唾液腺、鼻內(nèi)、PEG化、脂質(zhì)法，通過吸入、注射、陰道、眼內(nèi)方法 給藥。rGLP- 12/HSA/GLP-12也可通過局部性釋放（如導(dǎo)管或Stent)，包括皮下、脂肪下、關(guān)節(jié) 下及膜內(nèi)，并可以做成緩釋劑。具體地，融合蛋白可通過注射、灌注、口服、涂抹、噴涂給藥。
[0037] 本發(fā)明涉及將一個(gè)白蛋白分子或其變種或片段與2個(gè)GLP-1分子或其變種或片段 通過基因工程融合在一起，所形成的融合蛋白較未經(jīng)融合的GLP-1延長了半衰期。為方便 起見，本發(fā)明只提及人血清白蛋白（HSA)和GLP-1形成的融合蛋白，但GLP-1的結(jié)構(gòu)類似 物均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，在1個(gè)GLP-1或其變種或片段的C-末端部分與另1 個(gè)GLP-1的N端連接，然后與HSA或其變種的成熟多肽的N端直接連接融合或與HSA或其 變種的成熟多肽的C-末端部分直接連接形成融合蛋白。在融合蛋白與受體結(jié)合時(shí)所有負(fù) 效應(yīng)達(dá)最小化。同樣具有信號(hào)傳導(dǎo)、受體結(jié)合作用的由GLP-1功能相似、結(jié)構(gòu)相似的GLP-1 類似物形成的融合蛋白均包括在本發(fā)明中。
[0038] 本發(fā)明中的rGLP-l2/HSA/GLP-l2融合蛋白或由其作為原料藥（原液）經(jīng)制劑配 方獲得的成品均可通過傳統(tǒng)方法，包括非經(jīng)胃腸道（如皮下或肌肉）注射或靜脈輸注的方 式給藥。治療包括在一段時(shí)間內(nèi)使用單一劑量或復(fù)合劑量。本發(fā)明中的融合蛋白rGLP-l 2/ HSA/GLP-12可單獨(dú)使用，而優(yōu)選地，可與一種或多種可接受的藥物，如甘精胰島素、賴脯胰 島素或另一種rHSA/GLP-l 2或HSA或多種rGLP-l2/HSA -起成藥物制劑的形式使用。所述 載體特別是另一種藥物必需是相互兼容的且對(duì)受體自身不產(chǎn)生有害影響的載體。"可接受 的"典型的載體為水和鹽水，其應(yīng)是無菌、無熱原也無額外免疫原性的。不同融合蛋白之間， 當(dāng)具有相容性、協(xié)同增效性或僅起協(xié)助制劑作用時(shí)，也可考慮共同使用。
[0039] 本發(fā)明公開的rGLP-l2/HSA/GLP_l2融合蛋白可以制劑形式或單元?jiǎng)┝康谋憬莘?式給藥，也可經(jīng)由任何藥學(xué)領(lǐng)域已知和認(rèn)可的方法制備，該方法包括將rGLP-l 2/HSA/GLP-l2 與具有一種或多種輔助成份的載體、醫(yī)用輔料結(jié)合到一起的步驟。概括地講，將活性成分和 液相載體或組合固相載體、助劑或其它試劑均勻地結(jié)合而制備制劑，然后根據(jù)需要，將產(chǎn)品 成型。
[0040] 適合于非經(jīng)胃腸道途徑使用的rGLP-l2/HSA/GLP-l2制劑包含水相或不含水相的 無菌注射液，可含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和助溶劑、或增加藥物滲透性與平衡劑。含水或 不含水的無菌懸浮液包括懸浮劑和增稠劑。該制劑可貯存于單元?jiǎng)┝炕蚨嘣獎(jiǎng)┝康娜萜?中，如密封的安瓿瓶中和小管中，在冰干（凍干法）條件下貯存。使用前加入無菌液態(tài)載體， 如注射用水，制成臨時(shí)性注射液和懸浮液。
[0041] 將 rGLP-l2/HSA/GLP-l2 融合蛋白送入動(dòng)物體內(nèi)后，與 rGLP-l2/HSA 或 rHSA/GLP-l2 相比，rGLP-l2/HSA/GLP-l2在血液中的半衰期具有長約2倍，優(yōu)選地是長約4倍，更優(yōu)選地 為長約6倍，再更優(yōu)選為長約10倍的半衰期。本發(fā)明的rGLP-l 2/HSA/GLP-l2融合蛋白可以 與由自然界分離的或重組型的人血清白蛋白共同使用。優(yōu)選與重組的人血清白蛋白組成具 有療效的劑量和比率。
[0042] 將 rGLP-l2/HSA/GLP-l2 融合蛋白送入動(dòng)物體內(nèi)后，與 rGLP-l2/HSA 或 rHSA/GLP-l2 相比，rGLP-l2/HSA/GLP-l2在獲得相同血糖控制作用的給藥劑量上具有減少用藥劑量的2 倍，優(yōu)選地是減少用藥劑量的4倍，更優(yōu)選地減少用藥劑量的6倍，再更優(yōu)選地減少用藥劑 量的10倍。
[0043] 人血清白蛋白的N端和C端同時(shí)與GLP-12融合后（rGLP-l2/HSA/GLP-l 2)，構(gòu)建和 表達(dá)的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白中的治療性蛋白質(zhì)GLP-1要有長的血液 半衰期，與Fc抗體片段形成的GLP-1融合蛋白相比，與rHSA/GLP-l 2融合蛋白或rGLP-l2/ HSA的單末端融合所形成的融合蛋白相比，也可以顯著地以較少的用藥劑量獲得在血液中， 在受體作用部位上可較長的停留時(shí)間。較長半衰期也可達(dá)到減少藥物的使用劑量和使用次 數(shù)。在制成的產(chǎn)品時(shí)貯存條件和運(yùn)輸?shù)囊蠼档?，也可以降低成本?br>[0044] 本發(fā)明獲得的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白具有與胰高糖素類肽 (GLP-1)相同的生物功能，具有這種生物功能是指融合蛋白可在體內(nèi)與GLP-1受體結(jié)合和 活化GLP-1受體，并產(chǎn)生生物反應(yīng)，這種生物反應(yīng)包括但不局限于刺激機(jī)體相關(guān)細(xì)胞分泌 胰島素、抑制胰高血糖、降低甘油三脂的水平（含量）、增加外周組織對(duì)葡萄糖的利用、抑 制食欲、抑制生物在胃腸道中的吸收、誘導(dǎo)飽腹感、減輕體重、抑制胰島細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)胰 β (bata)細(xì)胞增值以及增強(qiáng)胰β細(xì)胞的分化，融合蛋白具有長效性。這是本發(fā)明的醫(yī)用和 應(yīng)用價(jià)值。
[0045] 2)用于rGLP-l2/HSA/GLP-l2融合蛋白表達(dá)的宿主系統(tǒng)
[0046] 本發(fā)明中的rGLP-l2/HSA/GLP_l2核苷酸可利用重組克隆技術(shù)引入宿主細(xì)胞，以使 融合蛋白得以表達(dá)。一般來說，宿主細(xì)胞經(jīng)遺傳工程（轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染）方法將攜帶有本 發(fā)明中所提到的各種可能組合的rGLP-l 2/HSA/GLP-l2載體質(zhì)粒以侵入方式、病毒感染"噬 菌體"等形式轉(zhuǎn)入宿主系統(tǒng)中。工程宿主細(xì)胞可以在含常規(guī)營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并經(jīng) 過適當(dāng)修改以利于啟動(dòng)子。以適當(dāng)?shù)牟僮鞣绞娇刂七x擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼rGLP-l 2/HSA/ GLP-12的核苷酸鏈的培養(yǎng)條件，如溫度，pH和選擇表達(dá)細(xì)胞。
[0047] 按本發(fā)明所述，重組載體攜帶有包含編碼rGLP-l2/HSA/GLP_l 2融合蛋白的核苷 酸。重組載體可以是一個(gè)表達(dá)載體，可在宿主細(xì)胞內(nèi)由攜帶的核苷酸編碼來表達(dá)融合蛋白。 形式可為，但不局限于，rGLP-l2/HSA/GLP-l2、rGLP-l2/HSA、rHSA/GLP-l 2 或 rGLP-l2/L/HSA、 rHSA/L/GLP-l2(L =連接肽）。宿主生物體及體細(xì)胞包括，但不局限于，脊椎動(dòng)物（如人、猴、 鼠、兔等）魚、雞、昆蟲、植物、酵母、真菌和細(xì)菌等。
[0048] 編碼rGLP-l2/HSA/GLP-l2的核苷酸是在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子作用下表達(dá)rGLP-l 2/HSA/ 〇1^-12融合蛋白?？衫玫倪m合啟動(dòng)子包括，但不局限于，腺病毒啟動(dòng)子，如腺病毒主要的 后期啟動(dòng)子；或異源啟動(dòng)子，如CMV啟動(dòng)子和RSV啟動(dòng)子；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可有MMT啟動(dòng)子、 熱刺激啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子、ΑροΑΙ啟動(dòng)子和人球蛋白啟動(dòng)子；病毒胸腺嘧啶脫氧核苷酶 啟動(dòng)子則有皰疹病毒胸腺激酶啟動(dòng)子；反轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子包括經(jīng)修飾后的LTR啟動(dòng)子； β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；人生長激素啟動(dòng)子。也可用天然啟動(dòng)子來控制核苷酸編碼表達(dá)HSA/ GF融合蛋白。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明，重組細(xì)胞具有表達(dá)編碼rGLP-l2/HSA/GLP_l2融合蛋白核酸序列的能 力。重組工程細(xì)胞可以持續(xù)地或在有或無誘導(dǎo)劑的存在狀態(tài)下表達(dá)rGLP-l 2/HSA/GLP-l2。 重組工程細(xì)胞形式包括，但不局限于脊椎動(dòng)物（即人、牛、豬、猴、鼠、兔、魚、雞等）昆蟲、植 物、酵母、真菌和細(xì)菌等細(xì)胞。
[0050] 優(yōu)選的用于表達(dá)rGLP-l2/HSA/GLP-l2的酵母屬宿主包括，但不局限于，釀酒酵 母屬（Saccharomyces)、畢氏（赤）酵母屬（Phichia)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、 念珠菌屬（Candida)、漢森酵母（Hancenula)、孢園酵母屬（Tarulaspora)和裂殖酵母屬 (Schizosaromyces)等。更優(yōu)選地，宿主系統(tǒng)可為畢氏酵母屬巴斯德菌種。具體地講重組載 體質(zhì)?？蔀閜PICZ-A、B或C。
[0051] 根據(jù)選用不同的宿主來表達(dá)冗1^-12/批六/61^-12融合蛋白。本發(fā)明中表達(dá)的蛋 白多肽可以是糖基化或非糖基化的。優(yōu)選地，當(dāng)在宿主系統(tǒng)中得到表達(dá)時(shí)，rGLP-l 2/HSA/ GLP-12在脊椎動(dòng)物細(xì)胞如中國倉鼠（CH0)中得到表達(dá)的蛋白為糖基化蛋白。當(dāng)表達(dá)在畢氏 酵母菌中則為非糖基化或部分糖基化的蛋白。
[0052] 如上所述，在本發(fā)明中提到的白蛋白融合蛋白，優(yōu)選使用基因工程技術(shù)構(gòu)建來表 達(dá)。獲得融合蛋白的優(yōu)選方法是利用載體質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染或感染的方式來表達(dá)融合 蛋白。特別是利用可轉(zhuǎn)化酵母的表達(dá)載體，來轉(zhuǎn)化畢氏酵母，并使融合蛋白分泌到培養(yǎng)液 中。
[0053] 利用酵母菌表達(dá)rGLP-l2/HSA/GLP_l2的優(yōu)勢在于，酵母菌體系可以產(chǎn)生高質(zhì)量成 熟的融合蛋白，并可以分泌到培養(yǎng)液中而便于純化。
[0054] 酵母菌遺傳工程的進(jìn)展使外源基因可以在酵母菌中得到表達(dá)并分泌蛋白產(chǎn)品到 細(xì)胞外。利用酵母菌表達(dá)分泌型蛋白的優(yōu)點(diǎn)為，但不局限于，高表達(dá)產(chǎn)量、蛋白質(zhì)為可溶性 的、正確的折迭和易于大規(guī)模生產(chǎn)和純化。
[0055] 經(jīng)由白蛋白天然信號(hào)肽，rGLP-l2/HSA/GLP-l2融合蛋白可分泌到酵母菌培養(yǎng)液中。 rGLP-l2/HSA/GLP-l2融合蛋白的多肽可由信號(hào)肽主導(dǎo)并通過分泌途徑而得到加工。白蛋白 的前導(dǎo)肽序列可用在酵母菌中，使融合蛋白分泌到酵母菌外。其它分泌肽，如天然的釀酒 酵母的α -因子分泌信號(hào)肽，也可用于分泌本發(fā)明中的融合蛋白。
[0056] 優(yōu)選實(shí)例為應(yīng)用巴斯德酵母菌系統(tǒng)來表達(dá)本發(fā)明中提及的rGLP-l2/HSA/GLP-l 2 融合蛋白。其優(yōu)于利用其它表達(dá)系統(tǒng)。畢氏酵母菌具有許多高等真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所具有 的優(yōu)點(diǎn)，例如蛋白質(zhì)的加工、折迭、轉(zhuǎn)錄后的修飾以及如同培養(yǎng)細(xì)菌或釀酒酵母一樣的易于 大規(guī)模培養(yǎng)，與其它系統(tǒng)如桿狀病毒、脊椎動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)相比更具有簡捷、快速的表達(dá)，產(chǎn) 量更高。畢氏酵母還有另外一個(gè)優(yōu)勢是具有10-100倍高的表達(dá)水平。這些特性使得畢氏 酵母變成十分有力的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。
[0057] 與釀酒酵母菌相比，畢氏酵母菌在對(duì)分泌的蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化的程度上有著更大 的優(yōu)點(diǎn)。即：畢氏酵母不會(huì)有過度糖基化的現(xiàn)象。釀酒酵母和畢氏酵母均有N-連接糖基甘 露糖的修飾。然而寡糖化物鏈加在表達(dá)的蛋白上，在畢氏酵母菌中只有8-14個(gè)糖基，遠(yuǎn)短 于在釀酒酵母中的50-150甘露糖鏈。在畢氏酵母菌中連接的糖基化較少發(fā)生。釀酒酵母 的核心糖基化帶有α-1，3連接的末端物，而在畢氏酵母菌中則沒有。研究表明由釀酒酵母 產(chǎn)生的糖基化蛋白具有較強(qiáng)的抗原反應(yīng)，而使得這些蛋白不適于用在特別是治療目的上的 使用。當(dāng)然這也表明減少了用畢氏酵母菌來表達(dá)蛋白在糖基化上的擔(dān)憂。
[0058] 利用畢氏酵母做為表達(dá)系統(tǒng)有許多試劑盒可以使用。如Invitrogen的易選 EasySelect?畢氏酵母表達(dá)試盒。表達(dá)載體上有一個(gè)A0X1啟動(dòng)子可以使外源基因在畢氏 酵母中利用甲醇來誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)還有一個(gè)抗生素 Zeocin抗性基因，可做為選擇重組子的 標(biāo)記。在本發(fā)明中，表達(dá)融合蛋白啟動(dòng)子是非常重要的因素。
[0059] 在畢氏酵母系統(tǒng)中，A0X1基因啟動(dòng)子是十分強(qiáng)勁的啟動(dòng)子。特別是在畢氏酵母菌 中，在畢氏酵母里共編碼兩種乙醇氧化酶，A0X1和A0X2。A0X1具有在細(xì)胞中產(chǎn)生合成大 量的乙醇氧化酶（A0X1)的活性。A0X1基因的表達(dá)受到緊密控制并由甲醇誘導(dǎo)而達(dá)到極高 的水平。典型地當(dāng)用甲醇做為唯一碳源時(shí)，在所有的可溶性蛋白中A0X1基因的產(chǎn)物就達(dá) 30%。A0X1基因已分離得到。A0X1基因啟動(dòng)子也用于本發(fā)明的載體質(zhì)粒中用以驅(qū)動(dòng)編碼目 的基因的外源蛋白的表達(dá)（Ellis等，1985 ;Koutz等，1989，Tschopp等，1987a)。而A0X2和 A0X1基因有97%的同源性，其在甲醇中的生長速度比A0X1基因慢。這種緩慢的生長狀態(tài)， 可以分離到Mut+(A0X1)株。除了 A0X1基因啟動(dòng)子外，酵母菌中的其它啟動(dòng)子也可用于驅(qū) 動(dòng)HSA/GF融合蛋白。這些啟動(dòng)子包括，但不局限于PGK1、GAPDH、Gal 1、Cal 10、Cyc 1、PH05、 TRP1、ADH1或ADH2基因啟動(dòng)子。
[0060] 表達(dá)質(zhì)粒也可同時(shí)用于細(xì)菌宿主，如大腸肝菌DH5a (Gibcol/BRL)和酵母宿主 中。抗生素 Zeocin、組氨酸缺陷型培養(yǎng)基作為選擇標(biāo)記已應(yīng)用在本發(fā)明的各實(shí)施例中。
[0061] 表達(dá)載體含有編碼HSA或HSA/GF融合蛋白的核苷酸，按Invitrogen試劑盒所描 述的方法轉(zhuǎn)化酵母菌。經(jīng)過抗性選擇出轉(zhuǎn)化的酵母菌菌落。這些細(xì)胞可表達(dá)HSA/GF融合 蛋白，當(dāng)接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液中時(shí)，分析這些酵母菌表達(dá)分泌融合蛋白于培養(yǎng)基中的能力。 蛋白質(zhì)的收獲可在細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)中進(jìn)行?；蛟谂颗囵B(yǎng)結(jié)束后一并收獲，本發(fā)明所述的融 合蛋白經(jīng)培養(yǎng)的酵母菌表達(dá)后，以能維持蛋白活性和藥效活性的蛋白提純方法來加以分離 純化。
[0062] 在此還需提及的是，其它表達(dá)系統(tǒng)也可用于本發(fā)明的rGLP-l2/HSA/GLP-l 2融合蛋 白的表達(dá)，包括，但不局限于，細(xì)菌、枯草桿菌（B.Subtitis)、釀酒酵母、克魯維酵母菌屬、漢 森酵母、念珠菌屬、孢圓酵母屬、裂殖酵母屬、固囊酵母屬（Citeromyces)、Pachysoler，德 巴利酵母屬（Debaromyces)、梅奇酵母屬（Metschumikowia)、紅冬抱屬（Rhodosporidium)、 無色擔(dān)子孢子屬（Leucosporiduum)、葡狀子囊菌屬（Botryoascus)、鎖擲酵母屬 (Sporidiobolcus)、擬內(nèi)孢霉屬（Endomyucopsis)、動(dòng)物、植物和昆蟲細(xì)胞等。
[0063] 3) rGLP-l2/HSA/GLP-l2融合蛋白的分離純化
[0064] 本發(fā)明也提供了利用酵母菌來更有效地及節(jié)省費(fèi)用地生產(chǎn)制造重組的rGLP-l2/ 批八/61^-12融合蛋白。本發(fā)明也以實(shí)施例的方式提供和公開了表達(dá)這種新創(chuàng)造的長效 GLP-1類似物融合蛋白的畢赤酵母工程菌的噸級(jí)規(guī)?；l(fā)酵工藝和融合蛋白分離純化的方 法。這種技術(shù)也可用于融合蛋白的生產(chǎn)和制備符合臨床用藥標(biāo)準(zhǔn)的3種不同藥物分子結(jié)構(gòu) 的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白，藥物分子結(jié)構(gòu)分別為：rGLP-l 2/HSA、rHSA/ GLP-12 或 / 和 rGLP-l2/HSA/GLP-l2。
【附圖說明】
[0065] 附圖1.重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白（rGLP-l2/HSA/GLP-l2)在N端 的人工合成帶有人血清白蛋白（HSA)分泌肽直接連接串聯(lián)的2個(gè)人胰高糖素類肽（GLP-12) (重復(fù)氨基酸7-36,8Gly)的DNA核苷酸序列，以及其與人血清白蛋白成熟肽的N端直接連 接的正向測序結(jié)果圖。圖中重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白新藥物分子結(jié)構(gòu) GLP-12/HSA/GLP-12的基因5'端（氨基酸序列N端的基因 DNA序列）測序結(jié)果圖。該端DNA序 列包括了人血清白蛋白分泌肽（Nt63-134)直接與串聯(lián)的2個(gè)GLP-1基因序列（Ntl35-314) 連接后再與人血清白蛋白成熟肽的N端（Nt315_)直接連接。DNA序列中以Hindlll限制性 內(nèi)切酶（Nt57-62)為新藥物分子結(jié)構(gòu)基因序列克隆起始位點(diǎn)。
[0066] 附圖2.重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白（rGLP-l2/HSA/GLP-l2)在人 血清白蛋白成熟肽C端直接連接串聯(lián)的2個(gè)人胰高糖素類肽（GLP-12)(重復(fù)氨基酸7-36， 8Gly)以及2個(gè)重復(fù)終止子密碼（TGATAA)的DNA核苷酸序列的正向測序結(jié)果圖。該正向 DNA片段中還帶有用于克隆和基因拼接用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（HSA的C末端含有的Bsu 361 和 Xho I)。
[0067] 附圖3.重組人血清白蛋白以及3種不同藥物分子結(jié)構(gòu)的重組人血清白蛋白/胰 高糖素類肽融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。（A) :rHSA ; (B) :rGLP-l2/HSA ; (C) :rHSA/GLP-l2 ; (D): rGLP-l2/HSA/GLP-l2〇
[0068] 附圖4.條帶Μ :蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量、條帶A :酵母工程菌表達(dá)的重組人血清白蛋白 (rHSA)，分子量~66kD ;條帶B :酵母工程菌表達(dá)的人血清白蛋白C端與串聯(lián)的胰高糖素類 肽形成的重組融合蛋白（rHSA/GLP-l2)，分子量~73kD ;條帶C :酵母工程菌表達(dá)的人血清 白蛋白N端與串聯(lián)的胰高糖素類肽形成的重組融合蛋白（rGLP-l2/HSA)，分子量~73kD ;條 帶D :酵母工程菌表達(dá)的人血清白蛋白的N端和C端各有1個(gè)串聯(lián)的胰高糖素類肽形成的 重組融合蛋白（rGLP-l2/HSA/GLP-l 2)，分子量~79kD。
[0069] 附圖5.以鼠抗人血清白蛋白單克隆特異抗體（Sigma公司Cat :A6648)所做的蛋 白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)；條帶分別對(duì)應(yīng)附圖4的描述。
[0070] 附圖6.以鼠抗人胰高糖素類肽（7_36aa)單克隆特異抗體[美國Abeam公司Cat : Anti-hGLP-lantibody[EPR4042] (abllll25)]所做的蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)。條帶分別對(duì)應(yīng) 附4的描述。可以確認(rèn)條帶A僅是人血清白蛋白，其不含有GLP-1多肽成分。
[0071] 附圖7.以3種不同分子結(jié)構(gòu)的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白在相 同劑量條件下對(duì)大鼠胰島瘤細(xì)胞株，RIN-5F細(xì)胞細(xì)胞的生物活性測定值，表明各種分子結(jié) 構(gòu)重組胰高糖素類肽融合蛋白均具有刺激細(xì)胞生成cAMP的功能，并且在人血清白蛋白的N 端和C端同時(shí)含有串聯(lián)的GLP-1的分子結(jié)構(gòu)融合蛋白的生物活性更高（意味著可稀釋倍數(shù) 更高），顯示同劑量下GLP-1的刺激產(chǎn)生cAMP的生物活性更高。
[0072] 附圖8.重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白影響鼠血糖濃度的測定結(jié)果 圖。圖中的A :rHSA陰性對(duì)照組；B :注射給藥rGLP-l2/HSA(N端連接串聯(lián)的GLP-1) ;C :注射 給藥rHSA/GLP-l2 (C端連接串聯(lián)的GLP-1) ;D :注射給藥rGLP-l2/HSA/GLP-l2組（人血清白 蛋白的兩端均連接串聯(lián)的GLP-1)。
[0073] 附圖9.各種重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白經(jīng)皮下注射后在動(dòng)物血 漿中藥代動(dòng)力學(xué)分析和半衰期計(jì)算結(jié)果。
[0074] 附圖10.各種重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白融合蛋白減肥效果比 較。
[0075] 附圖11.各種重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白在鼠體內(nèi)誘導(dǎo)胰島素生 成的考察結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0076] 實(shí)施例1 :分子克隆技術(shù)簡述
[0077] 常規(guī)分子克隆技術(shù)包括DNA、RNA的提取，瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳，DNA 片段的連接，限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)均參照文獻(xiàn)（Maniatis，et al.，"分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)" 冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約，1982)。質(zhì)粒DNA的純化，DNA片段的回收等均采用商品純 化柱制備。DNA聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)(參照文獻(xiàn)Saikiet al.，科學(xué)，230 :1350，1985)所用 的酶及反應(yīng)所需的PCR儀均為Perkin Elmer產(chǎn)品。并參照廠家操作程序。DNA測序和DNA 擴(kuò)增所需用的寡聚核苷酸引物由專門機(jī)構(gòu)完成。轉(zhuǎn)受態(tài)大腸桿菌由GIBC0/BRL公司購得。 本發(fā)明所使用的酵母菌菌種X33和pPICZ-A酵母菌克隆載體質(zhì)粒均購自Invitrogen公司。 重組酵母菌克隆載體DNA轉(zhuǎn)化酵母菌是由電脈沖方式進(jìn)行，并參照廠家（Bio-Rad)的操作 程序。
[0078] 實(shí)施例2 :人血清白蛋白（HSA)基因表達(dá)及載體質(zhì)粒的構(gòu)建
[0079] 使用發(fā)明人在其發(fā)明專利ZL0214288L 6、ZL200410042814. 8和 ZL200410057313. 7中所描述的HSA克隆方法和試驗(yàn)結(jié)果。GenBank檢索編號(hào)AY728024的 HSA序列，用于本發(fā)明中的HSA基因序列與細(xì)胞生長因子基因序列發(fā)生基因重組融合蛋白 的。使用AY728024序列編碼HSA，可使得融合蛋白獲得在酵母菌中的意想不到的高效表達(dá)。 表達(dá)質(zhì)粒（見中國專利ZL02142881.6)也可用于本發(fā)明的實(shí)施例中。pYZ-HSA的重組人血 清白蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)也在中國發(fā)明專利ZL02142881. 6圖2中公開，并用于構(gòu)建 本發(fā)明公開的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白的各種分子結(jié)構(gòu)表達(dá)載體基礎(chǔ) 質(zhì)粒。本發(fā)明使用的人血清白蛋白核苷酸序列為Seq No. 1，其分泌肽和成熟肽的完整氨基 酸序列為Seq No. 2。
[0080] 實(shí)施例3 :人GLP-1串聯(lián)雙基因片段的合成和重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽2 融合蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建
[0081] 發(fā)明人先以GLP-1野生型氨基酸序列7-36肽段為標(biāo)準(zhǔn)合成GLP-1基因序列，并 與人血清白蛋白基因融合，獲得各種GLP-1融合蛋白開展了生物活性驗(yàn)證。其后又以美國 HGSI的Albugon中的GLP-1類似物氨基酸序列為標(biāo)準(zhǔn)，采用DNA序列全合成法來人工合成 人GLP-l(7_36，Ala8Gly)雙重復(fù)序列為Seq No. 3,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為Seq No. 4。將合 成的GLP-12的N端設(shè)有BSU36I內(nèi)切酶位點(diǎn)達(dá)到無縫連接與人血清白蛋白的C端點(diǎn)直接連 接：
[0084] 5'端序列是人血清白蛋白C末端核苷酸序列編碼最后4個(gè)氨基酸。下劃線為 GLP-l(7-36, Gly8)雙重復(fù)核苷酸序列。發(fā)明人特意設(shè)計(jì)了雙終止子TGA/TAA。同時(shí)5'端 置有Bsu36I、3'端置有Xhol和EcoRI限制性內(nèi)切酶克隆用位點(diǎn)（以點(diǎn)下劃線示之）。貝1J， 串聯(lián)GLP-1雙重復(fù)氨基酸序列列在Seq No. 4 :
[0085] ALGL-HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR-HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR-c,
[0086] 如此，我們將該片段直接基因融合到人血清白蛋白的C末端（ALGL-)，而形成了重 組人血清白蛋白/胰高糖素類肽 2融合蛋白（rHsA/GLP-l2)。
[0087] 實(shí)施例4 :重組人胰高糖素類肽2/白蛋白融合蛋白（rGLP_l2/HsA)表達(dá)載體質(zhì)粒 的構(gòu)建
[0088] 為了將GLP_12連接在HSA的N端，構(gòu)建發(fā)明人進(jìn)一步合成了含有人血清白蛋白 分泌肽直接連接GLP-1雙重復(fù)的氨基酸序列（人血清白蛋白分泌肽核苷酸序列以黑體字 示之）和人GLP-1雙重復(fù)DNA序列直接連接（以下劃點(diǎn)狀線視之；重復(fù)序列以下劃雙線示 之），人工合成完整全DNA序列。為克隆和亞克隆基因工程編輯方便，在人工合成的人血清 白蛋白氨基酸序列中含有的內(nèi)切酶位點(diǎn)，在5'端設(shè)計(jì)了 Hind III (下劃線，克隆用位點(diǎn)）， 3'端則采用人血清白蛋白DNA序列中原有的Alel(下劃線），組成人工合成DNA序列的一 部分。限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)DNA序列和人工合成全序列如下：
[0089] Seq No. 5 ：
[0093] 下劃點(diǎn)線前是人血清白蛋白的分泌肽的氨基酸序列，單下劃點(diǎn)線為第一個(gè)GLP-1 多肽氨基酸序列，雙下劃線則是第2個(gè)GLP-1多肽的氨基酸序列，其C端與人血清白蛋白成 熟肽的N端-DAHKSEV直接連接。
[0094] 人工合成該DNA片段的方法為常規(guī)的基因克隆技術(shù)，人工分段合成DNA核苷 酸鏈，然后相互組合加 PCR方法，合成長鏈DNA片段的路線和方法已經(jīng)在本發(fā)明人的 ZL200710057571. 9中的圖1所公開。最終的PCR的產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)增后克隆入pBlue載體質(zhì)粒 中，經(jīng)DNA雙向序列測定和分析，證明其DNA序列與設(shè)計(jì)的DNA理論序列相同（附圖1)。
[0095] 借助pBlue載體人工合成的全DNA的PCR產(chǎn)物插入到TA克隆位點(diǎn)，其位點(diǎn)的左右 都含有1個(gè)EcoRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。因此，將Hindlll和EcoRI雙酶切后獲得的DNA片段 (長約320bp)插入到也經(jīng)Hindlll和EcoRI雙酶切后的pPICZA-a載體質(zhì)粒中（以a表示 該質(zhì)粒DNA(pPICZ-A)中原有的Alel限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（位于質(zhì)粒DNA的72-81nt位置）， 已經(jīng)預(yù)先被發(fā)明人用基因工程技術(shù)刪除，這有利于后續(xù)利用人工合成的DNA序列中的Alel 位點(diǎn)（在人血清白蛋白基因的序列上）完成HSA基因序列的克隆工作。
[0096] 利用pPICZA-a-GLP_l2載體上的克隆位點(diǎn)將人血清白蛋白的Alel-EcoRI片段連 接上形成完整的rGLP-l 2/HSA片段。由此完成可由人血清白蛋白分泌肽分泌表達(dá)rGLP-l2/ HSA融合蛋白的酵母菌表達(dá)載體DNA質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0097] 實(shí)施例5 :重組人胰高糖素類肽2/人血清白蛋白/胰高糖素類肽2融合蛋白 (rGLP-l2/HSA/GLP-l2)表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建
[0098] 將實(shí)施例3中的Seq No. 3的DNA片段（Bsu36I_XhoI)，其中含有雙GLP_12序列， 插入實(shí)施例4構(gòu)建的rGLP-l 2/HSA表達(dá)載體質(zhì)粒DNA中的Bsu36I和Xhol位點(diǎn)。同理，也 可以將實(shí)施例4這的Seq No. 4插入到實(shí)施例3構(gòu)建的rHSA/GLP-l2表達(dá)載體質(zhì)粒DNA中 的Hindlll-Alel位點(diǎn)來構(gòu)建表達(dá)rGLP-l 2/HSA/GLP-l2藥物分子結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體質(zhì)粒。
[0099] Seq No. 7 ：

[0101] 經(jīng)酵母工程菌發(fā)酵酵母菌細(xì)胞通過高爾基體加工，在人血清白蛋白的分泌肽引 導(dǎo)下，成熟肽rGLP-12/HSA/GLP-12則分泌到培養(yǎng)基上清液中，此時(shí)表達(dá)的rGLP-1 2/HSA/ GLP-12成熟肽（藥物實(shí)際分子結(jié)構(gòu)）的氨基酸序列則為：
[0102] rGLP-l2/HSA/GLP_l2的藥物氨基酸分子序列則為：
[0103] Seq No. 8 ：
[0105] 這一 DNA核苷酸序列SeqNo. 7和能表達(dá)這一融合蛋白（SeqNo. 8)的重組畢氏酵 母工程菌特意被發(fā)明人保藏。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC);保藏編號(hào)：CGMCC No. 9645 ;分類命名：巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris ;保藏單 位地址：北京中科院微生物所；保藏日期：2014年9月11日。作為本發(fā)明中的重組人血清 白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白（rGLP-l 2/HSA/GLP-l2)的一個(gè)代表。
[0106] 附圖1.和附圖2.的DNA測序結(jié)果分別驗(yàn)證了重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽 融合蛋白（rGLP-l 2/HSA/GLP-l2)的基因序列5'端和3'端的DNA序列含有基因拼接和克隆 用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以及人血清白蛋白成熟肽序列的兩端各與1個(gè)串聯(lián)的GLP-1 2直接連 接的實(shí)際狀況。附圖3是重組人血清白蛋白以及3種不同藥物分子結(jié)構(gòu)的重組人血清白蛋 白/胰高糖素類肽融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖，（A) :rHSA ; (B) :rGLP-l2/HSA ; (C) :rHSA/GLP-l2 ; (D) ：rGLP-l2/HSA/GLP-l2〇
[0107] 實(shí)施例6 :畢赤酵母表達(dá)工程菌的轉(zhuǎn)化和制備
[0108] 將畢氏酵母菌菌株X33菌落接種于含5ml YH)培養(yǎng)液的50ml培養(yǎng)基中，以250 轉(zhuǎn)/分的速度于30°C下培養(yǎng)過夜。次日取0. 2ml過夜培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)接入500ml YH)的培養(yǎng) 液中，置于2升的三角培養(yǎng)瓶中。在30°C下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2-3小時(shí)，使細(xì)胞密度達(dá)到0D600 = 1.3-1. 5。酵母菌經(jīng)離心方法收集，再重懸于500ml冰預(yù)冷的無菌水中洗滌兩次。然后酵母 菌懸于20ml冰預(yù)冷的1M Sortbitol溶液洗滌一次。
[0109] 在實(shí)例 3、4 和 5 中構(gòu)建的質(zhì)粒 pYZ-HSA/GLP-l2、pYZ-GLP-l2/HSA 和 pYZ-GLP-l2/ HSA/GLP-12質(zhì)粒DNA均分別經(jīng)Pme I限制性內(nèi)切酶處理后，形成線性質(zhì)粒分子。取5 μ g線性 化后質(zhì)粒DNA與80ul處理后的酵母菌相混合并置于0. 2厘米厚的電極杯內(nèi)，置于點(diǎn)脈沖儀 上。電脈沖條件為電壓7500V/CM，電極間隔時(shí)間為5-10 (ms)。電擊處理后，立即加入lml冰 預(yù)冷的1M Sorbitol溶液于酵母菌中，然后轉(zhuǎn)入15ml試管中。轉(zhuǎn)化的酵母菌置于30°C培養(yǎng) 箱中放置2小時(shí)，然后接種涂布在含Zeocin抗生素的YPD平板培養(yǎng)基上。經(jīng)抗性選擇而生 長出的克隆，再用分子生物學(xué)方法鑒定其基因的插入。蛋白質(zhì)的表達(dá)與分泌則以SDS-PAGE 或用特異抗體做蛋白質(zhì)免疫印跡檢測。不同的畢氏酵母菌菌株，如GS115，KM71以及蛋白酶 缺陷型酵母菌株，如SMD1168均可用來表達(dá)和分泌重組的重組人血清白蛋白融合蛋白。
[0110] 實(shí)施例7 :酵母菌表達(dá)及分泌的各種GLP-1重組人血清白蛋白融合蛋白的特性
[0111] 將數(shù)個(gè)含有待表達(dá)基因的酵母菌落分別在含有Zeocin抗生素，具有緩沖能力及 甘油的基本培養(yǎng)液中培養(yǎng)。以300轉(zhuǎn)/分的速度培養(yǎng)至菌體密度達(dá)到0D_ = 2-6。培養(yǎng)物 經(jīng)1500轉(zhuǎn)/分，15分鐘條件下離心收集菌體，菌體再重懸于同種基本培養(yǎng)液但不含甘油，改 含0. 5%甲醇，細(xì)胞密度達(dá)到0D_ = 1. 0,繼續(xù)培養(yǎng)。酵母菌在甲醇的誘導(dǎo)下，外源蛋白在 啟動(dòng)子的作用下開始表達(dá)。其后，每24小時(shí)加入100%甲醇至最終濃度為0.5%。在不同 的時(shí)間點(diǎn)分別收集培養(yǎng)上清液。使用SDS-PAGE變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或蛋白質(zhì)免疫印 跡法測定GLP-1融合蛋白的表達(dá)和產(chǎn)量。
[0112] 經(jīng)純化后的3種不同分子結(jié)構(gòu)的重組胰高糖素類肽融合蛋白與同樣是有畢赤酵 母工程菌表達(dá)，分離純化的重組人血清白蛋白（rHSA) -同電泳顯示各自的分子量差異和 分子量確認(rèn)。附圖4中的條帶Μ :蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量、條帶A :酵母工程菌表達(dá)的重組人血清 白蛋白（rHSA)，分子量~66. 5kD ;條帶B :酵母工程菌表達(dá)的人血清白蛋白C端與串聯(lián)的胰 高糖素類肽形成的重組融合蛋白（rHSA/GLP-l2)，分子量~73kD ;條帶C :酵母工程菌表達(dá) 的人血清白蛋白N端與串聯(lián)的胰高糖素類肽形成的重組融合蛋白（rGLP-l2/HSA)，分子量~ 73kD ;條帶D :酵母工程菌表達(dá)的人血清白蛋白的N端和C端各有1個(gè)串聯(lián)的胰高糖素類肽 形成的重組融合蛋白（rGLP-l2/HSA/GLP-l 2)，分子量~79. 5kD。發(fā)明人繼續(xù)就融合蛋白開 展免疫原性驗(yàn)證。
[0113] 典型的蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)是將變性（SDS)凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)，經(jīng)電泳儀將 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到尼龍或醋酸纖維膜上，再以特異抗體（第一抗體）識(shí)別相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)。然 后帶有熒光功能基因的第二抗體，識(shí)別并結(jié)合于第一抗體，經(jīng)熒光顯色整個(gè)特異性結(jié)合的 復(fù)合物，即特異蛋白質(zhì)在X光片上留下印記。也可以使用Biotin標(biāo)記抗體、或HRP標(biāo)記 抗體，在待檢樣品中可與特異抗體結(jié)合的抗原，被經(jīng)功能基團(tuán)顯色或曝光方法，形成著色 被檢定出來。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量用于決定未知蛋白的分子量。對(duì)經(jīng)酵母菌表達(dá)分泌的各種 重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白獲得重組融合蛋白以抗人HSA鼠單克隆抗體 (Sigma Cat :A6684)進(jìn)打檢測，確認(rèn)含有人血清白蛋白蛋白質(zhì)序列，并擁有完整具生物活性 的人血清白蛋白分子結(jié)構(gòu)（附圖5,各對(duì)應(yīng)條帶標(biāo)識(shí)與附圖4相同）。同理，以相同的樣品 電泳膠轉(zhuǎn)印后，以美國Abeam公司抗人GLP-1的單克隆抗體Anti-GLPlantibody[EPR4042] (abllll25)所做的蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，融合蛋白含有GLP-1與純品hGLP-l(R&D System公司）具有相同的抗原性，并顯示二者之間在免疫反應(yīng)強(qiáng)度與分子大小上具有相同 的比率。相同結(jié)果也得到證實(shí)。為此，確認(rèn)所表達(dá)的各種分子結(jié)構(gòu)的重組胰高糖素類肽融 合蛋白電泳結(jié)果和使用人血清白蛋白特異抗體（Sigma)與人GLP-1特異抗體（Abeam)單克 隆抗體，所作的Western blot結(jié)果。在二者的分子量上，十分明顯地表現(xiàn)出差異。HSA的分 子量為 66471. 35D、rGLP-l2/HSA 和 rHSA/GLP-l2 的分子量為 73004. 58D 以及 rGLP-l2/HSA/ GLP-12的分子量為79537. 81D，電泳遷移率也就不同。GLP-12雙串聯(lián)的分子量為6533. 23D， GLP-1單體分子量為3266. 615D。使用相同劑量的各重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融 合蛋白開展免疫印跡試驗(yàn)是，N端和C端單個(gè)串聯(lián)和同時(shí)N端、C端串聯(lián)GLP-1分子時(shí)，重組 融合蛋白兩端都有串聯(lián)的GLP-1的融合蛋白其著色度要更深些（見附圖6的條帶E)。
[0114] 實(shí)施例8 :大規(guī)模高密度表達(dá)重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白
[0115] 發(fā)明人使用200L生物發(fā)酵罐系統(tǒng)和1000L (噸級(jí)）生物發(fā)酵罐系統(tǒng)開展了重組 人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白的3種不同分子結(jié)構(gòu)的融合蛋白，rHSA/GLP-l 2、 rGLP-l2/HSA和rGLP-l2/HSA/GLP-l2的噸級(jí)規(guī)?；a(chǎn)和發(fā)酵工藝以及公斤級(jí)重組人血清 白蛋白融合蛋白原料藥的制備工藝和技術(shù)建立。實(shí)驗(yàn)中表明應(yīng)用畢氏酵母表達(dá)和規(guī)?；?產(chǎn)重組融合蛋白比起其它任何系統(tǒng)都要容易的多。重組株分離到后，重組蛋白表達(dá)株可有 Mut+和Muts兩種形式。重組酵母工程菌按發(fā)明人研發(fā)的工藝程序制備工程菌種子庫、主種 子庫和工作種子庫。取一支工作種子庫接種到三角瓶中在搖床從小規(guī)模培養(yǎng)開始，然后擴(kuò) 增到一級(jí)種子罐、二級(jí)種子罐，進(jìn)入生產(chǎn)發(fā)酵罐（1噸體積）。經(jīng)培養(yǎng)至罐內(nèi)甘油消耗盡，溶 氧隨之回至低限再回升時(shí)，啟動(dòng)甘油流加。待流加結(jié)束，溶氧在回升時(shí)，啟動(dòng)甲醇流加，進(jìn)入 誘導(dǎo)和融合蛋白生產(chǎn)階段，維持72小時(shí)甲醇流加?？稍诓煌囵B(yǎng)時(shí)間點(diǎn)取樣測試融合蛋 白的表達(dá)。對(duì)于分泌型蛋白在細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)液中的含量均用SDS-PAGE方法進(jìn)行分析，對(duì) 表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，表達(dá)水平和純度在每一步中均進(jìn)行監(jiān)測。結(jié)果展示不同發(fā)酵液中的 3種不同分子結(jié)構(gòu)的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白融合蛋白的表達(dá)水平均在 300mg/L 左右。
[0116] 實(shí)施例9 :分泌的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白的純化與特性
[0117] 重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白經(jīng)酵母工程菌發(fā)酵培養(yǎng)直接分泌到 上清液。經(jīng)連續(xù)流離心將含有分泌出的血清白蛋白融合蛋白上清液與菌體分離后，直接上 美國GE公司的MMC分離填料介質(zhì)，用柱層析法將目標(biāo)蛋白質(zhì)收集。進(jìn)入下一步疏水型層析 柱、離子交換層析柱的精純階段。最后純化的融合蛋白原料藥（原液）通過〇.2uM濾膜以 達(dá)無菌要求。利用常規(guī)方法來決定蛋白質(zhì)的濃度，如Lowyr法蛋白質(zhì)濃度測定方法。以本 發(fā)明人的注射用重組人血清白蛋白融合蛋白制劑配方和成品凍干粉針劑生產(chǎn)工藝的授權(quán) 發(fā)明專利（ZL200910210379.8)為依托，用于生產(chǎn)符合臨床注射用藥物用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨 床治療用途的注射用凍干粉針劑。
[0118] 實(shí)施例10 :重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白的細(xì)胞生物活性測定試驗(yàn)
[0119] 實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞株是大鼠胰島瘤細(xì)胞株，RIN-5F細(xì)胞。細(xì)胞生長和維持在含10% 小牛血清、lmol/L丙酮酸鈉、0. 5% HEPES液的RPMI-1640培養(yǎng)液（pH7. 2)中，在37°C、5% 二氧化碳的條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至一 定濃度。加細(xì)胞懸液于96孔培養(yǎng)板中。C0 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d。除去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入無 血清細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2h。取供試品或參考品分別用含一定濃度的3-異丁基-1-甲基 黃嘌呤（3-isobuty-1-methylxanthine，IBMX)和牛血清白蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)待測樣品 作倍比稀釋，共6個(gè)稀釋度。除去細(xì)胞上清，加入稀釋好的不同濃度的參考品及樣品液，每 個(gè)稀釋度做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立總活性、非特異性、最大結(jié)合及底物空白對(duì)照。在C0 2培養(yǎng) 箱中放置5min。隨后除去細(xì)胞上清，用cAMP試劑盒（cAMP Low pH試劑盒：R&D System公 司生產(chǎn)，貨號(hào)：DE035)檢測。檢測波長為405nm，參考波長為570nm。獲得以誘導(dǎo)cAMP 50% 的最大刺激反應(yīng)的稀釋倍數(shù)?；钚詥挝欢x：以能誘導(dǎo)cAMP 50%的最大刺激反應(yīng)的稀釋 倍數(shù)為1個(gè)活性單位（即Au)。
[0120] 附圖7顯示了各種重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白不同結(jié)構(gòu)樣品，對(duì) 細(xì)胞的刺激生物活性。以rHSA為陰性對(duì)照，3種不同分子結(jié)構(gòu)的重組人血清白蛋白/胰高 糖素類肽融合蛋白在相同劑量條件下對(duì)大鼠胰島瘤細(xì)胞株，RIN-5F細(xì)胞細(xì)胞的生物活性 測定值，表明各種分子結(jié)構(gòu)重組胰高糖素類肽融合蛋白均具有刺激細(xì)胞生成cAMP的功能， 并且在人血清白蛋白的N端和C端同時(shí)含有串聯(lián)的GLP-1的分子結(jié)構(gòu)融合蛋白的生物活性 更高（意味著可稀釋倍數(shù)更高），顯示同劑量下GLP-1的刺激產(chǎn)生cAMP的生物活性更高。 試驗(yàn)顯示N端或C端直接連接串聯(lián)的GLP-1融合蛋白（rGLP-l 2/HSA或rHSA/GLP-l2)的生 物活性二者在數(shù)值上有著相同摩爾濃度活性。在比活與其分子量大小相一致的比例。而在 N端和C端同時(shí)分別直接連接串聯(lián)的GLP-1時(shí)，同等劑量的融合蛋白（rGLP-l2/HSA/GLP-l2) 則具有高約1倍的生物活性。這一結(jié)果與藥物分子結(jié)構(gòu)中的GLP-1含量相吻合。生物活性 測定表明分離純化工藝穩(wěn)定，獲得的產(chǎn)品質(zhì)量可控。
[0121] 實(shí)施例11 :重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白降血糖的生物學(xué)功能
[0122] 糖尿病模型鼠 BSKdb/db的第一個(gè)表征是高血糖，為健康鼠血糖水平的2-4倍；第 二個(gè)表征為肥胖，體重超出正常鼠體重標(biāo)準(zhǔn)值的2-4倍。在規(guī)定飼養(yǎng)條件下，將12只小鼠 隨機(jī)分為4組，每組3只。分別皮下注射各種符合注射用藥物規(guī)定的供試品劑量相當(dāng)于 lmg/kg(平均體重約50g/只）。其中A組注射陰性對(duì)照品重組人血清白蛋白（rHSA)、B組 注射給藥rGLP-l 2/HSA、C組注射給藥rHSA/GLP-l2以及D組注射給藥rGLP-l2/HSA/GLP-l 2。 經(jīng)隱靜脈采集血樣約200微升，其中50微升用血糖儀來測定血糖水平，其余分離的血漿使 用美國Alpco公司的GLP-l(7-36)酶聯(lián)免疫試劑盒（Cat No. :43-GPlHU-E01)檢測GLP-1 在血液中的血藥濃度用于藥代動(dòng)力學(xué)分析和實(shí)施例12的胰島素誘導(dǎo)生成。血樣采集點(diǎn)為 (藥前 〇h)，藥后 24h(ld)、48h(2d)、96h(4d)、144h(6d)、192h(8d)、240h(10d)、288h(12d)、 384(16d)。血糖濃度測定結(jié)果表明除rHSA陰性對(duì)照組（A)血糖水平?jīng)]有顯著改變外，其余 3個(gè)受試組均呈現(xiàn)顯著改善，并可維持血糖水平控制。注射給藥rGLP-l 2/HSA(B)和rHSA/ GLP-12(C)注射給藥兩組的效果可維持1周，顯示出它們具長效性。而注射給藥rGLP-l2/ 批八/61^-1 2組（D)則可以顯著維持近2周，顯示出在控制動(dòng)物的血糖水平具有更好的長效 性（見附圖8)。
[0123] 實(shí)施例12.重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白的血藥濃度測定（藥代）
[0124] 與實(shí)施例11同時(shí)開展了陰性對(duì)照組rHSA和3種不同結(jié)構(gòu)的重組人血清白蛋白/ 胰高糖素類肽融合蛋白皮下注射后的GLP-1酶聯(lián)免疫試劑盒檢測其血藥濃度。各種重組人 血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白經(jīng)皮下注射后在動(dòng)物血漿中藥代動(dòng)力學(xué)分析和半衰 期計(jì)算結(jié)果顯示在人血清白蛋白的C端或N端分別直接連接的融合蛋白表現(xiàn)相似，但給藥 同等劑量的在人血清白蛋白的N端和C端同時(shí)分別直接連接串聯(lián)的GLP-1時(shí)，則其血藥濃 度（GLP-1)顯著具有更高的藥物含量和更長的半衰期，達(dá)90小時(shí)左右；而僅在N端和C端 連接串聯(lián)時(shí)半衰期也在70小時(shí)左右（見附圖9)。
[0125] 實(shí)施例13.重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白減輕體重的效果考察
[0126] 與實(shí)施例11試驗(yàn)的同時(shí)開展了注射給藥后鼠體重的變化。結(jié)果表明除A組（注 射給予rHSA)外，其余各組的體重均顯著下降達(dá)20-30%與文獻(xiàn)報(bào)道相似，同時(shí)，D組（注射 給藥rGLP-12/HSA/GLP-12)則維持低體重時(shí)間較B和C組的7天要更長些達(dá)到10-16天。 結(jié)果見附圖10。
[0127] 實(shí)施例14 :重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白誘導(dǎo)小鼠胰島素生成的測 定
[0128] 因人GLP-1也可以在小鼠中作用于小鼠 GLP-1受體，誘導(dǎo)產(chǎn)生鼠胰島素。為此與實(shí) 施例11試驗(yàn)的同時(shí)開展了誘導(dǎo)體內(nèi)胰島素刺激生成的監(jiān)控。使用小鼠胰島素 ELISA試劑盒 方法（Mercodia公司小鼠超敏胰島素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，Cat :10-1249-10)檢測胰島素 水平。以此考察陰性對(duì)照品（附圖3的A)和3種重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合 蛋白（附圖3中的B、C、D)受試藥與對(duì)小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生新的胰島素，達(dá)到血液這胰島素含量和 水平提高作用功能。試驗(yàn)結(jié)果（附圖11)表明各種重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合 蛋白的分子結(jié)構(gòu)均可顯著大幅提高誘導(dǎo)胰島素產(chǎn)生的能力。其中同劑量的重組人血清白蛋 白N端、C端同時(shí)含有串聯(lián)的GLP-1時(shí)，rGLP-l 2/HSA/GLP-l2則可誘導(dǎo)胰島素的產(chǎn)生，同時(shí)具 有更長的作用時(shí)間，顯示出更好的長效性。據(jù)此推斷，如果GKS公司的Albiglutide (與本 發(fā)明中的串聯(lián)GLP-1連接在人血清白蛋白N端分子結(jié)構(gòu)完全相同）可以在臨床上以50mg/ 次/周給藥，可維持1周有效，則本發(fā)明的在人血清白蛋白分子的N端、C端同時(shí)連接串聯(lián) 的GLP-1是具有可達(dá)到一半劑量給藥或可達(dá)到每10天或14天給藥一次的顯著優(yōu)勢。
[0129] 因此，在使用同樣劑量時(shí)，人血清白蛋白的N端和C端同時(shí)含有串聯(lián)的2個(gè)GLP-1 的重組人血清白蛋白/胰高糖素類肽融合蛋白（rGLP-l 2/HSA/GLP-l2)，可具有較長的半 衰期和更穩(wěn)定的血藥濃度控制功能，這在臨床上作為藥物使用時(shí)應(yīng)具有極大的應(yīng)用價(jià) 值。當(dāng)然在臨床上使用僅一半的藥物劑量就可以獲得與GSK公司完成臨床試驗(yàn)III期的 Albiglutide (本發(fā)明中的rGLP-l2/HSA的分子結(jié)構(gòu)完全相同）具相似治療效果。當(dāng)使用低 劑量藥物也可以獲得相似臨床治療效果時(shí)，則受藥患者，可顯著減少藥物帶來的毒副反應(yīng) 和免疫原性，特別是本發(fā)明的產(chǎn)品是作為2型糖尿病患者的終身用藥，低劑量長期使用就 更彰顯顯示出本發(fā)明具有顯著的成藥性上優(yōu)勢。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種融合蛋白，其特征為人血清白蛋白（HSA)和人胰高糖素類肽（GLP-I)相連構(gòu)成 的融合蛋白；進(jìn)一步地其特征在于，該融合蛋白中的人血清白蛋白成熟肽的N端和C端各直 接連接1個(gè)串聯(lián)的人胰高糖素類肽（GLP-I 2)。2. 如權(quán)利要求1所述融合蛋白，其編碼基因的核苷酸序列如Seq No. 7所示；其編碼成 熟肽的氨基酸序列如Seq No. 8所示。3. 權(quán)利要求2所述融合蛋白，其編碼基因的核苷酸序列與Seq No. 7具有至少95%的 序列同源性；其編碼成熟肽的氨基酸序列與Seq No. 8具有至少95%的序列同源性。4. 如權(quán)利要求1所述融合蛋白，可通過將含有融合蛋白核苷酸序列的表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn) 化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)脊椎動(dòng)物、魚、昆蟲、植物、酵母菌、病毒或細(xì)菌宿主獲得；所述的脊椎動(dòng)物 細(xì)胞為中國倉鼠細(xì)胞（CHO);所述的酵母菌是釀酒酵母、畢赤酵母、念珠菌屬酵母、克魯維 亞酵母、孢圓母屬酵母或裂殖酵母；所述畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母，其工程菌保藏號(hào)為 CGMCC No. 9645。5. -種用于糖尿病疾病治療的制劑，其特征為含有權(quán)利要求1所述融合蛋白。6. -種用于減輕體重為目的的制劑，其特征為含有權(quán)利要求1所述融合蛋白。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK105884901SQ201410532831
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年10月11日
【發(fā)明人】富巖, 于在林
【申請(qǐng)人】北京美福源生物醫(yī)藥科技有限公司, 天津溥瀛生物技術(shù)有限公司, 中美福源生物技術(shù)(北京)有限公司