白化病ii型致病基因突變檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測白化病II型致病基因P基因是否發(fā)生突變的試劑盒。該試劑盒的主要成分包括：(1)P基因第2到第25外顯子編碼區(qū)PCR擴增與測序引物24對；(2)PCR擴增試劑；(3)PCR產物純化試劑；(4)DNA測序試劑。本發(fā)明的試劑盒用于檢測白化病II型致病基因P基因的突變體，可以快速方便地查出致病基因的攜帶者以及病人，可應用于產前診斷、阻止患兒出生，降低白化病II型的發(fā)病率。
【專利說明】
白化病N型致病基因突變檢測試劑盒
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬生物技術領域，具體涉及檢測白化病II型致病基因是否發(fā)生突變的試 劑盒。
【背景技術】
[0002] 眼皮膚白化?。?CA)在遺傳學上是一組由不同基因的突變導致的具有相同或相 似臨床癥狀的遺傳病，均呈常染色體隱性遺傳，表現(xiàn)為全身皮膚、毛發(fā)和眼黑色素缺乏，目艮 黑色素的缺乏導致視網(wǎng)膜中央小凹發(fā)育不良及視神經通路異常，出現(xiàn)眼球震顫、斜視、視力 低下及畏光等癥狀。根據(jù)涉及基因的不同，0CA進一步分為4型，即眼皮膚白化病I-IV型 (0CA1-0CA4)〇
[0003] 由于0CA2的突變基因不是酪氨酸酶基因，故該型曾被稱為酪氨酸酶陽性眼皮膚 白化病。國外資料顯示，0CA2是眼皮膚白化病中最常見的類型。0CA2約占0CA的50%。該病 尤其常見于非洲人和非裔美洲人，高加索人的發(fā)病率為1 :37000,非裔美洲人為1 :15000， 非洲南部的班圖語系人高達1 :3900。0CA2表型較0CA1輕，但皮膚表型多樣，可有輕微到中 度的毛發(fā)、皮膚和虹膜色素沉著。皮膚色素沉著多聚集成雀斑、痣，而非均勻分布，日曬下皮 膚顏色不會加深。典型的0CA2表型包括黃色毛發(fā)、白色皮膚（在所有種族中）、藍色/淺褐 色/淺棕色虹膜以及視神經傳導通路異常引起的眼球震顫、斜視和視敏感性下降等。由于 缺乏黑色素保護，患者易患uv誘導的皮膚癌。0CA2個體出生時毛發(fā)和虹膜有少量色素沉 著，少數(shù)個體皮膚色素沉著隨年齡的增長增加。
[0004] 現(xiàn)已證明0CA2的致病基因是與小鼠紅眼稀釋P基因同源的人P基因突變所致。P 基因定位于15qll. 2_ql2,編碼一種稱為P蛋白的跨膜蛋白，該蛋白由838個氨基酸殘基構 成，含有12個跨膜區(qū)，6個糖基化位點，位于黑色素小體膜上，與黑色素小體膜的完整性有 關。黑色素由皮膚、毛囊、虹膜和視網(wǎng)膜的黑色素細胞產生，分為黑棕色的真黑素和紅黃色 的褐黑素。P基因產物為真黑素合成所必需。隨著分子生物學技術的發(fā)展，國際白化病中心 的白化病數(shù)據(jù)庫已收集85種與0CA2有關的P基因錯義突變、無義突變、移碼突變和剪切位 點突變，并不斷有新突變發(fā)現(xiàn)。
[0005] 白化病的發(fā)病機制不甚明了，至今尚無有效的治療方法。白化病屬于家族遺傳性 疾病，為常染色體隱性遺傳，常發(fā)生于近親結婚的人群中?；颊唠p親均攜帶白化病基因，本 身不發(fā)病。如果夫婦雙方同時將所攜帶的致病基因傳給子女，子女就會患病。所以檢出0CA2 患者的P基因突變并查找出相應的攜帶者是減少或預防白化病患兒出生的有效治療措施。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種采用DNA測序技術檢測白化病II型致病基因 P基因是 否突變的試劑盒。
[0007] 本檢測試劑盒主要包括以下成分：
[0008] (1)P基因第2到第25外顯子編碼區(qū)PCR擴增與測序引物24對，引物序列見表1 ;
[0009] (2)常規(guī)PCR擴增試劑，如dNTP、TaqDNA聚合酶等；
[0010] (3)常規(guī)PCR產物純化試劑，如SAP酶、ΕχοΙ酶等；
[0011] (4)常規(guī)DNA測序試劑，如BigDyemix、EDTA溶液、乙醇溶液、HI-DI溶液等。
[0012] 表1P基因第2-25外顯子編碼區(qū)的PCR擴增與測序引物序列
[0015] 本試劑盒的使用步驟包括：
[0016] (1)提取樣本的基因組DNA ;
[0017] (2)P 基因 PCR 擴增
[0018] 針對P基因第2-25外顯子編碼區(qū)按照表1設計引物進行PCR擴增。每個反應體 系為總體積15ul，包含Taq酶混合液7. 5 μ L(dNTP、10XPCR反應緩沖液、MgCl2)、去離子水 5.5 4 1^、引物（10_0.5 4 1^、基因組0嫩(1001^/111)1111。反應條件為951：15分鐘，進行14 個循環(huán)（-0. 5 °C /循環(huán)）的94°C 30秒，63 °C 30秒，72 °C 45秒；然后進行30個循環(huán)的94°C 30 秒，56 °C 30秒，72 °C 45秒，最后進行72 °C 10分鐘。
[0019] (3)PCR產物純化
[0020] 每個反應體系總體積為5. 6 μ L。PCR產物4 μ L，再加入1. 6 μ LSAP酶混合物（SAP 酶、ΕχοΙ酶、去離子水）。反應條件為37°C 45分鐘，85°C 15分鐘。
[0021] (4)DNA測序反應
[0022] 每個反應的體系為總體積10ul，PCR酶解產物1 μ L、BigDyemix (Bigdye、 5 X seq) 2. 2 μ L和測序引物0. 5 μ L，加水補足10 μ L。反應條件為96°C lmin，進行33個循環(huán) 的 96°C 10sec，56°C 10sec，60°C2.5min。反應結束后每管內加入 2.5yLEDTA，30yL100% 乙醇，蓋好，震蕩4次，避光靜置15分鐘，3860rpm，25°C離心40min，吸棄上層液體；加入 100 μ L70 %預冷乙醇，蓋好，3860rpm，25°C離心15分鐘，吸棄上層液體；讓酒精在室溫揮發(fā) 干凈，加入8 μ LHi-Di溶解DNA ;在PCR儀上變性：95°C 4分鐘，冰上靜置4分鐘。放入測序 儀中。
[0023] 本發(fā)明所述的試劑盒用于檢測白化病II型致病基因 P基因的突變體，可以快速 方便地查出致病基因的攜帶者以及病人，可應用于產前診斷、阻止患兒出生，降低白化病II 型的發(fā)病率。
【附圖說明】
[0024] 圖1是實施例2中P基因第2外顯子測序結果示意圖；
[0025] 圖2是實施例2中P基因第3外顯子測序結果示意圖；
[0026] 圖3是實施例2中P基因第4外顯子測序結果示意圖；
[0027] 圖4是實施例2中P基因第5外顯子測序結果7K意圖；
[0028] 圖5是實施例2中P基因第6外顯子測序結果7K意圖；
[0029] 圖6是實施例2中P基因第7外顯子測序結果示意圖；
[0030] 圖7是實施例2中P基因第8外顯子測序結果7K意圖；
[0031] 圖8是實施例2中P基因第9外顯子測序結果7K意圖；
[0032] 圖9是實施例2中P基因第10外顯子測序結果7K意圖；
[0033] 圖10是實施例2中P基因第11外顯子測序結果示意圖；
[0034] 圖11是實施例2中P基因第12外顯子測序結果示意圖；
[0035] 圖12是實施例2中P基因第13外顯子測序結果示意圖；
[0036] 圖13是實施例2中P基因第14外顯子測序結果示意圖；
[0037] 圖14是實施例2中P基因第15外顯子測序結果7K意圖；
[0038] 圖15是實施例2中P基因第16外顯子測序結果示意圖；
[0039] 圖16是實施例2中P基因第17外顯子測序結果示意圖；
[0040] 圖17是實施例2中P基因第18外顯子測序結果7K意圖；
[0041] 圖18是實施例2中P基因第19外顯子測序結果7K意圖；
[0042] 圖19是實施例2中P基因第20外顯子測序結果7K意圖；
[0043] 圖20是實施例2中P基因第21外顯子測序結果示意圖；
[0044] 圖21是實施例2中P基因第22外顯子測序結果7K意圖；
[0045] 圖22是實施例2中P基因第23外顯子測序結果示意圖；
[0046] 圖23是實施例2中P基因第24外顯子測序結果示意圖；
[0047] 圖24是實施例2中P基因第25外顯子測序結果示意圖。
【具體實施方式】
[0048] 實施例1
[0049] -人份檢測白化病II型致病基因 P是否發(fā)生突變的試劑盒，包括以下成分：
[0050] (1)P基因第2到第25外顯子編碼區(qū)區(qū)PCR擴增與測序引物24對，每條引物10D， 引物序列參見表1 ;
[0051 ] (2) PCR 擴增試劑：Taq 酶混合液 7. 5 μ L (dNTP、10 X PCR 反應緩沖液、MgCl2);
[0052] (3) PCR產物純化試劑：1. 6 μ LSAP酶混合物（SAP酶、ΕχοΙ酶、去離子水）；
[0053] (3)測序試劑：2· 2 μ LBigDyemix (Bigdye、5X seq)、2· 5 μ LEDTA、30 μ L 乙醇溶液 (100% )、100yL 乙醇溶液（70% )、8yLHi-Di。
[0054] 本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復凍融。
[0055] 實施例2
[0056] -人份檢測白化病II型致病基因 P是否發(fā)生突變的試劑盒的使用步驟包括：
[0057] (1)提取樣本的基因組DNA ;
[0058] (2)P 基因 PCR 擴增
[0059] 針對P基因第2-25外顯子編碼區(qū)按照表1設計引物進行PCR擴增。每個反應體 系為總體積15ul，包含Taq酶混合液7. 5 μ L(dNTP、10XPCR反應緩沖液、MgCl2)、去離子水 5. 5μ L、引物（10uM)0. 5μ L、基因組DNA(100ng/ul)lul。反應條件為95°C 15分鐘，進行14個 循環(huán)（-0. 5 °C /循環(huán)）的94°C 30秒，63 °C 30秒，72 °C 45秒；然后進行30個循環(huán)的94°C 30 秒，56 °C 30秒，72 °C 45秒，最后進行72 °C 10分鐘。
[0060] (3)PCR產物純化
[0061] 每個反應體系為總體積5. 6 μ L。PCR產物4 μ L，再加入1. 6 μ LSAP酶混合物（SAP 酶、ΕχοΙ酶、去離子水）。反應條件為37°C 45分鐘，85°C 15分鐘。（4)DNA測序反應
[0062] 每個反應的體系為總體積10ul，PCR酶解產物1 μ L、BigDyemix (Bigdye、 5 X seq) 2. 2 μ L和測序引物0. 5 μ L，加水補足10 μ L。反應條件為96°C lmin，進行33個循 環(huán)的 96°C 10sec，56°C 10sec，6(TC 2.5min。
[0063] 反應結束后每管內加入2. 5 μ LEDTA，30 μ L100 %乙醇，蓋好，震蕩4次，避光靜 置15分鐘，3860rpm，25 °C離心40min，吸棄上層液體；加入100 μ L70 %預冷乙醇，蓋好， 3860rpm，25°C離心15分鐘，吸棄上層液體；讓酒精在室溫揮發(fā)干凈，加入8 μ LHi-Di溶解 DNA ;在PCR儀上變性：95°C 4分鐘，冰上靜置4分鐘。放入測序儀中。
[0064] (5)結果分析
[0065] 對P基因進行直接測序，在測序儀上進行結果讀取，用軟件Chromas查閱測序 檢測結果，測序結果示意圖如圖1至圖24。將測定的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫P基因序列 (NM_000275)進行比較，P基因序列如SEQN0. 1所示，對應編碼的氨基酸序列如SEQIDN0. 2 所示。
【主權項】
1. 一種檢測白化病II型致病基因 P基因是否發(fā)生突變的試劑盒，其特征在于包括以下 成分：P基因第2到第25外顯子編碼區(qū)PCR擴增與測序引物24對、PCR擴增試劑、PCR產物 純化試劑、DNA測序試劑；所述引物序列如下： 表1P基因第2-25外顯子編碼區(qū)的PCR擴增與測序引物序列2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述引物序列擴增出的DNA序列如 SEQIDNd 1 所示。3. 如權利要求1所述試劑盒的使用方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 提取樣本的基因組DNA ; (2) P基因 PCR擴增； 所述步驟（2) P基因 PCR擴增，采用權利要求1所述引物序列；每個PCR擴增體系總體 積為15 μ L，包含Taq酶混合液7. 5 μ L、去離子水5. 5 μ L、引物0. 5 μ L、基因組DNAlul ;PCR 反應條件為95°C 15分鐘，進行14個循環(huán)的94°C 30秒，63°C 30秒，72°C 45秒；然后進行30 個循環(huán)的94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 45秒，最后進行72°C 10分鐘； (3) PCR產物純化 每個反應體系總體積為5. 6 μ L，包括PCR產物4 μ L和I. 6 μ LSAP酶混合物，反應條件 為37 °C 45分鐘，85 °C 15分鐘； (4) DNA測序反應 每個反應的體系為總體積l〇ul，包括PCR酶解產物1 μ L、BigDyemix2. 2 μ L和測序引物 0. 5yL，余量為去離子水；反應條件為96°C lmin，進行33個循環(huán)的96°C 10sec，56°C lOsec， 60 °C 2. 5min ； 反應結束后每管內加入2. 5 μ LEDTA，30 μ LlOO%乙醇，蓋好，震蕩4次，避光靜置15分 鐘，3860rpm，25°C離心40min，吸棄上層液體；加入100μ L70%預冷乙醇，蓋好，3860rpm, 25°C離心15分鐘，吸棄上層液體；讓酒精在室溫揮發(fā)干凈，加入8 μ LHi-Di溶解DNA ;在PCR 儀上變性：95°C 4分鐘，冰上靜置4分鐘，放入測序儀中測序。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886597SQ201410199279
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年5月11日
【發(fā)明人】賀林, 馬端, 向天敏, 徐沁, 梅艷巧
【申請人】海門中科基因生物科技有限公司, 上海佰臻基因組學與人類健康研究所