乙型肝炎病毒的耐藥突變位點(diǎn)和基因型檢測試劑盒及其使用方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乙型肝炎病毒的耐藥突變位點(diǎn)和基因型檢測試劑盒及其使用方法和應(yīng)用；該試劑盒包括：核酸擴(kuò)增試劑和雜交試劑；其中，所述核酸擴(kuò)增試劑包括：如SEQ ID NO.1?2所示的引物；雜交試劑包括：如SEQ ID NO.3?31所示的探針。該試劑盒的使用方法包括：1)樣本的核酸提??；2)擴(kuò)增試劑配制；3)PCR擴(kuò)增；4)雜交反應(yīng)；5)熒光反應(yīng)；6)檢測；7)根據(jù)檢測反應(yīng)體系中的熒光信號值來確定HBV的耐藥性突變和基因型情況。本發(fā)明能夠同時檢測10個乙肝耐藥突變位點(diǎn)和4種基因型，并能減少人工操作步驟，提高測試速度、通量。
【專利說明】
乙型肝炎病毒的耐藥突變位點(diǎn)和基因型檢測試劑盒及其使 用方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種乙型肝炎病毒（HBV)的檢測試劑盒及其使用方法和應(yīng)用，特別是 涉及一種乙型肝炎病毒的耐藥突變位點(diǎn)和基因型檢測試劑盒及其使用方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎是一種由HBV感染引起的疾病，呈全球性分布，全世界有超過20億的人 群感染過HBV，其中，有3億5千萬為慢性HBV感染者。我國是世界上乙肝和肝癌患者最多 的國家，約占全球四分之一以上（9300萬乙肝病毒攜帶者和2000萬慢性乙肝患者）。使用 核苷類似物治療乙肝已經(jīng)成為目前全世界臨床治療乙肝的主流，但在乙肝治療過程中，不 能正確理解抗病毒治療的意義和采取規(guī)范的抗病毒治療，已使乙肝病毒變異、耐藥逐漸成 為抗病毒治療道路上最大的絆腳石。
[0003] 5種常見的核苷類乙肝治療藥物：拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定、替 諾福韋酯。用于核苷初治患者時，某些核苷類藥物的耐藥發(fā)生率相對較高，如拉米夫定和阿 德福韋的五年耐藥率分別70%和29%。
[0004] HBV國內(nèi)分型情況：HBV被劃分為A-ι九個基因型，我國主要存在A、B、C、D四個基 因型，以B型和C型為主，共約占90%以上。不同的乙型肝炎病毒基因型對現(xiàn)有藥物治療可 能存在不同的治療響應(yīng)，乙肝的基因分型檢測越來越被關(guān)注。
[0005] 乙型肝炎耐藥和分型檢測方法如下：
[0006] 目前使用的方法主要檢測基因型耐藥，包括直接測序、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性 片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP)、序列特異性PCR、線性探針雜交技術(shù)（LiPA)、反向膜雜交及固 相基因芯片等，但對各種方法的準(zhǔn)確度作對比與評價的報道不多。
[0007] 其中，直接測序是最直接的方法，能檢測多個位點(diǎn)突變和區(qū)別基因型，是臨床上用 的最多的方法，但該方法操作繁瑣，檢測時間長，費(fèi)用較高，而且在出現(xiàn)混合突變或者混和 基因型情況下，只能檢測到占種池20 %量的序列。
[0008] PCR-RFLP方法是一種簡明和較為完善的方法，以錯配PCR結(jié)合限制性片段長度多 態(tài)性方法，快速檢測患者體內(nèi)YMDD變異株的發(fā)生情況，該方法通過錯配PCR引入獨(dú)特的酶 切位點(diǎn)，再用酶切分析，圖譜簡單，容易判斷，此方法具有較好的可靠性和可行性，但由于酶 切方法只能檢測單點(diǎn)突變，對于可能伴隨其它變異需經(jīng)過測序分析，因此實際應(yīng)用中應(yīng)結(jié) 合PCR-RFLP篩檢和PCR產(chǎn)物克隆后測序互相證實和補(bǔ)充。
[0009] 線性探針雜交技術(shù)除了能夠?qū)BV進(jìn)行基因分型外，能夠同時檢測耐藥株和野生 株，結(jié)果相對準(zhǔn)確，但檢測通量低，操作繁瑣，價格昂貴。
[0010] 對于反向膜雜交，讀取速度快，缺點(diǎn)是通量低，操作繁瑣，易污染，結(jié)果讀取因人而 異。
[0011] 固相基因芯片是將寡核苷酸片段作為探針有序以及高（或低）密度地固定于基質(zhì) 載體上，與待測的用熒光（或者生物素）標(biāo)記的待測核酸按照堿基配對原則進(jìn)行雜交，該方 法實現(xiàn)高通量檢測，但是操作繁瑣，自動化程度低。
[0012] 因此，乙肝耐藥和分型檢測試劑盒仍由國外產(chǎn)品主導(dǎo)，價格昂貴，在國內(nèi)尚無普遍 應(yīng)用，無法滿足我國對于乙肝病毒耐藥與分型的市場需求，因而，急需要開發(fā)一種操作簡 便、價格低、快速準(zhǔn)確、高通量的乙肝耐藥和分型檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種乙型肝炎病毒的耐藥突變位點(diǎn)和基因型檢 測試劑盒及其使用方法和應(yīng)用。該試劑盒是一種人類乙肝耐藥和基因分型的液相芯片檢測 試劑盒，其是基于液相芯片檢測法，采用帶條碼的磁珠結(jié)合不同的探針，再通過熒光信號來 判斷耐藥位點(diǎn)的突變情況和基因型，對臨床用藥具有指導(dǎo)意義，而且該試劑盒具有操作簡 便、靈敏度高且能檢測多個耐藥位點(diǎn)突變和常見基因型等優(yōu)點(diǎn)。
[0014] 本發(fā)明中，以人類看家基因 β-globin作為內(nèi)標(biāo)和HBV病毒同時經(jīng)歷核酸提取、 PCR擴(kuò)增、雜交等過程，可以監(jiān)測整個檢測過程，保證結(jié)果的有效性。
[0015] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的乙型肝炎病毒的耐藥突變位點(diǎn)和基因型檢測試劑 盒，包括：核酸擴(kuò)增試劑和雜交試劑；
[0016] 其中，所述核酸擴(kuò)增試劑包括：如SEQ ID N0. 1-2所示的引物；
[0017] 雜交試劑包括：如SEQ ID N0. 3-31所示的探針【即如SEQ ID N0. 3-30所示的用于 耐藥突變位點(diǎn)和基因型檢測的探針、如SEQ ID N0. 30所示的內(nèi)標(biāo)探針（1C)以及如SEQ ID NO. 31所示的質(zhì)控（QC)探針】。
[0018] 所述SEQ ID N0. 2所示引物的5'端還連接有生物素（BIOTIN)。
[0019] 所述SEQ ID N0. 3-31所示探針的5'端可標(biāo)記有amin〇-C6。
[0020] 進(jìn)一步地，所述雜交試劑包括：與帶有編號的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)后的如SEQ ID NO. 3-31所示的探針。通過上述探針與有編號的磁珠上氨基結(jié)合成整體，一個編號連接一個 探針，在本發(fā)明中使用上述探針可對乙肝耐藥10個位點(diǎn)和4個基因型在同一樣本孔中進(jìn)行 檢測，實現(xiàn)高通量檢測，檢測時間短，操作簡便可實現(xiàn)自動化檢測。

[0025] 上述的29個探針（SEQ ID Nos :3-31)包括以下：
[0026] 抗拉米夫定，替比夫定藥物的5個突變類型：173 (V - L)，180 (L - Μ)，181 (A - T)， 204(M -W(M-I)以及對應(yīng)的 4 個正常對照（V173，L180，A181，M204);
[0027] 抗阿德福韋酯藥物的3個突變類型：181 (A -Τ) ΛΑ -V)，236 (N - T)以及對應(yīng) 的2個正常對照（A181，N236);
[0028] 抗恩替卡韋藥物和替諾福韋酯藥物的6個突變類型：169(1 - T)，184(T - G)， 202 (S - G) AS - I)，250 (Μ - V)，194 (A - Τ)以及對應(yīng)的 5 個正常對照（1691，184Τ，202S， 250M，194A);以及
[0029] 區(qū)分4基因型的探針A、B、C、D。
[0030] 所述與帶有編號的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)后的如SEQ ID NO. 3-31所示的探針，其制備方法 可為包括以下步驟的方法：
[0031] A.將29種不同編號（如可為1~29)的磁珠溶液（如1ml)分別轉(zhuǎn)移到管中，離 心（如2500~3500rpm離心1~3分鐘），去除上清液；其中，磁珠溶液的濃度可為250K個 磁珠 /ml ;該磁珠可米用商業(yè)化產(chǎn)品；
[0032] B.取MEST溶液（如200~400 μ 1)分別加入每管中，離心（如2500~3500rpm 離心1~3分鐘），去除上清液；
[0033] 其中，MEST溶液是含體積濃度為0· 01% -0· 05% Tween20(吐溫20)和50mM~ 100mM pH5~7的MES(2-嗎啉乙磺酸）的混合溶液；
[0034] C.重復(fù)步驟B -次；
[0035] D.加入水（優(yōu)選超純水125 μ 1)、4XMEST溶液（即含體積濃度為0· 04% -0· 20% Tween20和200mM~400mM pH5~7的MES混合溶液，優(yōu)選取75 μ 1 4XMEST溶液），并且 分別對應(yīng)每種磁珠加入如SEQ ID Ν0. 3-31所示的探針；
[0036] 其中，探針濃度優(yōu)選為50~100 μ M，探針的加入量可為10~20 μ 1。
[0037] Ε·配制含10mg/ml~5mg/ml EDC(N_(3_二甲基氨丙基）_Ν'-乙基碳二亞胺， 10mg，購自SIGMA公司）的MEST溶液，將其加入到每個磁珠管中，震蕩（室溫）；
[0038] 如可將1管EDC(N-(3-二甲基氨丙基）-N'_乙基碳二亞胺，10mg，購自SIGMA公 司）從-18°C新鮮取出，加入1~2ml冷MEST溶液（2~8°C )，震蕩混勻后，迅速取60~ 80 μ 1加入到每個磁珠管中，震蕩后，放入恒溫震蕩儀中，室溫震蕩1000~1400rpm，15~ 30分鐘；
[0039] F.重復(fù)步驟E -次；
[0040] G.將TNT溶液（如500~800 μ 1)加入磁珠管中，震蕩混勻，離心（如2500~ 3500rpm離心1~3分鐘），去除上清液；
[0041] 其中，TNT 溶液是含 25 ~50mM Tris-HCl、0. 05 ~0· 2M NaCl、0. 01 ~0· 05vol% (體積百分?jǐn)?shù)）Tween 20的溶液；
[0042] Η·重復(fù)步驟G -次；
[0043] I.將濃度為lg/100ml~5g/100ml的SDS溶液（如500~800 μ 1)加入磁珠管 中，緩慢滾動混勻，盡量避免氣泡的產(chǎn)生，離心（如2500~3500rpm離心1~3分鐘），去除 上清液。
[0044] J.重復(fù)步驟G-次，用上述TNT溶液洗滌磁珠。
[0045] K.加入TE溶液（如1. 5ml)，得到與帶有編號的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)后的探針。也可進(jìn) 行如下操作：加入TE溶液（如1.5ml)后，2~8°C保存，備用。磁珠制備完成。其中，TE溶 液是含有10~30mM Tris-HCl和1~5mM EDTA的pH7~8的溶液。
[0046] 所述核酸擴(kuò)增試劑還可包括：核酸擴(kuò)增所需的其他試劑，如包括：KC1、Tris-HCl 緩沖液、Taq 酶、UNG 酶、dNTPs 和 MgCl2。
[0047] 所述雜交試劑還包括：雜交液、熒光反應(yīng)液、雜交洗液和檢測液。
[0048] 其中，雜交液的組分為：TMAC(四甲基氯化銨）2~5M、Tris-HCl 20~60mM pH8、 N_ 月桂醜肌氛酸納（Sarkosyl)O. lg/100ml ~0· 5g/100ml、EDTA 4 ~8mM。
[0049] 突光反應(yīng)液包括：SAPE(鏈霉親和素-R-藻紅蛋白，Streptavidin R-Phycoerythrin Conjugate) ;SAPE可采用商業(yè)化產(chǎn)品。其中，SAPE其可與被探針捕獲的 PCR產(chǎn)物上的Biotin相結(jié)合，最終在芯片熒光檢測儀上進(jìn)行檢測。
[0050] 雜交洗液的組分為：Na2HP040 . 2 ~0· 6M、NaH2P0425mM ~55mM、NaCl 0· 15-0. 50M、 體積濃度為10~30%的Tween20。
[0051] 檢測液的組分為：Na2HP040 . 2 ~0· 6M、NaH2P0425mM ~55mM、NaCl 0· 15-0. 50M、體 積濃度為10~30%的Tween20、體積濃度為0· 2~0· 5%的Triton x-100(聚乙二醇辛基 苯基醚）。
[0052] 另外，所述試劑盒還可包括：核酸提取試劑、陽性對照品（即HBV耐藥和分型檢測 陽性對照品）、陰性對照品、雜交質(zhì)控品以及內(nèi)標(biāo)。
[0053] 其中，所述核酸提取試劑包括：磁珠懸浮液。
[0054] 所述磁珠懸液，可采用商業(yè)化產(chǎn)品，如可包括：chemagen公司的順磁性氧化娃納 米磁珠的懸浮液（磁珠為購自chemagen公司的M-PVA011型號的磁珠，該磁珠可通過納米 技術(shù)對超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁 珠）。
[0055] 另外，所述核酸提取試劑還可包括以下組分：
[0056] 1)裂解液，其是含異硫氰酸胍和TritonX-100的溶液，或者該裂解液是含異硫氰 酸胍和Tween-20的溶液；其中，裂解液中的異硫氰酸胍的濃度為2M~6M，TritonX-100或 Tween-20的體積濃度為1 %~2% ;
[0057] 2)結(jié)合液，其是含高氯酸鹽、醋酸鹽和有機(jī)溶劑的水溶液；其中，高氯酸鹽 包括：高氯酸鈉；醋酸鹽包括：醋酸鈉；有機(jī)溶劑包括：乙醇；高氯酸鹽的濃度優(yōu)選為 17g/100mL~30g/100mL，醋酸鹽的濃度優(yōu)選為lg/100mL~10g/100mL，有機(jī)溶劑的體積濃 度優(yōu)選為40 %~60%。
[0058] 優(yōu)選地，結(jié)合液的配制方法為：取200g_300g高氯酸鈉、20g_40g醋酸鈉溶解于少 量純化水中，然后加入400-600mL無水乙醇，并用純化水定容至1L即可。
[0059] 3)洗液A，其是含高氯酸鈉、醋酸鹽和乙醇的水溶液，其中，高氯酸鈉的濃度優(yōu)選 為lOg/lOOmL~30g/100mL，醋酸鹽（包括：醋酸鈉）的濃度優(yōu)選為4g/100mL~15g/100mL， 乙醇的體積濃度優(yōu)選為35%~50%。
[0060] 優(yōu)選地，洗液A的配制方法為：取200g-300g高氯酸鈉、40g-60g醋酸鈉、溶解于少 量純化水中，然后加入350ml-500ml無水乙醇，并用純化水定容至1L即可。
[0061] 4)洗液B，其為體積濃度40%~80%的乙醇；
[0062] 5)洗脫液，其為 10 ~20mM ρΗ8· 0 的 Tris-HCl。
[0063] 6)蛋白酶 K。
[0064] 7) RNA 的聚合酶 A (Poly Α)。
[0065] 上述陽性對照品，優(yōu)選地，其是包含如SEQ ID NO. 32所示序列的質(zhì)粒（即一種HBV 突變質(zhì)粒），監(jiān)測樣本測試過程的準(zhǔn)確性。其中，如SEQ ID NO. 32所示序列是根據(jù)HBV基因 的180M和204V突變以及其它8個野生型位點(diǎn)169、173、181、184,194, 202, 236、250和基因 B型而設(shè)計的。另外，更優(yōu)選地，上述陽性對照品為包含如SEQ ID N0. 32所示序列的pUC57 質(zhì)粒。
[0066] 陰性對照品，是由HBV病毒陰性血清液配制為陰性對照品，監(jiān)控樣本測試過程的 準(zhǔn)確性。
[0067] 優(yōu)選地，雜交質(zhì)控品，是如SEQ ID N0. 33所示的一段核酸序列；該雜交質(zhì)控品的中 間序列與如SEQ ID N0. 31所示的質(zhì)控探針相互補(bǔ)，因此，用QC探針檢測該雜交質(zhì)控品，檢 測信號標(biāo)示為HQC。監(jiān)控整個雜交過程的準(zhǔn)確性。雜交質(zhì)控品的序列為5' -3'：TGAAGAGGA ATATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAACGATAGC(SEQ ID Ν0· 33)。
[0068] 優(yōu)選地，內(nèi)標(biāo)為一種包含人類看家基因 β -globin序列的質(zhì)粒，更優(yōu)選包含人類 看家基因 β-globin序列的pUC57質(zhì)粒，進(jìn)一步優(yōu)選包含人類看家基因 β-globin序列的 5'端連接有SEQ ID NO. 1序列且3'端連接SEQ ID N0. 2序列的pUC57質(zhì)粒，即進(jìn)一步優(yōu)選 包含如SEQ ID N0. 34所示的pUC57質(zhì)粒。內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增時，內(nèi)標(biāo)模板和樣本得引物都為表1所 /_J、1 〇
[0069] SEQ ID Ν0· 34 :5'-GAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCGAACCGGTGAGTGTGGCT CCACAGGGTGAGC CTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCT-3'。
[0070] 另外，本發(fā)明還公開了上述試劑盒的使用方法，即利用上述試劑盒檢測乙肝病毒 的耐藥性突變和基因型的方法（可利用96孔板進(jìn)行的檢測方法），包括步驟：
[0071] 1)樣本的核酸提取
[0072] 利用上述的核酸提取試劑，并按照常規(guī)的磁珠法，對樣本、上述陽性對照和陰性對 照同時進(jìn)行核酸提取，得到PCR模板，并且上述內(nèi)標(biāo)在進(jìn)行核酸提取之前加入每個樣本中， 內(nèi)標(biāo)的加入量可為5~10 μ 1/樣本；
[0073] 其中，樣本包括：血清或者血漿等；
[0074] 2)擴(kuò)增試劑配制：
[0075] 反應(yīng)Α液，其組分為：鹽緩沖液、Taq酶、UNG酶和dNTPs ;
[0076] 其中，鹽緩沖液的終濃度為含30~60mM KC1的10~20mM ρΗ8· 0-8. 5的Tris-HCl 緩沖液；
[0077] Taq 酶 3 ~7U/test (3 ~7U/ 次檢測）；
[0078] UNG 酶 0· 1 ~0· 5U/test (0· 1 ~0· 5U/ 次檢測）；
[0079] dNTPs (10 ~30mM dATP，10 ~30mM dTTP，10 ~30mM dCTP，10 ~30mM dGTP，10 ~ 30mM dUTP)〇
[0080] 反應(yīng)B液：含如SEQ ID NO. 1所示的引物F和如SEQ ID NO. 2所示的引物R的 MgCl2溶液；其中，引物F的濃度為50~ΙΟΟηΜ，引物R的濃度為200~500nM，MgCl 2的濃 度為 20-60mM ;
[0081] 將反應(yīng)A液和反應(yīng)B液混合形成擴(kuò)增試劑。其中，反應(yīng)A液和反應(yīng)B液的混合體 積比可為1:2~1:4 ;
[0082] 3) PCR擴(kuò)增：在步驟1)中的PCR模板中分別加入步驟2)的擴(kuò)增試劑進(jìn)行PCR擴(kuò) 增反應(yīng)；
[0083] 其中，對于反應(yīng)A液中的UNG酶，在開始PCR擴(kuò)增步驟之前，進(jìn)行37°C保溫2mins， 隨后50°C保溫5mins對UNG酶進(jìn)行滅活。
[0084] PCR擴(kuò)增方法包括以下步驟：
[0085] Step 1 :37°C 2min 1 個循環(huán)；
[0086] Step 2 :5CTC 5min 1 個循環(huán)；
[0087] Step 3 :94°C 5min 1 個循環(huán)；
[0088] St印 4 :94°C 30s，6(TC 45s ;50 個循環(huán)；
[0089] Step 5 ：72°C 7min ；
[0090] St印 6:10。(：保存；
[0091] 4)雜交反應(yīng)：將與帶有編號的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)后的如SEQ ID NO. 3-31所示的探針 和上述雜交液混合后（每種磁珠在每個測試中為25~50個），加入到PCR產(chǎn)物中，放置恒 溫振蕩器上50~60°C、1200~1400rpm進(jìn)行雜交反應(yīng)15-30min，同時，雜交質(zhì)控品參與整 個雜交過程,監(jiān)測雜交的有效性。
[0092] 5)熒光反應(yīng)：吸除雜交反應(yīng)物的上清，將底部的磁珠中加入上述熒光反應(yīng)液【如， SAPE (購自QIAGEN，稀釋濃度至2~8 μ g/ml)反應(yīng)液100~200 μ 1】，放入振蕩器上振蕩反 應(yīng) 5_15min〇
[0093] 6)檢測：熒光反應(yīng)產(chǎn)物用上述雜交洗液洗滌后，加入上述檢測液，在液相芯片檢 測儀上進(jìn)行熒光檢測；具體可為：將熒光反應(yīng)產(chǎn)物用洗板機(jī)進(jìn)行條洗，用上述雜交洗液洗 板3-6次，沖液量350 μ 1，靜置間隔20-60秒每次，洗板結(jié)束后加入50~100 μ 1上述檢測 液，在液相芯片檢測儀上進(jìn)行熒光檢測。
[0094] 7)根據(jù)檢測反應(yīng)體系中的熒光信號值來確定HBV的耐藥性突變和基因型情況。 [0095] 再者，本發(fā)明還公開了上述試劑盒的應(yīng)用，即所述試劑盒用于檢測以下的耐藥位 點(diǎn)和乙型肝炎病毒型別；
[0096] 其中，耐藥位點(diǎn)包括：I169T、V173L、L180M、A181V/T、T184G、Α194Τ、S202G/I、 M204V/I、N236T、M250V，即第169位的I - Τ的突變位點(diǎn)、第173位的V - L的突變位點(diǎn)、第 180位的L - Μ的突變位點(diǎn)、第181位的A - V的突變位點(diǎn)或第181位的A - T的突變位 點(diǎn)、第184位的T - G的突變位點(diǎn)、第194位的A - T的突變位點(diǎn)、第202位的S - G的突 變位點(diǎn)或第202位的S - I的突變位點(diǎn)、第204位的Μ - V的突變位點(diǎn)或第204位的Μ - I 的突變位點(diǎn)、以及第250位的Μ - V的突變位點(diǎn)；
[0097] 型別包括：乙型肝炎病毒基因型Α、基因型Β、基因型C和基因型D。
[0098] 本發(fā)明的試劑盒采用磁珠提取法用于HBV核酸提取，該法運(yùn)用納米技術(shù)對超順磁 性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在 微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結(jié)合。利用氧化硅納米微球的超順磁性，在 Chaotropic鹽（鹽酸胍、異硫氰酸胍等）的作用下,使血液、動物組織、食品、病原微生物等 樣本中的細(xì)胞裂解，然后向裂解液中加入磁珠，當(dāng)溶液的pH值小于6. 5時，磁珠選擇性的與 提取的DNA/RNA結(jié)合，此時將吸附有DNA/RNA的磁珠置于磁場中，通過緩沖液去除沒有被吸 附的雜質(zhì)（蛋白等），然后將磁珠置于pH值8. 5的緩沖液中，純化的DNA/RNA即可進(jìn)入緩沖 液中，然后用于作為后續(xù)PCR擴(kuò)增的模板。磁珠法提取核酸既可以保證較高的核酸提取效 率，同時有利于HBV核酸檢測過程自動化的實行。
[0099] 本發(fā)明采用基因芯片雜交原理，設(shè)計了針對乙肝耐藥區(qū)域和乙肝分型區(qū)域的引 物，進(jìn)過PCR擴(kuò)增HBV的特異性核酸序列，針對不同的耐藥位點(diǎn)和不同基因型，設(shè)計針對HBV 耐藥位點(diǎn)雜交探針和基因分型探針，與帶編碼的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)，經(jīng)過PCR得到的擴(kuò)增產(chǎn)物 與固定在帶編碼磁珠上的已知序列的單鏈核酸探針進(jìn)行雜交。與探針雜交成功的PCR產(chǎn)物 通過自身末端所帶的生物素 biotin與后加入的鏈霉親和素-藻紅蛋白SAPE結(jié)合產(chǎn)生熒光 信號。將磁珠洗滌后在Applied Biocode 1000A熒光分析平臺上讀取磁珠的編碼及磁珠上 因與DNA雜交產(chǎn)生的熒光信號來判斷與何種探針結(jié)合，從而進(jìn)行HBV分型和耐藥位點(diǎn)檢測。
[0100] 由此可知，本發(fā)明與直接測序法比較，本發(fā)明的試劑盒操作簡單、價格便宜、易實 現(xiàn)自動化且靈敏度優(yōu)于直接測序法；與PCR-RFLP方法相比較，本發(fā)明的試劑盒，可以檢測 多位點(diǎn)的突變，而且實現(xiàn)高通量的檢測；與熒光定量PCR相比較，本發(fā)明的試劑盒檢測多達(dá) 10個耐藥位點(diǎn)和4種國內(nèi)主要基因型的檢測，免于熒光定量PCR的通道限制；與線性探針 雜交技術(shù)相比較，本發(fā)明的試劑盒通量高、價格便宜、操作相對簡單；與固相芯片相比較，本 發(fā)明的試劑盒具有通量高、靈敏度高、可實現(xiàn)自動化操作等優(yōu)點(diǎn)。
[0101] 此外，本發(fā)明還具有如下有益效果：
[0102] 1)本發(fā)明采用人類看家基因為內(nèi)標(biāo)對整個HBV檢測過程進(jìn)行監(jiān)控，有效地避免了 樣本在采集、運(yùn)輸保存以及在提取過程和雜交過程中的操作不當(dāng)而造成的假陰性；
[0103] 2)本發(fā)明采用芯片雜交方法，并能夠同時檢測10個乙肝耐藥突變位點(diǎn)和4種基因 型，跟熒光定量PCR相比較，能在同一個檢測孔中實現(xiàn)多位點(diǎn)的檢測，不受熒光通道限制， 并能夠有效地提高樣本處理通量，可實現(xiàn)自動化檢測；
[0104] 3)本發(fā)明同時能夠準(zhǔn)確分辨出：5種藥物耐藥性，包括拉米夫定、阿德福韋酯、恩 替卡韋、替比夫定和替諾福韋酯，對于臨床用藥有重要的指導(dǎo)意義；
[0105] 4)本發(fā)明整合了自動化核酸提取設(shè)備與核酸擴(kuò)增，雜交設(shè)備，大大減少了人工操 作步驟，提高了測試速度、通量。
【具體實施方式】
[0106] 為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特征、所能實現(xiàn)的目的及效果，以下通過具體實施 例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0107] 另外，以下涉及的試劑如未特別說明，則為商業(yè)化產(chǎn)品。
[0108] 第一實施方式
[0109] 本實施方式中提供了一種乙肝耐藥突變和基因型檢測試劑盒，試劑盒（24人份） 的主要組成如下：
[0110] 1、A 盒：儲存于 2-8°C
[0111] 表1核酸提取試劑
[0112]
[0113] 其中，裂解液是含異硫氰酸胍和TritonX-100的溶液，或者該裂解液是含異硫 氰酸胍和Tween-20的溶液；其中，裂解液中的異硫氰酸胍的濃度為4M，TritonX-100或 Tween-20的體積濃度為1. 5% ;
[0114] 結(jié)合液，其配制方法為：取200g高氯酸鈉、30g醋酸鈉溶解于少量純化水中，然后 加入500ml無水乙醇，并用純化水定容至1L即可。
[0115] 蛋白酶 K :外購于 Roche 公司，5-10 μ L/sample。
[0116] RNA 的聚合酶 A (Poly A):外購于 chemagen 公司，5-10 μ L/sample。
[0117] 磁珠懸浮液：chemagen公司的順磁性氧化娃納米磁珠的懸浮液（磁珠為購自 chemagen公司的M-PVA011型號的磁珠）。
[0118] 洗液A，其配制方法為：取250g高氯酸鈉、50g的醋酸鈉、溶解于少量純化水中，然 后加入450ml無水乙醇，并用純化水定容至1L即可。
[0119] · 2、B 盒：儲存于-18°C
[0120] 表2核酸擴(kuò)增試劑
[0121]
[0122] 上述核酸擴(kuò)增試劑中，一些組分的配制如下：
[0123] 反應(yīng)液厶，其組分為疋11打6『（2〇11111^8-!1(：1?!18.3,6〇11111((：1)、丁&9酶31]/ test(3U/次檢測）和 UNG 酶 0· lU/test(0. 1U/次檢測）、dNTPs(10mM dATP, 10mM dTTP, 10mM dCTP, lOmM dGTP, lOmM dUTP)〇
[0124] 反應(yīng)液B，其組分為：如SEQ ID NO. 1所示的引物F(100nM)、如SEQ ID NO. 2所示 的引物R(500nM)和MgCl250mM。其中，SEQ ID NO. 2所示引物的5'端還連接有生物素。
[0125] 陰性對照品：是由HBV病毒陰性血清液配制為陰性對照品。
[0126] 陽性對照品：將包含如SEQ ID NO. 32所示序列的pUC57質(zhì)粒（由上海生工合成） 配制成濃度5X104IU/ml。
[0127] 雜交質(zhì)控品，是SEQ ID NO. 33所示的核酸序列，濃度為0. 01 μ Μ。
[0128] 內(nèi)標(biāo)是包含如SEQ ID NO. 34所示序列的pUC57質(zhì)粒（由上海生工合成），濃度為 2X105IU/ml〇
[0129] 3、C 盒：儲存于 2_8°C
[0130] 表3雜交試劑
[0131]
[0132] 上述雜交試劑中，一些試劑配制如下：
[0133] 雜交液的組分：TMAC(四甲基氯化銨，購自SIGMA公司，品號：T3411-500ML)5M、 Tris-HCl 60mM pH8、Sarkosyl(N-月桂酰肌氨酸鈉，購自SIGMA公司，品號： L5125-100G)0.5g/100ml、EDTA 8mM。
[0134] 磁珠雜交液的制備：
[0135] 每個編號（共29種編號）的帶有探針的磁珠取2ml (共50K個磁珠），將磁珠懸浮 液震蕩混勻，離心6000rpm，3分鐘，放置于離心管專用磁板架上，緩慢將上清液完全吸出。 將磁珠留于管底部。分別加入200 μ 1上述雜交液，充分混合后將29種磁珠混合在50ml離 心管中。加入雜交液至12ml。充分搖勻，按600μ1每管分裝，為一套試劑24人份用量。
[0136] 其中，編號的帶有探針（如SEQ ID Ν0. 3-31所示的探針）的磁珠的制備方法，如 下：
[0137] A.將29種編號為1~29的磁珠溶液1ml分別轉(zhuǎn)移到管中，3500rpm離心1分鐘， 去除上清液；其中，磁珠溶液的濃度為250K個磁珠 /ml ;其中，磁珠購自美國公司Applied Biocode (貨號：44-B-0102);
[0138] B.取400 μ 1 MEST溶液分別加入每管中，3000rpm離心3分鐘，去除上清液；
[0139] 其中，MEST溶液是含體積濃度為0· 05% Tween20的lOOmM pH5的MES溶液；
[0140] C.重復(fù)步驟B-次；
[0141] D.加入 125μ 1 超純水、75μ 1 4XMEST(400mM MES。!15、0.20%了￥661120)，并且分 別對應(yīng)每種磁珠加入10 μ 1如SEQ ID NO. 3-31所示的探針（訂購自上海生工公司）；同時， SEQ ID N0. 3-31所示探針的5'端標(biāo)記有amin〇-C6。另外，探針濃度可為80 μ M。
[0142] 其中，探針與磁珠編號的對應(yīng)如下：
[0143]
[0144]
[0145] Ε·將1管EDC(10mg購自SIGMA公司）從-18°C新鮮取出，加入1ml冷的上述MEST 溶液（2~8°C )，震蕩混勻后，迅速取60 μ 1加入到每個磁珠管中，震蕩后，放入恒溫震蕩儀 中，室溫震蕩1400rpm，30分鐘；
[0146] F.重復(fù)步驟E-次；
[0147] G.將800 μ 1 TNT溶液加入磁珠管中，震蕩混勻，3500rpm離心1~3分鐘，去除上 清液；
[0148] 其中，TNT 溶液是含 50mM Tris-HCl、0. 2M NaCl、0. 05% Tween 20 的溶液；
[0149] Η·重復(fù)步驟G-次；
[0150] I.將800 μ 1濃度為lg/100ml的SDS溶液加入磁珠管中，緩慢滾動混勻，盡量避免 氣泡的產(chǎn)生，3500rpm離心3分鐘，去除上清液。
[0151] J.重復(fù)步驟G-次，用上述TNT溶液洗滌磁珠。
[0152] K.加入1. 5ml TE溶液，2~8°C保存，備用。磁珠制備完成。其中，TE溶液是含有 30mM Tris-HCl 和 5mM EDTA 的 pH7 ~8 的溶液。
[0153] 上述雜交洗液的組分：Na2HP040 . 6M、NaH2P0455mM、NaCl 0. 50M、體積濃度為30%的 Tween20〇
[0154] 檢測液的組分：Na2HP040 . 6M、NaH2P0455mM、NaCl 0· 50M、體積濃度為 30% Tween20、 體積濃度為〇· 2%的TritonX-100。
[0155] 以下實施例中使用上述試劑盒做性能指標(biāo)測試。
[0156] 一、樣本準(zhǔn)備
[0157] 1、采樣
[0158] 樣本采集：檢測用樣本為血清或血漿樣本，采集及儲存過程避免樣本間交叉污染。 已知肝素抑制PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以血漿做待測樣本時應(yīng)采用EDTA或檸檬酸鈉抗凝，嚴(yán)禁用肝 素抗凝。
[0159] 2、標(biāo)本保存
[0160] 分離的血清/血漿樣本2~8°C保存不超過72小時。更長時間保存時，可將分離 出的血清/血漿樣本轉(zhuǎn)移到新的無菌采血管或離心管中-18°C以下保存。冷凍保存的樣本 檢測前取出室溫溶解混勻測定。樣本凍融次數(shù)建議不超過6次。
[0161] 3、標(biāo)本運(yùn)輸
[0162] 在運(yùn)輸過程中需保證試劑盒的保存溫度，可利用干冰保持較低的溫度。
[0163] 二、檢驗方法
[0164] 1、HBV核酸的提取
[0165] 本試劑盒采用磁珠法對HBV核酸進(jìn)行提取。本實例用EZbeads核酸提取儀為例進(jìn) 行說明。
[0166] 1.1實驗前準(zhǔn)備
[0167] A.將B盒中的陽性對照品、陰性對照品和內(nèi)標(biāo)取出，平衡至室溫并混勻。
[0168] B.配制蛋白酶K/Poly A混合液：
[0169]
[0170] C.在樣本制備用96孔深孔反應(yīng)盤中預(yù)分裝下列試劑：
[0171]
[0172] 1. 2待測樣本核酸提取過程
[0173] A.取300 μ L血清或血漿樣本和300 μ L陽性對照，300 μ L陰性對照分別加入到預(yù) 分裝試劑的反應(yīng)盤Α2~Η2或Α8~Η8孔中，同時每個孔分別加入25 μ L內(nèi)標(biāo)。每塊反應(yīng) 盤可處理16個樣本。每臺儀器可同時放入2個反應(yīng)盤處理32個樣本。
[0174] Β.將金屬條對準(zhǔn)反應(yīng)盤的Α6~Η6及Α12~Η12列底部，并將反應(yīng)盤及金屬條固 定于Ezbead System-32核酸提取儀上，進(jìn)行核酸提取。提取程序見下表
[0175] 表4提取程序
[0176]
[0177] C.待程序結(jié)束后，取下反應(yīng)盤，吸取洗脫液進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)（洗脫液如有磁珠殘 留，以靠磁方式去除。如果提取的樣本當(dāng)天不進(jìn)行擴(kuò)增，則要放-18°C以下保存）。
[0178] 2、核酸擴(kuò)增
[0179] 2. 1HBV反應(yīng)混合液配制：
[0180] 根據(jù)待測樣本的數(shù)量，按照下列比例配制HBV反應(yīng)混合液
[0181]
[0182] 注：配制HBV反應(yīng)混合液時，請計算陰陽性對照的數(shù)量。
[0183] 配制的HBV反應(yīng)混合液需振蕩混勻，離心20秒去除氣泡后再分裝到PCR擴(kuò)增用反 應(yīng)管中。
[0184] 2.2HBV 擴(kuò)增參數(shù)：
[0185] A.在PCR擴(kuò)增用反應(yīng)管中分裝15 μ 1 HBV反應(yīng)混合液（PCR擴(kuò)增用反應(yīng)管推薦使 用 Axygen 0· 2ml 平蓋八聯(lián)管，Cat No :管 PCR-0208-C、蓋 PCR-2CP-RT-C);
[0186] B.取制備好的樣品核酸10 μ 1 (濃度彡1000IU/ml)到加入上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)管 中，蓋上蓋子，輕微震蕩混勻，離心20秒去除氣泡；
[0187] C.將PCR擴(kuò)增用反應(yīng)管放到PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；
[0188] D.循環(huán)條件設(shè)置：
[0189] Step 1 :37°C 2min 1 個循環(huán)；
[0190] Step 2 :5CTC 5min 1 個循環(huán)；
[0191] Step 3 :94°C 5min 1 個循環(huán)；
[0192] St印 4 :94°C 30s，6(TC 45s ;50 個循環(huán)；
[0193] Step 5 ：72〇C 7min ；
[0194] Step 6 :10 °C 保存；
[0195] 其中，對于反應(yīng)A液中的UNG酶，在開始PCR擴(kuò)增步驟之前，進(jìn)行37°C保溫2mins， 隨后50°C保溫5mins對UNG酶進(jìn)行滅活。
[0196] E.當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)入10°C保存狀態(tài)時取出，PCR結(jié)束。
[0197] 三、探針雜交及結(jié)果讀取
[0198] 3. 1將上述C盒中的磁珠雜交液（含有探針磁珠的雜交液）充分混勻，使磁珠均勻 懸浮在雜交液中，將20 μ L磁珠雜交液分別加入到擴(kuò)增結(jié)束的PCR反應(yīng)管中，放入恒溫震蕩 器中，50°C 30分鐘。
[0199] 3. 2將100 μ L已稀釋好的洗液C加入到PCR反應(yīng)管中，與管中液體充分混合后全 部移入96孔微孔板中。
[0200] 將96孔微孔板放置在磁板架上，靜置1分鐘后，緩慢將液體吸出，磁珠留在孔底。
[0201] 3. 3將SAPE在洗液C中稀釋250倍后，取100 μ L加入每個留有磁珠的微孔板中。 在振蕩器上震蕩5分鐘。
[0202] 3. 4將96孔板移至帶磁板洗板機(jī)上，選擇條洗模式，洗板5次，沖液量350 μ L，靜 置間隔40秒每次。
[0203] 3. 5洗板結(jié)束后，每孔加入100 μ L檢測液，放入Applied Biocode (ABC)信號讀取 儀讀取熒光信號。（如有氣泡，需將氣泡去除后再放入信號讀取儀）。
[0204] 四、結(jié)果判定
[0205] 1、結(jié)果分析由軟件（如HBV genotyping&DRM軟件，蘇州新波生物技術(shù)有限公司） 來完成，各個探針的cutoff值已設(shè)置在分析軟件中。
[0206] 2、各個探針設(shè)定突變信號cutoff值如下表：
[0207]
[0208]
[0209] -般判定順序如下：
[0210] 1)、HQC 判定
[0211]
[0212] 2)、NC 判定
[0213]
[0214] 3)、PC 判斷
[0215]
[0216] 4)、一般樣本判定
[0217]
[0218] 3、常見結(jié)果判定如下：
[0219]
[0221] 注：1C信號在陽性樣本中，信號值可以忽略。
[0222] 只有QC、IC為陽性時，說明樣品中存在HBV DNA。
[0223] 本實施方式的試劑盒可以對乙肝耐藥突變位點(diǎn)和基因分型進(jìn)行定性檢測，并且可 對10個耐藥突變位點(diǎn)（169、173、180、181、184、194、202、204、236、250)進(jìn)行檢測，同時可對 國內(nèi)常見四種基因型A、B、C和D型進(jìn)行分型檢測，因此，可用于臨床上對HBV患者在長期用 藥產(chǎn)生的耐藥突變進(jìn)行監(jiān)測，對于用藥具有重大的參考價值。
[0224] 五、本實施例產(chǎn)品的性能指標(biāo)如下：
[0225] 1、檢測限度：1000IU/ml。
[0226] 2、檢測型別和耐藥位點(diǎn)為：A、B、C、D共4種基因型，169、173、180、181、184、194、 202、204、236、250 共 10 個位點(diǎn)。
[0227] 3、干擾試驗：本品檢測不受樣本中甘油三酯（5mg/ml)、血紅蛋白（0. 5mg/ml)、膽 紅素（30mg/ml)的影響。
[0228] 4、交叉反應(yīng)試驗：本品檢測不受標(biāo)本中巨細(xì)胞病毒、EB病毒帶狀皰疹病毒、單純 皰疹病毒I，Π 型、丙肝病毒、HIV-2型病毒的影響。
[0229] 5、標(biāo)本類型試驗：本品對血清、EDTA抗凝血漿、枸櫞酸鈉抗凝血漿三種類型的標(biāo) 本具有一致的檢測效率。
[0230] 6、抗病毒藥物：本品檢測不受標(biāo)本中抗病毒藥物（齊多夫定、利巴韋林等）的影 響。
[0231 ] 7、自身抗體：本品檢測不受標(biāo)本中ANA (抗核抗體）、ΑΜΑ (抗線粒體抗體）等自身 免疫性抗體的影響。
[0232] 本發(fā)明利用微編碼磁珠為基礎(chǔ)的液相芯片技術(shù)作為技術(shù)平臺，綜合HBV在國內(nèi)感 染型別和常見耐藥位點(diǎn)突變情況進(jìn)行試劑盒的開發(fā)，使其可同時鑒別4種不同基因型別和 10個耐藥位點(diǎn)，對于長期服藥的乙型肝炎病人的治療起到一定的輔助作用。
[0233] 實施例1使用上述試劑盒檢測臨床樣本中的HBV耐藥突變情況和常見基因型的判 別。
[0234] 用上述試劑盒對100例感染乙肝病毒臨床樣本進(jìn)行檢測，取臨床樣本300 μ 1用 試劑盒Α盒在Ezbeads上進(jìn)行提取，分4次進(jìn)行提取，同時提取的有陰性對照和陽性對照， 將提取的樣本DNA用試劑盒B盒按照試劑盒要求進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物 10 μ 1與磁珠雜交液混合，加1個雜交對照孔，進(jìn)行雜交反應(yīng)，按照試劑盒要求得到每個樣 本的信號值，在軟件中判別結(jié)果。將Α盒中提取的DNA，用SEQ ID Ν0. 1-2所示的引物進(jìn)行 擴(kuò)增后，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，上海生工公司提供測序服務(wù)，并提供測序報告，將本試劑盒的檢 測結(jié)果和測序金標(biāo)準(zhǔn)相比較，統(tǒng)計結(jié)果見下表。
[0235] 本發(fā)明與金標(biāo)準(zhǔn)（測序法）比較結(jié)果
[0236]

[0238] 部分樣本檢測信號值結(jié)果如下：
[0239]



[0245] 上述試劑盒對100份未知臨床樣本進(jìn)行檢測，對于10個耐藥突變位點(diǎn)（169,173， 180，181，184，194,202,204,236,250)和4個國內(nèi)常見基因型（基因型A，基因型B，基因型 C，基因型D)，具有很好的檢測能力，與測序結(jié)果比較符合率100 %，準(zhǔn)確性高。
【主權(quán)項】
1. 一種乙型肝炎病毒的耐藥突變位點(diǎn)和基因型檢測試劑盒，其特征在于，包括：核酸 擴(kuò)增試劑和雜交試劑； 其中，所述核酸擴(kuò)增試劑包括：如SEQ ID NO. 1-2所示的引物； 雜交試劑包括：如SEQ ID NO. 3-31所示的探針。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述SEQ ID NO. 2所示引物的5'端還連 接有生物素； 所述SEQ ID NO. 3-31所示探針的5'端標(biāo)記有amin〇-C6 ; 所述雜交試劑包括：與帶有編號的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)后的如SEQ ID NO. 3-31所示的探針。3. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述與帶有編號的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)后的如 SEQ ID NO. 3-31所示的探針的制備方法為包括以下步驟的方法： A. 將29種不同編號的磁珠溶液分別轉(zhuǎn)移到管中，離心，去除上清液； B. 取MEST溶液分別加入每管中，離心，去除上清液； 其中，MEST溶液是含體積濃度為0. 01% -0. 05% Tween20和50mM~lOOmM pH5~7的 2-嗎啉乙磺酸的混合溶液； C. 重復(fù)步驟B -次； D. 加入水、4XMEST溶液，并且分別對應(yīng)每種磁珠加入如SEQ ID NO. 3-31所示的探針； E. 配制含10mg/ml~5mg/ml N-(3-二甲基氨丙基）-N' -乙基碳二亞胺的MEST溶液， 將其加入到每個磁珠管中，震蕩； F. 重復(fù)步驟E -次； G. 將TNT溶液加入磁珠管中，震蕩混勻，離心，去除上清液； 其中，TNT 溶液是含 25 ~50mM Tris-HCl、0.05 ~0.2M NaCl、0.01 ~0.05vol%Tween 20的溶液； H. 重復(fù)步驟G -次； I. 將濃度為lg/l〇〇ml~5g/100ml的SDS溶液加入磁珠管中，離心，去除上清液； J. 重復(fù)步驟G -次，用上述TNT溶液洗滌磁珠； K. 加入TE溶液，得到與帶有編號的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)后的探針；其中，TE溶液是含有10~ 30mM Tris-HCl 和 1 ~5mM EDTA 的 pH7 ~8 的溶液。4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述步驟A中，磁珠溶液的濃度為250K個 磁珠 /ml ; 步驟D中，探針濃度為50~100 μ Μ。5. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述核酸擴(kuò)增試劑還包括：KCl、Tris-HCl 緩沖液、Taq酶和UNG酶、dNTPs和MgCl2; 所述雜交試劑還包括：雜交液、熒光反應(yīng)液、雜交洗液和檢測液； 其中，雜交液的組分為：四甲基氯化銨2~5M、Tris-HCl 20~60mM pH8、N-月桂酰肌 氨酸鈉 〇· lg/l〇〇ml ~0· 5g/100ml、EDTA 4 ~8mM ; 熒光反應(yīng)液包括：鏈霉親和素-R-藻紅蛋白SAPE ; 雜交洗液的組分為：Na2HP04 0· 2 ~0· 6M、NaH2P04 25mM ~55mM、NaCl 0· 15-0. 50M、體 積濃度為10~30%的Tween20 ; 檢測液的組分為：Na2HP04 0· 2 ~0· 6M、NaH2P04 25mM ~55mM、NaCl 0· 15-0. 50M、體積 濃度為10~30%的Tween20、體積濃度為0· 2~0· 5%的Triton X-100。6. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括：核酸提取試劑、陽性 對照品、陰性對照品、雜交質(zhì)控品以及內(nèi)標(biāo)。7. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于：所述核酸提取試劑包括：磁珠懸浮液； 陽性對照品，是包含如SEQ ID NO. 32所示序列的質(zhì)粒； 陰性對照品，是由HBV病毒陰性血清液配制為陰性對照品； 雜交質(zhì)控品，是如SEQ ID NO. 33所示的核酸序列； 內(nèi)標(biāo)，是包含人類看家基因 β-globin序列的質(zhì)粒。8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于：所述陽性對照品是包含如SEQ ID NO. 32 所示序列的PUC57質(zhì)粒； 所述內(nèi)標(biāo)為包含如SEQ ID NO. 34所示序列的pUC57質(zhì)粒； 所述核酸提取試劑還包括以下組分： 1) 裂解液，其是含異硫氰酸胍和TritonX-100的溶液，或者該裂解液是含異硫氰酸 胍和Tween-20的溶液；其中，裂解液中的異硫氰酸胍的濃度為2M~6M，TritonX-100或 Tween-20的體積濃度為1 %~2% ; 2) 結(jié)合液，其是含高氯酸鹽、醋酸鹽和有機(jī)溶劑的水溶液；其中，高氯酸鹽包括：高 氯酸鈉；醋酸鹽包括：醋酸鈉；有機(jī)溶劑包括：乙醇；高氯酸鹽的濃度為17g/100mL~ 3(^/1001^，醋酸鹽的濃度為1 8/1001^~1(^/1001^，有機(jī)溶劑的體積濃度為40%~60%; 3) 洗液A，其是含高氯酸鈉、醋酸鹽和乙醇的水溶液，其中，高氯酸鈉的濃度優(yōu)選為 10g/100mL~30g/100mL,醋酸鹽的濃度為4g/100mL~15g/100mL,乙醇的體積濃度為 35%~50% ; 所述醋酸鹽包括：醋酸鈉； 4) 洗液B，其為體積濃度40 %~80 %的乙醇； 5) 洗脫液，其為 10 ~20mM pH8. 0 的 Tris-HCl ; 6) 蛋白酶K。 7. RNA的聚合酶A。9. 一種如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒的耐藥突變位點(diǎn)和基因型檢測試劑盒的使 用方法，其特征在于，包括步驟： 1) 樣本的核酸提取 利用權(quán)利要求7所述的核酸提取試劑，并按照磁珠法，對樣本、陽性對照和陰性對照同 時進(jìn)行核酸提取，得到PCR模板，并且內(nèi)標(biāo)在進(jìn)行核酸提取之前加入每個樣本中； 其中，樣本包括：血清或者血楽； 2) 擴(kuò)增試劑配制： 反應(yīng)A液，其組分為：鹽緩沖液、Taq酶、UNG酶和dNTPs ; 其中，鹽緩沖液的終濃度為含30~60mM KC1的10~20mM pH8. 0-8. 5的Tris-HCl緩 沖液； Taq酶3~7U/次檢測； UNG酶0. 1~0. 5U/次檢測； dNTPs 10 ~30mM ; 反應(yīng)B液：含如SEQ ID NO. 1所示的引物F和如SEQ ID NO. 2所示的引物R的1%(：12溶 液；其中，引物F的濃度為50~ΙΟΟηΜ，引物R的濃度為200~500nM，MgCl2&濃度為20~ 60mM ； 將反應(yīng)A液和反應(yīng)B液混合形成擴(kuò)增試劑；其中，反應(yīng)A液和反應(yīng)B液的混合體積比為 1:2 ~1:4 ; 3. PCR擴(kuò)增：在步驟1)中的PCR模板中分別加入步驟2)的擴(kuò)增試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增反 應(yīng)； 其中，對于反應(yīng)A液中的UNG酶，在開始PCR擴(kuò)增步驟之前，進(jìn)行37°C保溫2mins，隨后 50°C保溫5mins對UNG酶進(jìn)行滅活； PCR擴(kuò)增方法包括以下步驟： Step 1 :37°C 2min 1 個循環(huán)； St印 2 :50°C 5min 1 個循環(huán)； Step 3 :94°C 5min 1 個循環(huán)； St印 4 :94°C 30s，6(TC 45s ;50 個循環(huán)； Step 5 ：72〇C 7min ； Step 6 :10 °C 保存； 4) 雜交反應(yīng)：將與帶有編號的磁珠進(jìn)行偶聯(lián)后的如SEQ ID NO. 3-31所示的探針和權(quán) 利要求5所述的雜交液混合后，加入到PCR產(chǎn)物中，50~60°C、1200~1400rpm進(jìn)行雜交反 應(yīng)15-30min，同時，雜交質(zhì)控品參與整個雜交過程； 5) 熒光反應(yīng)：吸除雜交反應(yīng)物的上清，將底部的磁珠中加入權(quán)利要求5所述的熒光反 應(yīng)液，振蕩反應(yīng)5-15min ; 6) 檢測：熒光反應(yīng)產(chǎn)物用權(quán)利要求5所述的雜交洗液洗滌后，加入權(quán)利要求5所述的 檢測液，在液相芯片檢測儀上進(jìn)行熒光檢測； 7) 根據(jù)檢測反應(yīng)體系中的熒光信號值來確定HBV的耐藥性突變和基因型情況。10. -種如權(quán)利要求1~8中的任一項所述的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于：所述試劑盒 用于檢測以下的耐藥位點(diǎn)和乙型肝炎病毒型別； 其中，耐藥位點(diǎn)包括：第169位的I - T的突變位點(diǎn)、第173位的V - L的突變位點(diǎn)、第 180位的L - Μ的突變位點(diǎn)、第181位的A - V的突變位點(diǎn)或第181位的A - T的突變位 點(diǎn)、第184位的T - G的突變位點(diǎn)、第194位的A - T的突變位點(diǎn)、第202位的S - G的突 變位點(diǎn)或第202位的S - I的突變位點(diǎn)、第204位的Μ - V的突變位點(diǎn)或第204位的Μ - I 的突變位點(diǎn)、以及第250位的Μ - V的突變位點(diǎn)； 型別包括：乙型肝炎病毒基因型Α、基因型Β、基因型C和基因型D。
【文檔編號】C12Q1/68GK105986039SQ201510041667
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年1月28日
【發(fā)明人】張健, 陳麗麗, 張淼
【申請人】蘇州新波生物技術(shù)有限公司