一種耐鹽芽孢桿菌株的固定化培養(yǎng)方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于工業(yè)廢水處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐鹽芽孢桿菌株的固定化培養(yǎng)方法，主要包括如下步驟：將耐鹽芽孢桿菌種接種于耐鹽培養(yǎng)基中活化生長；將活化生長后的耐鹽芽孢桿菌接種至活化平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)；將活化平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)完成的菌株接種至含有磁性納米材料的耐鹽培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)；將培養(yǎng)基體系在磁場中靜置、分離，并離心收集負載磁性納米顆粒的耐鹽芽孢桿菌沉淀。本發(fā)明所培養(yǎng)的負載磁性納米顆粒的耐鹽芽孢桿菌株可應(yīng)用于處理工業(yè)廢水，具有易與廢水分離、不易流失、操作簡單、成本低廉以及降解效率高的特點。CICC No.2387020150211
【專利說明】
_種耐鹽芽孢桿菌株的固定化培養(yǎng)方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于工業(yè)廢水處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐鹽芽孢桿菌株的固定化培養(yǎng) 方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 含有偶氮染料廢水、重金屬Cr(VI)廢水和苯酚廢水是較常見的幾種工業(yè)廢水。其 特點是可生化性差，鹽度高，排放量大，污染源主要有化妝品廠、冶金廠、化工廠、紡織廠、電 鍍廠等，若不經(jīng)過有效處理而排放，通過水體和土壤的擴散，嚴重威脅區(qū)域的動植物及人體 健康。
[0003] 加之此類工業(yè)廢水的排放過程中，往往會含有高濃度的鹽，較為常見的鹽濃度范 圍為5~15 %。一般認為當鹽濃度超過0.3 %時，即可引起細菌株的質(zhì)壁分離而死亡，進而對 生化處理設(shè)施中的微生物群體帶來危害，嚴重時可造成處理系統(tǒng)的癱瘓。因此，此類廢水很 難通過傳統(tǒng)的物化聯(lián)合生化處理而達到排放標準。而通過對耐鹽菌株Bacillus sp.的增殖 培養(yǎng)，再投加入到處理此類廢水的生化處理系統(tǒng)中，即可有效避免此類活性菌株株的流失， 亦可大幅度提高其處理廢水的能力。
[0004] Bacillus sp.菌株株一種兼性厭氧細菌株，在環(huán)境工程的廢水處理中應(yīng)用較為廣 泛，包括提取微生物絮凝劑、降解染料、重金屬和有機污染物等領(lǐng)域;然而利用新型的固定 化培養(yǎng)方法且在高鹽濃度條件下對多種污染進行有效降解，國內(nèi)外尚未提及。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種耐鹽芽孢桿菌株的固 定化培養(yǎng)方法及應(yīng)用。
[0006] 技術(shù)方案:本發(fā)明所述的一種耐鹽芽孢桿菌株的固定化培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0007] (1)將耐鹽芽孢桿菌種按接種率0.5~1.5 %接種于耐鹽培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，使耐 鹽芽孢桿菌種在高鹽環(huán)境下活化生長;震蕩培養(yǎng)過程中搖床溫度為25~35°C，轉(zhuǎn)速為100~ 200rpm，時間為 12 ~18h;
[0008] (2)將步驟（1)中活化后的耐鹽芽孢桿菌接種至活化平板培養(yǎng)基上，置入30~35°C 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~36h;
[0009] (3)將步驟(2)中活化平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)完成的菌株按接種率0.5~1.5%接種至 含有磁性納米材料的耐鹽培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，使耐鹽芽孢桿菌附著在磁性納米顆粒上生 長;震蕩培養(yǎng)過程中搖床溫度為30~35°C，轉(zhuǎn)速為100~200rpm，時間為18~36h，得到負載 磁性納米顆粒的耐鹽芽孢桿菌；
[0010] (4)將步驟(3)中完成附著生長的培養(yǎng)基體系在磁場中靜置、分離，并離心收集負 載磁性納米顆粒的耐鹽芽孢桿菌沉淀。
[0011] 進一步地，所述耐鹽芽孢桿菌株為GS-4-08(Bacillus sp.);保藏名稱為芽孢桿 菌;保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號6號 樓;保藏日期：2011年9月9日；保藏編號：CICC No.23870。
[0012] 進一步地，所述耐鹽芽孢桿菌株的篩選方法包括如下步驟：
[0013] (1)取5~20g曬鹽地的土壤樣品，分別置于100~200ml含偶氮染料、重鉻酸鉀、和 苯酸的高鹽廢水中厭氧處理5~10天；
[0014] (2)取上述厭氧處理完畢的廢水5~10ml，分別接種于新鮮配置的100~200ml含偶 氮染料、重鉻酸鉀和苯酚的高鹽廢水中再次厭氧處理5~10天；
[0015] (3)重復(fù)步驟(2)3~5次;取最后一次處理完畢的廢水50~100μΙ均勻涂布于活化 平板培養(yǎng)基上，待生長12~24h后，標記平板培養(yǎng)基上的單菌落；
[0016] (4)挑取培養(yǎng)基上的單菌落，接種于富集培養(yǎng)基中好氧生長12~36h，后全部置于 100-200ml含偶氮染料的高鹽廢水中進行厭氧處理2~4小時，記錄脫色效果最明顯的菌株；
[0017] (5)將步驟(4)中的菌株經(jīng)16sRNA鑒定分析，得出細菌名稱，保藏于公共保藏中心。
[0018] 進一步地，所述耐鹽培養(yǎng)基的pH值為6~8,其配比為：葡萄糖5~10g/L，KH2P〇4l.5 ~3.5g/L，Na 2HP〇4 8~12g/L，NaCl 50~200g/L，MgS〇4 0.4~0.6g/L，F(xiàn)eS〇4 0.005~ 0.015g/L，NH4Cl 1~3g/L;
[0019] 所述活化平板培養(yǎng)基的pH值為7,其配比為：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊 脂15g，加水至1L。
[0020]進一步地，所述磁性納米材料顆粒為四氧化三鐵，其粒徑為1~100nm，其向耐鹽培 養(yǎng)基的添加量為100~300mg/L。
[0021] 采用上述的固定化培養(yǎng)方法制備得到的負載磁性納米顆粒的耐鹽芽孢桿菌可應(yīng) 用于處理工業(yè)廢水。
[0022] 進一步地，所述工業(yè)廢水為偶氮染料廢水、重金屬Cr (VI)廢水、苯酚廢水和含鐵酸 性廢水中的任意一種或幾種的混合液。
[0023] 進一步地，廢水處理過程采用厭氧處理方式或好氧處理方式。
[0024]進一步地，所述工業(yè)廢水為偶氮染料廢水和/或重金屬Cr(VI)廢水，處理過程采用 厭氧處理方式，處理溫度為25~45°C。
[0025] 進一步地，所述工業(yè)廢水為苯酚廢水和/或含鐵酸性廢水，處理過程采用好氧處理 方式，處理溫度為4~45°C。
[0026] 為檢驗該菌株對廢水處理的效果，將按照上述方法制備的負載磁性納米顆粒的耐 鹽芽孢桿菌投入到人工合成的工業(yè)廢水基中，在溫度為25、30、35、40、45 °C、轉(zhuǎn)速為150rpm 的搖床里對廢水中的污染物厭氧或好氧處理6~24小時，并定時取樣分析降解數(shù)據(jù)。
[0027]生物材料保藏：
[0028]本發(fā)明采用的微生物由芽孢桿菌(Bacillus sp.)誘變篩選而成，該菌株命名為芽 孢桿菌(Baci 1 lus sp.)，為公眾可得的微生物菌株，細菌的菌落圓點狀，淡黃色，表面光滑， 已保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，保藏編號CICC No. 23870，保藏日期：2011年9月9 日。保藏單位的地址:北京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號6號樓。
[0029]有益效果:本發(fā)明將芽孢桿菌菌種接種至含有磁性納米材料的高鹽培養(yǎng)基中，使 該菌種在磁性納米材料上好氧附著生長，進行誘變篩選，并進一步采用固定化培養(yǎng)法培養(yǎng) 得到負載磁性納米粒子的耐鹽芽孢桿菌，該負載磁性納米粒子的耐鹽芽孢桿菌可應(yīng)用于多 種工業(yè)廢水的處理中，且具有易與廢水分離、不易流失、操作簡單、成本低廉以及降解效率 高的特點，特別是對于含偶氮染料、重金屬Cr(VI)、苯酚以及含鐵酸性高鹽廢水的處理上， 效果尤其顯著；采用本發(fā)明提供的負載磁性納米粒子的耐鹽芽孢桿菌可在厭氧條件下將 150mg/L的重鉻酸鉀、含鹽量為15 %的廢水在12h內(nèi)降解接近100 % ;可在厭氧條件下對 500mg/L的甲基紅、含鹽量為15 %的廢水在6h內(nèi)脫色完畢；可在好氧條件下對100mg/L的苯 酚、含鹽量為15%的廢水在24h內(nèi)降解率達到45%，效果明顯，利用價值高。
【附圖說明】
[0030]圖1為本發(fā)明培養(yǎng)得到的負載磁性納米粒子的耐鹽芽孢桿菌的電子顯微照片；
[0031 ]圖2為本發(fā)明培養(yǎng)得到的負載磁性納米粒子的耐鹽芽孢桿菌落狀態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0032]下面通過實施例對本發(fā)明技術(shù)方案進行詳細說明，但是本發(fā)明的保護范圍不局限 于所述實施例。
[0033] 實施例1:
[0034] 1.1、耐鹽芽孢桿菌株的篩選：
[0035] (1)取15g曬鹽地的土壤樣品，分別置于150ml含偶氮染料、重鉻酸鉀、和苯酚的高 鹽廢水中厭氧處理8天；
[0036] (2)取上述厭氧處理完畢的廢水8ml，分別接種于新鮮配置的150ml含偶氮染料、重 鉻酸鉀和苯酚的高鹽廢水中再次厭氧處理8天；
[0037] (3)重復(fù)步驟(2)4次；取最后一次處理完畢的廢水80μ1均勻涂布于活化平板培養(yǎng) 基上，待生長24h后，標記平板培養(yǎng)基上的單菌落；
[0038] (4)挑取培養(yǎng)基上的單菌落，接種于富集培養(yǎng)基中好氧生長24h，后全部置于150ml 含偶氮染料的高鹽廢水中進行厭氧處理3小時，記錄脫色效果最明顯的菌株；
[0039] (5)將步驟(4)中的菌株經(jīng)16sRNA鑒定分析，得出細菌名稱，保藏于公共保藏中心； 該菌株為GS~4~08(Bacillus sp.);保藏名稱為芽孢桿菌;保藏于中國工業(yè)微生物菌種保 藏中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號6號樓;保藏日期:2011年9月9日；保藏編 號:CICC No. 23870。該菌株的菌落呈圓點狀，淡黃色，表面光滑，如圖1所示，為本發(fā)明培養(yǎng) 得到的負載磁性納米粒子的耐鹽芽孢桿菌的電子顯微照片。
[0040] 1.2、耐鹽芽孢桿菌株的固定化培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0041 ] (1)用移液槍將耐鹽芽孢桿菌液從菌種保存管中移取lOOyL，按接種率1 %接種于 含有耐鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，在35°C、轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床里震蕩12小時，使芽孢桿菌種在 高鹽環(huán)境下活化生長；
[0042] (2)用接種環(huán)蘸取少量步驟（1)中的菌液，接種至活化平板培養(yǎng)基上，置入30~35 °(：的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;
[0043] (3)用接種環(huán)挑取活化平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)完成的菌株接種至含有磁性納米材料的 耐鹽培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，使耐鹽芽孢桿菌附著在磁性納米顆粒上生長;震蕩培養(yǎng)過程中搖 床溫度為30~35°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，時間為24h，得到負載磁性納米顆粒的耐鹽芽孢桿菌；
[0044] 將步驟(3)中完成附著生長的培養(yǎng)基體系在磁場中靜置三小時以上，利用磁場將 菌落與培養(yǎng)液初步分離，然后離心收集負載磁性納米顆粒的耐鹽芽孢桿菌沉淀。
[0045] 本實施例中，所述的耐鹽培養(yǎng)基pH值為7,其配比為：葡萄糖5g/L，KH2P〇4 2g/L， Na2HP〇4 10g/L，NaCl 150g/L，MgS〇4 0.5g/L，F(xiàn)eS〇4 0.01g/L，NH4Cl 2g/L;含有粒徑為2~ 50nm的四氧化三鐵磁性材料200mg/L;
[0046] 所述的活化平板培養(yǎng)基pH值為7,其配比為：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊 脂15g，加水至1L。
[0047] 實施例2:將實施例1中培養(yǎng)得到的負載磁性納米粒子的耐鹽芽孢桿菌應(yīng)用于含偶 氮染料的高鹽廢水處理中，具體過程如下：
[0048]將濃度為50~300mg/L的負載磁性納米粒子的耐鹽芽孢桿菌株，按體積比1.5 %投 入到含鹽濃度為15%、含甲基紅濃度為500mg/L的人工合成廢水中進行降解效果檢驗，并將 整個體系置于厭氧反應(yīng)器中，向厭氧反應(yīng)器中通入5min氮氣，密閉后置入低速振蕩器中震 蕩培養(yǎng)。設(shè)置搖速50rpm，在降解1小時、2小時和6小時分別取適量液體經(jīng)過磁場分離、離心、 再取上清液在分光光度計中420nm處進行讀數(shù)。本實施例分為五組平行試驗，每一組的降解 溫度分別設(shè)置在25、30、35、40、45 °C，實驗結(jié)果見表1。
[0049]表1本發(fā)明名菌株對含甲基紅的高鹽廢水處理效果
[0051 ]^實施例3:將實施例1中培養(yǎng)得到的負載磁性納米粒子的耐鹽芽孢桿菌應(yīng)用于含重 鉻酸鉀的高鹽廢水處理中，具體過程如下：
[0052]將濃度為50~300mg/L的負載磁性納米粒子的耐鹽芽孢桿菌株，按體積比1 %投入 到含鹽濃度為15%、重鉻酸鉀濃度為150mg/L的人工合成廢水中進行降解效果檢驗，并將整 個體系置于厭氧反應(yīng)器中，向厭氧反應(yīng)器中通入5min氮氣，密閉，置入低速振蕩器中震蕩培 養(yǎng)。設(shè)置搖速50rpm，每隔8小時取適量液體經(jīng)過磁場分離、離心、再取上清液在原子吸收分 光光度計和化學滴定法進行分析測量。本實施例分為五組平行試驗，每一組的降解溫度分 別設(shè)置在25、30、35、40、45 °C，實驗結(jié)果見表2。
[0053]表2本發(fā)明名菌株對含重鉻酸鉀的高鹽廢水處理效果
[0055]實施例4:將實施例1中培養(yǎng)得到的負載磁性納米粒子的耐鹽芽孢桿菌應(yīng)用于含苯 酚的高鹽廢水處理中，具體過程如下：
[0056]將濃度為50~300mg/L的負載磁性納米粒子的耐鹽芽孢桿菌株，按體積比1.2 %投 入含鹽濃度為15%、含苯酚濃度為lOOmg/1的人工合成廢水中，進行降解效果檢驗，將整個 體系置于好氧反應(yīng)器中，并置入振蕩器中震蕩培養(yǎng)。設(shè)置搖速150rpm，每隔4小時取適量液 體經(jīng)過磁場分離、離心、再取上清液在氣相色譜氫火焰離子檢測器進行分析測量。本實施例 分為五組平行試驗，每一組的降解溫度分別設(shè)置在25、30、35、40、45°(：，實驗結(jié)果見表3。 [0057]表3本發(fā)明名菌株對含苯酚的高鹽廢水處理效果
[0059]如上所述，盡管參照特定的優(yōu)選實施例已經(jīng)表示和表述了本發(fā)明，但其不得解釋 為對本發(fā)明自身的限制。在不脫離所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神和范圍前提下，可對 其在形式上和細節(jié)上作出各種變化。
【主權(quán)項】
1. 一種耐鹽芽孢桿菌株的固定化培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 將耐鹽芽孢桿菌種按接種率0.5~1.5%接種于耐鹽培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，使耐鹽芽 孢桿菌種在高鹽環(huán)境下活化生長；震蕩培養(yǎng)過程中搖床溫度為25~35°C，轉(zhuǎn)速為100~ 200rpm，時間為 12 ~18h; (2) 將步驟（1)中活化后的耐鹽芽孢桿菌接種至活化平板培養(yǎng)基上，置入30~35°C的培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~36h; (3) 將步驟(2)中活化平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)完成的菌株按接種率0.5~1.5%接種至含有 磁性納米材料的耐鹽培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，使耐鹽芽孢桿菌附著在磁性納米顆粒上生長;震 蕩培養(yǎng)過程中搖床溫度為30~35°C，轉(zhuǎn)速為100~200rpm，時間為18~36h，得到負載磁性納 米顆粒的耐鹽芽孢桿菌； (4) 將步驟(3)中完成附著生長的培養(yǎng)基體系在磁場中靜置、分離，并離心收集負載磁 性納米顆粒的耐鹽芽孢桿菌沉淀。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐鹽芽孢桿菌株的固定化培養(yǎng)方法，其特征在于:所述耐鹽芽 孢桿菌株為GS-4-08(Bacillus sp.)，該菌株的菌落呈圓點狀，淡黃色，表面光滑。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的耐鹽芽孢桿菌株的固定化培養(yǎng)方法，其特征在于:所述耐鹽芽 孢桿菌株的篩選方法包括如下步驟： (1) 取5~20g曬鹽地的土壤樣品，分別置于100~200ml含偶氮染料、重鉻酸鉀、和苯酚 的高鹽廢水中厭氧處理5~10天； (2) 取上述厭氧處理完畢的廢水5~10ml，分別接種于新鮮配置的100~200ml含偶氮染 料、重鉻酸鉀和苯酚的高鹽廢水中再次厭氧處理5~10天； (3) 重復(fù)步驟（2)3~5次；取最后一次處理完畢的廢水50~100μΙ均勻涂布于活化平板 培養(yǎng)基上，待生長12~24h后，標記平板培養(yǎng)基上的單菌落； (4) 挑取培養(yǎng)基上的單菌落，接種于富集培養(yǎng)基中好氧生長12~36h，后全部置于100-200ml含偶氮染料的高鹽廢水中進行厭氧處理2~4小時，記錄脫色效果最明顯的菌株，保存 待用； (5) 將步驟(4)中的菌株經(jīng)16sRNA鑒定分析，得出細菌名稱，保藏于公共保藏中心。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐鹽芽孢桿菌株的固定化培養(yǎng)方法，其特征在于:所述耐鹽培 養(yǎng)基的pH值為6~8，其配比為：葡萄糖5~10g/L，KH 2P〇4 1 ·5~3·5g/L，Na2HP〇4 8~12g/L， NaCl 50~200g/L，MgS〇4 0.4~0.6g/L，F(xiàn)eS〇4 0.005~0.015g/L，NH4Cl 1~3g/L; 所述活化平板培養(yǎng)基的pH值為7,其配比為：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂 15g，加水至1L。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的耐鹽芽孢桿菌株的固定化培養(yǎng)方法，其特征在于:所述磁性納 米材料顆粒為四氧化三鐵，其粒徑為1~l〇〇nm，其向耐鹽培養(yǎng)基的添加量為100~300mg/L。6. 采用權(quán)利要求1~5任一項所述的固定化培養(yǎng)方法制備得到的負載磁性納米顆粒的 耐鹽芽孢桿菌在處理工業(yè)廢水中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述工業(yè)廢水為偶氮染料廢水、重金屬Cr (VI)廢水、苯酚廢水和含鐵酸性廢水中的任意一種或幾種的混合液。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:廢水處理過程采用厭氧處理方式或好氧處 理方式。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述工業(yè)廢水為偶氮染料廢水和/或重金 屬Cr(VI)廢水，處理過程采用厭氧處理方式，處理溫度為25~45°C。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述工業(yè)廢水為苯酚廢水和/或含鐵酸性 廢水，處理過程采用好氧處理方式，處理溫度為4~45 °C。
【文檔編號】C02F3/28GK105969759SQ201610414974
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】付博, 虞磊, 周喬, 劉立清, 王立文, 高靜靜
【申請人】江蘇瑞達環(huán)?？萍加邢薰? 南京林業(yè)大學