一種β-葡萄糖苷酶基因及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種β?葡萄糖苷酶基因。所述β?葡萄糖苷酶基因從土壤總DNA中獲取，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1。本發(fā)明的β?葡萄糖苷酶不需要利用表面展示或者信號(hào)肽表達(dá)的技術(shù)就可直接使菌體利用纖維二糖，從而進(jìn)行丁二酸的生產(chǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種β-葡萄糖苷酶基因及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種β-葡萄糖苷酶基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)屬于水解酶。它可以水解并且結(jié)合末端、非還原性的 β-D-葡萄糖及相應(yīng)配基。該酶可以將纖維二糖或短鏈葡聚糖水解成葡萄糖。因其參與纖維 素水解的最后一步，所以常被認(rèn)為是纖維素水解糖化過(guò)程的限速酶。葡萄糖苷酶按照氨 基酸序列可以劃分為糖苷水解酶家族1和糖苷水解酶家族3兩類(lèi)。糖苷水解酶家族1中的酶 主要來(lái)源于細(xì)菌、植物和哺乳動(dòng)物;糖苷水解酶家族3中酶來(lái)源于真菌、細(xì)菌和植物。可見(jiàn)其 來(lái)源比較廣泛。β-葡萄糖苷酶一般通過(guò)表面展示和信號(hào)肽表達(dá)的方式達(dá)到在胞外分解纖維 二糖為葡萄糖，以此供給細(xì)胞利用生長(zhǎng)，目前尚未有葡萄糖苷酶不需要通過(guò)表面展示或 者信號(hào)肽表達(dá)就可以利用纖維二糖生長(zhǎng)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的技術(shù)目的之一，在于提供一種來(lái)自土壤總DNA的β-葡萄糖苷酶基因，所述 的土壤總DNA采集自南京工業(yè)大學(xué)東操場(chǎng)邊上小花園附近。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0005] 本發(fā)明所述的β-葡萄糖苷酶基因，來(lái)源于南京工業(yè)大學(xué)東操場(chǎng)邊上小花園附近土 壤總DNA，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。
[0006] 所述的β-葡萄糖苷酶基因是通過(guò)構(gòu)建土壤總DNA的基因組文庫(kù)，經(jīng)過(guò)一系列酶切、 酶連、轉(zhuǎn)化等手段獲得所需的陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序，獲得葡萄糖苷酶核苷酸 序列。再根據(jù)所得到序列設(shè)計(jì)引物通過(guò)PCR即獲得目的基因。優(yōu)點(diǎn)是方便快捷效率高。
[0007] 為獲得本發(fā)明所述β-葡萄糖苷酶基因，具體步驟為：
[0008] (1)樣品采集:土壤樣品采自南京工業(yè)大學(xué)東操場(chǎng)邊上小花園附近。
[0009] (2)土壤總DNA的提取:稱(chēng)取lg土壤樣品，加入lmL 0.1mol/mL、pH 8.0磷酸緩沖液 和玻璃珠，振蕩lmin，加入溶菌酶5mg，使溶菌酶最終濃度為2.5mg/mL，室溫振蕩15min，放置 冰箱30min，加125yL 20%SDS振蕩處理15min后離心，加酚（1:1體積)抽提1次，氯仿-異戊醇 (1:1體積)抽提2次，加0.6體積異丙醇，室溫放置lh，離心，70%乙醇清洗，30yL TE溶解。 [0010] (3)構(gòu)建土壤總DNA的基因組文庫(kù)：用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI將總DNA部分酶切，再經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳分離回收2_3kb的DNA片段，與脫磷載體pUCl 18 (BamHI/BAP) (TaKaRa，Code: D3321)連接后，化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入制備好的E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建基因組文庫(kù)。
[0011] 限制性?xún)?nèi)切酶Ecoia酶切總DNA體系為：總DNA15yL，10Xbuffer H 3yL，EcoRI 3μ L，加雙蒸水調(diào)至總體積30yL。
[0012] 37°C酶切30min。加入3yL 10 X loading buffer終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收2-3kb DNA片段?；厥瞻凑赵噭┖姓f(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0013] 酶切片段與脫磷載體pUCl 18(BamHI/BAP)的連接：
[0014] 將lyL pUC118(BamHI/BAP)載體DNA轉(zhuǎn)移到無(wú)菌微量離心管中，加入6yL總DNA的 EcoRI酶切回收片段，加水至8.5yL，于45 °C加溫5min使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻 至lJ〇 °C。然后加入lyL 10 X T4DNA連接酶緩沖液，0.5yL T4DNA連接酶。16 °C連接反應(yīng)12h以上。
[0015] ⑷酶連產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和獲取陽(yáng)性克隆:將l〇yL酶連產(chǎn)物加入到200yL在冰上融化后 的E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，在42°C水浴鍋中熱激90s后，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中 冷卻1~2min，向每管中加入800yL液體LB培養(yǎng)基，37°C搖床80-90rpm溫育45min，復(fù)蘇細(xì)胞。 4000rpm離心3min，剩余200yL感受態(tài)細(xì)胞涂布于含8mM pNPG和100mg/l氨芐青霉素的LB瓊 脂平板上，平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12-16h后出現(xiàn)菌落，選擇有天然變色的克隆子，即 為含β-葡萄糖苷酶基因片段的陽(yáng)性克隆子，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行編號(hào)。挑單菌落接種于 5mL LB液體試管，待長(zhǎng)出菌懸液后提質(zhì)粒驗(yàn)證。
[0016] (5)提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序，獲取β-葡萄糖苷酶核苷酸序列：陽(yáng)性克隆子插入片段 的測(cè)序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。測(cè)序引物為pUC118(BamHI/BAP)載體上特 異性引物，并根據(jù)兩端測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，直至將整個(gè)插入片段測(cè)通。
[0017] 將測(cè)序完成的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，并利用ORF finder工具鑒定插入片 段所含的0RF。
[0018] (6)引物的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)測(cè)序結(jié)果的基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，引物設(shè)計(jì)如下： [0019]設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為50mer左右的引物，該引物分為兩個(gè)部分，P1的第一部分是上游載體末 端同源序列，第二部分是基因特異性正向擴(kuò)增序列。P2的第一部分是基因特異性反向擴(kuò)增 序列，第二部分是下游載體末端同源序列。
[0020] 利用PCR進(jìn)行β-葡萄糖苷酶基因擴(kuò)增，在50yL反應(yīng)體系中，P1、P2兩個(gè)引物的添加 量為 lyL，擴(kuò)增條件為:94°C 預(yù)熱 10min;94°C，45s;60°C，45s;72°C，2.5min;72°C，10min，* 間三步共30個(gè)循環(huán)，使用的DNA聚合酶為2 XPhanta?Master Mix酶(諾唯贊公司，中國(guó)）。
[0021] PCR結(jié)束后，1.5 %瓊脂糖膠回收片段，測(cè)定濃度。同時(shí)對(duì)于表達(dá)載體pET-28a( + )用 限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI酶切線性化，1.5 %瓊脂糖膠回收片段，測(cè)定濃度。計(jì)算最適克隆載體使 用量（=0.02 X克隆載體堿基對(duì)數(shù))ng和最適插入片段使用量（=0.04 X插入片段堿基對(duì) 數(shù))ng(例如，將長(zhǎng)度為2kb的插入片段克隆至長(zhǎng)度為5kb的克隆載體時(shí)，克隆載體的最適使 用量應(yīng)為：0.02 X 5000 = 100ng;插入片段最適使用量應(yīng)為：0.04 X 2000 = 80ng)。利用One Step Cloning Kit試劑盒(諾唯贊公司）進(jìn)行重組反應(yīng)。37°C反應(yīng)30min后轉(zhuǎn)化到DH5a感受 態(tài)中。獲得長(zhǎng)度為2775bp的SEQ ID N0:1序列的陽(yáng)性克隆，即為本發(fā)明的β-葡萄糖苷酶基 因。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種重組載體，所述重組載體含有上述的β-葡萄糖苷酶基因。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有上述重組載體。
[0024]所述宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞。
[0025] 所述原核細(xì)胞可為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。
[0026]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，具體可采用如下技術(shù)方案:將上述SEQ ID N0:1序列直接與 原核表達(dá)載體pET-28a( + )連接，37°C反應(yīng)30min。將該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a。將菌 液涂布在含30yg/mL卡那霉素霉素的固體LB培養(yǎng)基（2 %蛋白胨，1 %酵母粉，1 %NaCl，1~ 2%瓊脂)培養(yǎng)后獲得單菌落。挑取單菌落用5mL液體LB試管培養(yǎng)過(guò)夜，提質(zhì)粒，進(jìn)行單雙酶 切驗(yàn)證。選取驗(yàn)證正確質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。將菌液涂布含30yg/mL卡那 霉素的固體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得單菌落。
[0027] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述β-葡萄糖苷酶基因在生產(chǎn)丁二酸中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明的β-葡萄糖苷酶是一種新型β-葡萄糖苷酶，它是一類(lèi)應(yīng)用非常廣泛的生物 酶類(lèi)。通過(guò)對(duì)該基因的原核表達(dá)和純化，可以應(yīng)用于該酶的工業(yè)化生產(chǎn)中。本發(fā)明的葡萄 糖苷酶不需要利用表面展示或者信號(hào)肽表達(dá)的技術(shù)就可直接使菌體利用纖維二糖，從而進(jìn) 行丁二酸的生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為以本發(fā)明β-葡萄糖苷酶基因在E.coli BL21(pET-28a( + ))中高效表達(dá)實(shí)驗(yàn) 方案圖。
[0030] 圖2為本發(fā)明β-葡萄糖苷酶的最適溫度曲線圖。
[0031] 圖3位本發(fā)明β-葡萄糖苷酶的溫度的穩(wěn)定性曲線圖。
[0032] 圖4為本發(fā)明β-葡萄糖苷酶的最適pH曲線圖。
[0033]圖5為本發(fā)明β-葡萄糖苷酶的pH的穩(wěn)定性曲線圖。
[0034] 圖6為金屬離子對(duì)本發(fā)明β-葡萄糖苷酶酶活的影響柱狀圖。
[0035] 圖7為有機(jī)溶劑對(duì)本發(fā)明β-葡萄糖苷酶酶活的影響柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案 而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解， 可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍， 其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
[0037] 本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說(shuō)明，均購(gòu)自西格瑪-奧奧德里奇（Sigma-Aldrich)公 司。
[0038] 本發(fā)明涉及分子生物實(shí)驗(yàn)，若未特別注明，均參考自《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》一書(shū)(J. 薩姆布魯克、D. W.拉塞爾著，2002，科學(xué)出版社。）
[0039] 實(shí)施例1獲取β-葡萄糖苷酶基因
[0040] 本實(shí)施例說(shuō)明獲取本發(fā)明所述β-葡萄糖苷酶基因的方法。具體步驟如下：
[0041] (1)樣品采集:土壤樣品采自南京工業(yè)大學(xué)東操場(chǎng)邊上小花園附近。
[0042] (2)土壤總DNA的提取:稱(chēng)取lg土壤樣品，加入lmL 0.1mol/mL、pH 8.0磷酸緩沖液 和玻璃珠，振蕩lmin，加入溶菌酶5mg，使溶菌酶最終濃度為2.5mg/mL，室溫振蕩15min，放置 冰箱30min，加125yL 20%SDS振蕩處理15min后離心，加酚（1:1體積)抽提1次，氯仿-異戊醇 (1:1體積)抽提2次，加0.6體積異丙醇，室溫放置lh，離心，70%乙醇清洗，30yL TE溶解。 [0043] (3)構(gòu)建土壤總DNA的基因組文庫(kù)：用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI將總DNA部分酶切，再經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳分離回收2_3kb的DNA片段，與脫磷載體pUCl 18 (BamHI/BAP) (TaKaRa，Code: D3321)連接后，化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入制備好的E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建基因組文庫(kù)。
[0044] 限制性?xún)?nèi)切酶Ecoia酶切總DNA體系為：總DNA15yL，10Xbuffer H 3yL，EcoRI 3μ L，加雙蒸水調(diào)至總體積30yL。
[0045] 37°C酶切30min。加入3yL 10 X loading buffer終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收2-3kb DNA片段。回收按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0046] 酶切片段與脫磷載體pUCl 18(BamHI/BAP)的連接：
[0047] 將lyL pUC118(BamHI/BAP)載體DNA轉(zhuǎn)移到無(wú)菌微量離心管中，加入6yL總DNA的 EC0RI酶切回收片段，加水至8.5yL，于45 °C加溫5min使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻 至lJ〇 °C。然后加入lyL 10 X T4DNA連接酶緩沖液，0.5yL T4DNA連接酶。16 °C連接反應(yīng)12h以上。 [0048] (4)酶連產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和獲取陽(yáng)性克?。簩?0yL酶連產(chǎn)物加入到200yL在冰上融化后 的E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，在42°C水浴鍋中熱激90s后。快速轉(zhuǎn)移到冰浴中 冷卻1~2min，向每管中加入800yL液體LB培養(yǎng)基，37°C搖床80-90rpm溫育45min，復(fù)蘇細(xì)胞。 4000rpm離心3min，剩余200yL感受態(tài)細(xì)胞涂布于含8mM pNPG和100mg/l氨芐青霉素的LB瓊 脂平板上，平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12-16h后出現(xiàn)菌落，選擇有天然變色的克隆子，即 為含β-葡萄糖苷酶基因片段的陽(yáng)性克隆子，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行編號(hào)。挑單菌落接種于 5mL LB液體試管，待長(zhǎng)出菌懸液后提質(zhì)粒驗(yàn)證。
[0049] (5)提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序，獲取β-葡萄糖苷酶核苷酸序列：陽(yáng)性克隆子插入片段 的測(cè)序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。測(cè)序引物為pUC118(BamHI/BAP)載體上特 異性引物，并根據(jù)兩端測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，直至將整個(gè)插入片段測(cè)通。
[0050] 將測(cè)序完成的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，并利用ORF finder工具鑒定插入片 段所含的0RF。
[0051] (6)引物的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)測(cè)序結(jié)果的基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，利用PCR進(jìn)行β-葡 萄糖苷酶基因擴(kuò)增，PCR結(jié)束后，用1.5%瓊脂糖膠回收片段，測(cè)定濃度，即獲取本發(fā)明所述 β-葡萄糖苷酶基因。
[0052]實(shí)施例2β_葡萄糖苷酶基因的擴(kuò)增
[0053]本實(shí)施例說(shuō)明β_葡萄糖苷酶基因擴(kuò)增的具體過(guò)程。
[0054] 參看圖1，用PCR方式來(lái)克隆本發(fā)明的β-葡萄糖苷酶基因。設(shè)計(jì)的引物分別如下：
[0055] 上游引物PI :Tm = 66.7,45mer;引物序列如下：
[0056] CAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAAAGTAAAATCAACATGG；
[0057] 下游引物P2:Tm = 68.7,52mer;引物序列如下：
[0058] TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTACTTTTTTGCCTTTTCTGTAGAGGTTGCC；
[0059]利用PCR進(jìn)行β-葡萄糖苷酶基因擴(kuò)增，在50yL反應(yīng)體系中，P1、P2兩個(gè)引物的添加 量為 lyL，擴(kuò)增條件為:94°C 預(yù)熱 10min;94°C，45s;55°C，45s;72°C，2.5min;72°C，10min，* 間三步共30個(gè)循環(huán)，使用的DNA聚合酶為2 XPhanta?Master Mix酶(諾唯贊公司，中國(guó)）。 [0060] PCR結(jié)束后，1.5%瓊脂糖膠回收片段，測(cè)定濃度。計(jì)算最適克隆載體使用量（= 0.02 X克隆載體堿基對(duì)數(shù))ng和最適插入片段使用量（=0.04 X插入片段堿基對(duì)數(shù))ng，利 用One Step Cloning Kit試劑盒(諾唯贊公司）進(jìn)行重組反應(yīng)。37°C反應(yīng)30min后轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)中。獲得長(zhǎng)度為2775bp的陽(yáng)性克隆，即為本發(fā)明的β-葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序 列如SEQ ID Ν0:1所示。
[0061 ]實(shí)施例3β_葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中表達(dá)
[0062] 將上述SEQ ID Ν0:1序列直接與原核表達(dá)載體pET-28a( + )連接，37°C反應(yīng)30min。 將該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a。將菌液涂布含30yg/mL氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)配 方為:2 %蛋白胨，1 %酵母粉，1 %NaCl，1~2 %瓊脂)培養(yǎng)后獲得單菌落。挑取單菌落用5mL 液體LB試管培養(yǎng)過(guò)夜，提質(zhì)粒，進(jìn)行單雙酶切驗(yàn)證。選取驗(yàn)證正確質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 E.coli BL21(DE3)。將菌液涂布含30μg/mL氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得單菌落。 再挑取單菌落用5mL液體LB試管培養(yǎng)過(guò)夜，提質(zhì)粒，進(jìn)行單雙酶切驗(yàn)證，選取驗(yàn)證正確的菌 落，接種到50mL液體LB培養(yǎng)基（2 %蛋白胨，1 %酵母粉，1 % NaCl)中，37 °C搖床培養(yǎng)，直到菌 液濃度達(dá)到OD600為0.6~0.8時(shí)，用終濃度為0.3mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行 誘導(dǎo)表達(dá)，25°(：，150印111，誘導(dǎo)2011。
[0063]實(shí)施例4β_葡萄糖苷酶的純化
[0064]將實(shí)施例3最終獲得的培養(yǎng)液在4°C，8000rpm離心10min獲得菌體，用預(yù)冷的50mM Tris-HCl緩沖液(PH=8.5)洗滌三次，最后用預(yù)冷的lOOmMTris-HCl緩沖液(PH=8.5)重懸。 超聲破碎得到初酶液，4°C下，12000rpm離心30min，用微孔濾膜過(guò)濾離心好的上清，用Ni-Agarose柱子純化出目的蛋白。將目的蛋白透析后用蛋白保存液保存起來(lái)。
[0065]實(shí)施例5β_葡萄糖苷酶的酶動(dòng)力學(xué)特性分析
[0066] β-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)特性分析主要底物為pNPG。反應(yīng)采用實(shí)施例4中的體系。主要 測(cè)定酶對(duì)底物的1和最大反應(yīng)速度Vmax。也就是說(shuō)在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物 濃度對(duì)酶促反應(yīng)的速度有很大的影響。在底物濃度很低時(shí)，酶促反應(yīng)的速度(v)隨底物濃度 的增加而迅速增加;隨著底物濃度的繼續(xù)增加，反應(yīng)速度的增加開(kāi)始減慢；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾?到某種程度時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值(V max)。
[0067] 底物濃度與反應(yīng)速度的這種關(guān)系可用Michaelis-Menten方程式表示：
[0069]式中：V-反應(yīng)速度;Km_米氏常數(shù);Vmax-酶反應(yīng)最大速度；[S]-底物濃度。
[0070] 采用Linewaver-Burk作圖法測(cè)定1(111、'\^￡?，該法是根據(jù)米氏方程的倒數(shù)形式，以1八 對(duì)1/[S]作圖，得到一條直線。直線在橫軸上的截距為-1/Km，縱截距為1/Vmax，求出K m與Vmax。 所述方程如下所示：
[0072]在這里我們所用的底物的濃度是：pNPG(從0.5mM到8mM)。所得到的結(jié)果如表1所 不。
[0073] 表 1
[0074]
[0075]實(shí)施例6β_葡萄糖苷酶的生理生化特性分析
[0076]對(duì)實(shí)施例4中保存的蛋白酶液做特定的生理生化特性分析。本過(guò)程是在下述酶反 應(yīng)體系中進(jìn)行的：80yL的lOOmM Tris-HCl緩沖液(ρΗ=8.5)加入100yL的8mM的pNPG底物，40 。(:預(yù)熱2min后，加入20yL適當(dāng)稀釋的酶液開(kāi)始反應(yīng)，在40°C下反應(yīng)10min，加入100yL的0.5M 的Na2C03終止反應(yīng)。然后在405nm處測(cè)量對(duì)硝基酚的釋放量。在這里我們定義一定數(shù)量的酶 在每分鐘催化ΙμΜ的對(duì)硝基酚的活力為1U』-葡萄糖苷酶的蛋白濃度是使用Micro-Spectrophotometer K5500來(lái)分析的。
[0077] 我們分析的生理生化特性主要有酶的最適溫度，酶的溫度穩(wěn)定性，酶的最適pH，pH 的穩(wěn)定性，金屬離子對(duì)酶活的影響，有機(jī)溶劑對(duì)酶活的影響。圖中相對(duì)活性是指在最適溫度 和最適pH條件下測(cè)定得到的酶活，以此為100%的基準(zhǔn)，其他條件下測(cè)得活性與之比較從而 得到的比值即為該條件下的相對(duì)活性。
[0078] 在研究酶的最適反應(yīng)的溫度時(shí)，反應(yīng)的溫度從20°C開(kāi)始，每隔10°C，一直到80°C。 每個(gè)體系做3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)（以下每個(gè)反應(yīng)都是3次重復(fù)），研究結(jié)果如圖2所示，從圖中可知， 本發(fā)明的葡萄糖苷酶在20-50°C具有較高酶活，其中最適溫度為40°C，溫度超過(guò)50°C的時(shí) 候酶活力快速下降，超過(guò)60 °C后基本沒(méi)有酶活。
[0079] 在研究酶的溫度穩(wěn)定性時(shí)，主要測(cè)定酶在20,30,40和50°C這四個(gè)不同溫度處理酶 液，然后在最適溫度下測(cè)定酶的殘余活性，研究結(jié)果如圖3所示，從圖中可知，本發(fā)明的β-葡 萄糖苷酶酶活力隨著時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸降低。在20 °C條件下酶活最穩(wěn)定，30-40°C條件下活力 依次下降，在50°C的情況下，酶穩(wěn)定性迅速降低至無(wú)活性。可見(jiàn)較低的溫度更適合保存該 酶。
[0080]在研究酶的最適pH時(shí)，選擇不同的緩沖液，主要有檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液 (0· 1Μ，ρΗ4· 0-6.0)，磷酸鹽緩沖液（0· 1Μ，ρΗ6· 0-8.0)，Tris-HCl緩沖液（0·05Μ，ρΗ8·0-9.0)，甘氨酸-似0!1緩沖液(0.051，？!18.5-10.0) ;研究結(jié)果如圖4所示，從圖中可知，不同？!1 對(duì)酶活力有影響，當(dāng)pH處于酸性環(huán)境下，酶活力較低。其中最適pH為8.5,該酶在堿性環(huán)境下 比在酸性環(huán)境下有更好的酶活力。
[0081 ] 在研究酶的pH穩(wěn)定性時(shí)，是先將酶在不同的pH緩沖液中，在4°C下處理24h，然后在 最適pH下測(cè)定酶的殘余活性;研究結(jié)果如圖5所示，從圖中可知，該酶在堿性條件下比酸性 條件下更穩(wěn)定，且在最適pH下穩(wěn)定性最好。
[0082]在金屬離子對(duì)酶活的影響，有機(jī)溶劑對(duì)酶活的影響是將酶用不同的影響因素處 理，然后在酶的最佳反應(yīng)體系中測(cè)定酶的殘余活性。研究結(jié)果如圖6-圖7所示，從圖中可以 看出，基本所有的金屬離子對(duì)該酶都有激活作用，其中Fe 2+的激活作用最明顯;有機(jī)溶劑中 除了SDS和Tritonx-100對(duì)該酶有激活作用，其他有機(jī)試劑都起到抑制作用，尿素的抑制作 用最強(qiáng)。
[0083] 經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，酶在40°C，pH8.5時(shí)活性最高。
[0084] 實(shí)施例7
[0085] 本實(shí)施例通過(guò)實(shí)驗(yàn)描述β-葡萄糖苷酶基因在生產(chǎn)丁二酸中的應(yīng)用，來(lái)說(shuō)明本發(fā)明 葡萄糖苷酶應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)越性。
[0086] 采用本發(fā)明β-葡萄糖苷酶基因生產(chǎn)丁二酸的步驟具體如下：
[0087] (1)構(gòu)建質(zhì)粒pTrc99a_bglB，導(dǎo)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)中。
[0088]其中β-葡萄糖苷酶基因(bg 1B)的獲取方法。具體步驟如下：
[0089]①樣品采集:土壤樣品采自南京工業(yè)大學(xué)東操場(chǎng)邊上小花園附近。
[0090] ②土壤總DNA的提取:稱(chēng)取lg土壤樣品，加入lmL 0.1mol/mL、pH 8.0磷酸緩沖液和 玻璃珠，振蕩lmin，加入溶菌酶5mg，使溶菌酶最終濃度為2.5mg/mL，室溫振蕩15min，放置冰 箱30min，加125yL 20%SDS振蕩處理15min后離心，加酚（1:1體積)抽提1次，氯仿-異戊醇（1 :1體積)抽提2次，加0.6體積異丙醇，室溫放置lh，離心，70%乙醇清洗，30yL TE溶解。
[0091] ③構(gòu)建土壤總DNA的基因組文庫(kù)：用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI將總DNA部分酶切，再經(jīng)瓊 脂糖凝膠電泳分離回收2-3kb的DNA片段，與脫磷載體pUC118(BamHI/BAP)(TaKaRa，C 〇de: D3321)連接后，化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入制備好的E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建基因組文庫(kù)。
[0092] 限制性?xún)?nèi)切酶EcoR頂每切總DNA體系為：總DNA15yL，10Xbuffer H 3yL，EcoRI 3μ L，加雙蒸水調(diào)至總體積30yL。
[0093] 37°C酶切30min。加入3yL 10 X loading buffer終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收2-3kb DNA片段?；厥瞻凑赵噭┖姓f(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0094] 酶切片段與脫磷載體pUCl 18(BamHI/BAP)的連接：
[0095] 將lyL pUC118(BamHI/BAP)載體DNA轉(zhuǎn)移到無(wú)菌微量離心管中，加入6yL總DNA的 EC0RI酶切回收片段，加水至8.5yL，于45 °C加溫5min使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻 至lJ〇 °C。然后加入lyL 10 X T4DNA連接酶緩沖液，0.5yL T4DNA連接酶。16 °C連接反應(yīng)12h以上。 [0096]④酶連產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和獲取陽(yáng)性克?。簩?0yL酶連產(chǎn)物加入到200yL在冰上融化后 的E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，在42°C水浴鍋中熱激90s后。快速轉(zhuǎn)移到冰浴中 冷卻1~2min，向每管中加入800yL液體LB培養(yǎng)基，37°C搖床80-90rpm溫育45min，復(fù)蘇細(xì)胞。 4000rpm離心3min，剩余200yL感受態(tài)細(xì)胞涂布于含8mM pNPG和100mg/l氨芐青霉素的LB瓊 脂平板上，平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12-16h后出現(xiàn)菌落，選擇有天然變色的克隆子，即 為含β-葡萄糖苷酶基因片段的陽(yáng)性克隆子，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行編號(hào)。挑單菌落接種于 5mL LB液體試管，待長(zhǎng)出菌懸液后提質(zhì)粒驗(yàn)證。
[0097]⑤提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序，獲取β-葡萄糖苷酶核苷酸序列：陽(yáng)性克隆子插入片段 的測(cè)序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。測(cè)序引物為pUC118(BamHI/BAP)載體上特 異性引物，并根據(jù)兩端測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，直至將整個(gè)插入片段測(cè)通。
[0098] 將測(cè)序完成的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，并利用0RF finder工具鑒定插入片 段所含的0RF。
[0099]⑥用PCR方式來(lái)克隆本發(fā)明的β-葡萄糖苷酶基因。設(shè)計(jì)的引物分別如下：
[0100] 上游引物PI :Tm = 66,40mer;引物序列如下：
[0101] GCCTGCAGGTCGACTCTAGATTACTTTTTTGCCTTTTCTG；
[0102] 下游引物？2:1'111 = 63,4〇11161';引物序列如下：
[0103] GGAAACAGACCATGGAATTCGTGAAAGTAAAATCAACATG；
[0104]利用PCR進(jìn)行β-葡萄糖苷酶基因擴(kuò)增，在50yL反應(yīng)體系中，P1、P2兩個(gè)引物的添加 量為 lyL，擴(kuò)增條件為:94°C 預(yù)熱 10min;94°C，45s;55°C，45s;72°C，2.5min;72°C，10min，* 間三步共30個(gè)循環(huán)，使用的DNA聚合酶為2 XPhanta?Master Mix酶(諾唯贊公司，中國(guó)）。 [0105] PCR結(jié)束后，1.5 %瓊脂糖膠回收片段，測(cè)定濃度。同時(shí)對(duì)于表達(dá)載體pTrc99a用限 制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和Xbal酶切線性化，1.5%瓊脂糖膠回收片段，測(cè)定濃度。計(jì)算最適克隆載 體使用量（=〇. 02 X克隆載體堿基對(duì)數(shù))ng和最適插入片段使用量（=0.04 X插入片段堿基 對(duì)數(shù))ng，利用One Step Cloning Kit試劑盒(諾唯贊公司）進(jìn)行重組反應(yīng)。37°C反應(yīng)30min 后轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)中。
[0106] (2)提取質(zhì)粒，驗(yàn)證質(zhì)粒正確后，將正確的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌SUC260感受態(tài)中，繼 續(xù)驗(yàn)證，完成菌株構(gòu)建suc26〇-pTrc99a_bglB。
[0107] (3)以菌suc260-pTrc99a為對(duì)照菌，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。先在5mL LB試管里過(guò)夜生長(zhǎng)， 再轉(zhuǎn)接到50mL LB的搖瓶中，37°C，200rpm生長(zhǎng)，至OD600為0.6~0.8時(shí)用IPTG誘導(dǎo)，終濃度為 0.3mM; 25°C，150rpm培養(yǎng)6~8h。用離心管收集菌液后用純水洗3遍，目的是為了洗掉原來(lái)的 LB培養(yǎng)基。最后用純水重懸菌泥，使最終OD55Q控制在4左右，然后向血清瓶中加入菌液，接種 量為10%，其中，血清瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基為AM1培養(yǎng)基，唯一碳源為30g/L的纖維二糖，裝液量為 30mL。接種前用C0 2氣體預(yù)先混勻培養(yǎng)基中的纖維二糖和堿式碳酸鎂，約混勻lmin，然后進(jìn) 行接種，取初樣后向每個(gè)血清瓶中再次通C0 2氣體，目的是是菌液和培養(yǎng)基充分混勻并且保 證厭氧狀態(tài)。37°C，180rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后取終樣。經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵產(chǎn)物中丁二酸的質(zhì)量收率 為0.85g/g(即丁二酸對(duì)纖維二糖的收率）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -種重組載體，其特征在于，所述重組載體含有權(quán)利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基 因。3. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求2所述的重組載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述原核細(xì)胞為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)〇
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK105969751SQ201610424102
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月14日
【發(fā)明人】姜岷, 薛夢(mèng)蕾, 董維亮, 馬江鋒
【申請(qǐng)人】南京工業(yè)大學(xué)