膠質(zhì)瘤細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子檢測(cè)方法，步驟一：提取膠質(zhì)瘤細(xì)胞；步驟二：細(xì)胞培養(yǎng)；步驟三：藥物處理；步驟四：mRNA提??；步驟五：反應(yīng)：95℃預(yù)變性30s；95℃變性20S，60℃退火15s;72℃延伸15s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；步驟六：計(jì)算：樣品以GAPDH基因的mRNA表達(dá)作為內(nèi)參照，通過(guò)相對(duì)定量(2?△△CT)法計(jì)算目的基因在各樣品中相對(duì)mRNA的表達(dá)水平。引物的序列為：GAPDH：F:5’TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’；R:5’AGATCCACAACGGATACATT3’GDNF:F:5’GACTTGGGTTTGGGCTACGA3’；R:5’TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3’。通過(guò)本發(fā)明通過(guò)本發(fā)明處理過(guò)程后，經(jīng)過(guò)檢測(cè)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞2^?△△CT表達(dá)水平更高，同時(shí)通過(guò)兩者方差對(duì)比，本發(fā)明的檢測(cè)方法，2^?△△CT的表達(dá)水平更加穩(wěn)定。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子檢測(cè)方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)檢測(cè)方法，更具體的說(shuō)是設(shè)及一種膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子 檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)是膠質(zhì)瘤發(fā)性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的重要促生長(zhǎng)因 子，在原發(fā)性膠質(zhì)瘤組織和多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄異常升高。目前，基因高轉(zhuǎn)錄對(duì)膠質(zhì)瘤 細(xì)胞惡性增殖與遷移機(jī)制的研究已經(jīng)很多，然而鮮見(jiàn)對(duì)其高轉(zhuǎn)錄發(fā)生機(jī)制的報(bào)道。本課題 組前期的研究發(fā)現(xiàn)，gdnf基因的高轉(zhuǎn)錄與基因突變無(wú)關(guān)，推測(cè)基于非DNA序列改變的表觀 遺傳修飾可能參與其高轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程。近來(lái)的研究表明，翻譯后組蛋白的乙酷化修飾在調(diào) 芐基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
[0004] 通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)的發(fā)展，GDNF基因 mRNA表達(dá)及其啟動(dòng)子I區(qū)組蛋白H3K9的乙酷 化修飾狀態(tài)，GDNF基因上mRNA與基因癌變有重要關(guān)系，現(xiàn)有技術(shù)中也有記載檢測(cè)GDNF基 因上mRNA的方法，但是現(xiàn)有技術(shù)中的方法由于受到外界影響過(guò)大，檢測(cè)出來(lái)的未定型不 局。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種高穩(wěn)定性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中 GDNF基因啟動(dòng)子mRNA檢測(cè)方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案： 一種膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子mRNA檢測(cè)方法，步驟一：提取膠質(zhì)瘤細(xì)胞:取4她內(nèi) 的膠質(zhì)瘤樣本，首先剪碎并用清洗，加入0.25 %膜酶溶液在37°C條件下消化5min;收集細(xì)胞 培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每周換液兩次;在原代培養(yǎng)7-9天后，將培養(yǎng)瓶 置于恒溫?fù)u床37°C，200巧m，2化震蕩純化，W去除小膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞； 經(jīng)GFAP免疫巧光鑒定陽(yáng)性的細(xì)胞視為成熟的細(xì)胞，取第4代的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為膠質(zhì) 瘤細(xì)胞株； 步驟二:細(xì)胞培養(yǎng):膠質(zhì)瘤細(xì)胞株用含10%胎牛血清、lOOU/ml青霉素，lOOU/ml鏈霉素 的培養(yǎng)基，置于37 °C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 步驟=:藥物處理:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)24 h同步化后進(jìn)行藥物處理，加入終濃度為 25~100皿ol/L的姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)2地； 步驟四：mRNA提取，采用TRIzol-步法從細(xì)胞中提取總RNA，取RNA模板化g用Prime Script II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cD-NA第一鏈，再W逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液化1作為模板， 加入相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物的序列為： GAP畑：F: 5 ' TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3 ' R:5 ' AGATCCACAACGGATACATT3 ' GDNF: F:5 ' GACTTGGGTTTGGGCTACGA3 ' R:5 ' TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3 '； 步驟五:反應(yīng):95 °C預(yù)變性30s;95°C變性20S，60°C退火15s; 72°C延伸15s，擴(kuò)增40個(gè) 循環(huán)； 步驟六:計(jì)算:樣品WGAPDH基因的mRNA表達(dá)作為內(nèi)參照，通過(guò)相對(duì)定量（2~-AACT) 法計(jì)算目的基因在各樣品中相對(duì)mRNA的表達(dá)水平。
[0007]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟一中，在將樣本剪碎后，通過(guò)75%的酒精進(jìn)行 一次清洗，之后通過(guò)清洗液中浸泡15min后，在用清洗液沖洗至少=次，所述清洗液包括下 列重量份組成： 去離子水 800~1000份 氯化鋼 5~10份 氯化鐘 0.1~1份 憐酸二氨鐘0.1~1份 憐酸氨二鋼1~2份 憐酸甘油 1~2份 海藻糖 0.1~1份； 再加入0.25 %膜酶溶液在37 °C條件下消化5min，所述膜酶溶液包括：0.25%的膜酶、 0.02%的邸TA、0.02%的海藻糖、5%的丙S醇、0.5%的憐酸甘油，余量為PBS緩沖液。
[000引作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟二中，培養(yǎng)基為WDMEM/F12培養(yǎng)液為基體，再 添加海藻糖、殼聚糖、琉基乙醇、亞砸酸鋼，所述海藻糖添加量為DMEM/F12培養(yǎng)液質(zhì)量的 0.5%，殼聚糖為DMEM/F12培養(yǎng)液質(zhì)量的^5 %，所述亞砸酸鋼最終濃度為5~化g/L。
[0009] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟=中，在加入姜黃素進(jìn)行乙酷化的過(guò)程中，同 時(shí)加入去甲氧基姜黃素，所述去甲氧基姜黃素用量為姜黃素用量的^5%。
[0010] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟一中，膜酶溶液完成消化后，加入膜酶抑制劑 解除膜酶溶液的消化作用，之后加入PBS緩沖液、甘油醇進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)高速離屯、機(jī)將整個(gè) 混合液進(jìn)行離屯、，將上清液棄去后，收集細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。
[0011] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟一種，分離得到去膜酶的細(xì)胞后，再通過(guò)清洗 液浸泡5min，浸泡過(guò)后在使用清洗劑清洗至少S次，收集細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的 DMHM/F12培養(yǎng)液。
[0012] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟二中的培養(yǎng)基中還添加有載體，所述載體為 聚乳酸、淀粉、聚苯乙締 W葡萄糖水溶液為介質(zhì)在60~80°C下通過(guò)聚合反應(yīng)生成的微孔材 料。
[0013] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn):所述載體中W重量份計(jì)：聚苯乙締為30~50份，聚乳酸 為5~15份，淀粉為5~15份，葡萄糖水溶液濃度為5~10%。
[0014] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟二中，在培養(yǎng)過(guò)程中，保持?jǐn)埌?，所述攬拌?度為 30 ~SOr/min。
[0015] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟=中，在提取細(xì)胞時(shí)，先在步驟二培養(yǎng)基中加 入0.25%的膜酶、0.02%的抓TA、0.02%的海藻糖、5%的丙S醇、0.5%的憐酸甘油，余量為PBS緩 沖液，消化5min后，使得細(xì)胞從載體上脫落，取出載體，通過(guò)PBS緩沖液沖洗至少立次，沖下 來(lái)的液體倒回原培養(yǎng)基，加入膜酶抑制劑解除膜酶溶液的消化作用，之后加入PBS緩沖液、 甘油醇進(jìn)行稀釋?zhuān)?jīng)過(guò)告訴離屯、后的到的細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)24 h同步化后進(jìn)行 藥物處理，加入終濃度為25~lOOwnol/L的姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)2地。
[0016] 本發(fā)明的有益效果，通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞GDNF基因 mRNA的表 達(dá)更加穩(wěn)定。
[0017] 首先，經(jīng)過(guò)步驟一處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，能夠在被處理完過(guò)后，仍然能夠保持較好的 活性，加入膜酶，將細(xì)胞與細(xì)胞之間分離，W便后續(xù)處理能夠是的細(xì)胞能夠W單個(gè)細(xì)胞存 在。膜酶的處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞被膜酶分解，從而被破壞。之后將分離的細(xì) 胞放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。運(yùn)樣就能夠培養(yǎng)出完整性較好的細(xì)胞。最后制得細(xì)胞株。
[0018] 之后將細(xì)胞株進(jìn)一步培養(yǎng)，胎牛血清主要是給細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，而青霉素和鏈 霉素主要是保證細(xì)胞不會(huì)被感染，保證細(xì)胞的存活率的同時(shí)，也保證不會(huì)導(dǎo)入其他DNA或者 RNA。
[0019] 而步驟=中，選用姜黃素作為乙酷化的試劑，能夠更好地將組織蛋白乙酷化。乙酷 化程度更高。使得之后進(jìn)入步驟四mRNA提取過(guò)程中，逆轉(zhuǎn)錄的表達(dá)更加準(zhǔn)確。
[0020] 在步驟五中，通過(guò)設(shè)定的參數(shù)，能夠得到更加準(zhǔn)確的詩(shī)句。最后通過(guò)對(duì)比，得到 mRNA的表達(dá)水平。
[0021 ]而在步驟一中，先將樣本碎片通過(guò)酒精清洗，先初步清洗掉黏附在樣本細(xì)胞表面 的雜質(zhì)，之后通過(guò)清洗劑浸泡，清洗劑中的去離子水、氯化鋼、氯化鐘、憐酸二氨鐘、憐酸氨 二鋼能夠形成適應(yīng)細(xì)胞生存的體系，特別是膠質(zhì)瘤細(xì)胞，其細(xì)胞活性能夠得到極大限度的 保證，同時(shí)通過(guò)憐酸甘油和海藻糖的加入，能夠進(jìn)一步保證細(xì)胞的活性，特別是蛋白質(zhì)的活 性，是的后期mRNA的表達(dá)更加準(zhǔn)確。同時(shí)，膜酶溶液中EDTA能夠提高膜酶的分離細(xì)胞的效 果，同時(shí)海藻糖、丙=醇、憐酸甘油的加入，一方面保證了膜酶溶液的活性，同時(shí)液保護(hù)細(xì)胞 組織不會(huì)被膜酶過(guò)度分解導(dǎo)致細(xì)胞失活。
[0022] 另外在步驟二中的培養(yǎng)基中添加海藻糖、殼聚糖、琉基乙醇、亞砸酸鋼，海藻糖能 夠?qū)δ[瘤細(xì)胞起到保護(hù)作用，使得細(xì)胞活性更高，同時(shí)亞砸酸鋼能夠提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需要 的微量元素，而殼聚糖不僅僅能夠起到保護(hù)細(xì)胞，提高活性，還能夠調(diào)整整體液體的粘稠 度，是使得細(xì)胞生存的環(huán)境更加穩(wěn)定。
[0023] 在步驟=中姜黃素乙酷化過(guò)長(zhǎng)中加入去甲氧基姜黃素，能夠提高姜黃素的穩(wěn)定 性，提高其乙酷化的表達(dá)。
[0024] 步驟一中，在完成膜酶消化后，通過(guò)膜酶抑制劑的加入能夠徹底抑制膜酶的分解 反應(yīng)，使得膜酶失活，而不會(huì)造成腫瘤細(xì)胞的失活，之后再清洗過(guò)程中，加入的甘油醇也同 樣能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞形成保護(hù)，目的是為了防止膜酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生損傷。
[0025] 在分離膜酶后，浸泡清洗液也是為了能夠去除腫瘤細(xì)胞表面的雜質(zhì)W外，還能夠 對(duì)腫瘤細(xì)胞起到一個(gè)保護(hù)作用。使得后期培養(yǎng)前就保證了腫瘤細(xì)胞的活性。
[0026] 另外，在培養(yǎng)過(guò)程中，加入了載體，通過(guò)聚乳酸、淀粉、聚苯乙締制備的載體，是一 種環(huán)保型載體，給細(xì)胞生長(zhǎng)提供了一個(gè)優(yōu)質(zhì)的環(huán)境，載體是一個(gè)多孔材料是的細(xì)胞生長(zhǎng)能 夠有更多的貼壁面積，更好的模擬了生物體內(nèi)的環(huán)境，保證了其細(xì)胞培養(yǎng)的成活率W及活 性。
[0027]而在使用載體后，為了使得細(xì)胞從載體上脫落就需要用膜酶溶液進(jìn)行浸泡，之后 沖洗，沖洗下來(lái)的沖洗液為了充分利用，倒回到培養(yǎng)基中，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的提取。
【具體實(shí)施方式】 [002引 實(shí)施例： 步驟一:提取膠質(zhì)瘤細(xì)胞:取48h內(nèi)的膠質(zhì)瘤樣本，首先剪碎并用清洗，加入0.25 %膜酶 溶液在37°C條件下消化5min;收集細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每周換 液兩次;在原代培養(yǎng)7-9天后，將培養(yǎng)瓶置于恒溫?fù)u床37°C，200rpm，2化震蕩純化，W去除小 膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞； 經(jīng)GFAP免疫巧光鑒定陽(yáng)性的細(xì)胞視為成熟的細(xì)胞，取第4代的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為膠質(zhì) 瘤細(xì)胞株； 所述步驟一中，在將樣本剪碎后，通過(guò)75%的酒精進(jìn)行一次清洗，之后通過(guò)清洗液中浸 泡15min后，在用清洗液沖洗至少=次，所述清洗液包括下列重量份組成： 去離子水 800~1000份 氯化鋼 5~10份 氯化鐘 0.1~1份 憐酸二氨鐘0.1~1份 憐酸氨二鋼1~2份 憐酸甘油 1~2份 海藻糖 0.1~1份； 再加入0.25 %膜酶溶液在37 °C條件下消化5min，所述膜酶溶液包括：0.25%的膜酶、 0.02%的邸TA、0.02%的海藻糖、5%的丙S醇、0.5%的憐酸甘油，余量為PBS緩沖液。
[0029] 所述步驟一中，分離得到去膜酶的細(xì)胞后，再通過(guò)清洗液浸泡5min，浸泡過(guò)后在使 用清洗劑清洗至少=次，收集細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。
[0030] 步驟二:細(xì)胞培養(yǎng):膠質(zhì)瘤細(xì)胞株用含10%胎牛血清、lOOU/ml青霉素，100U/ml鏈 霉素的培養(yǎng)基，置于37°C ,5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng);所述步驟二中，培養(yǎng)基為WDMEM/F12培養(yǎng) 液為基體，再添加海藻糖、殼聚糖、琉基乙醇、亞砸酸鋼，所述海藻糖添加量為DMEM/F12培養(yǎng) 液質(zhì)量的0.5%，殼聚糖為DMEM/F12培養(yǎng)液質(zhì)量的^5 %，所述亞砸酸鋼最終濃度為5~7ng/L。 所述步驟二中的培養(yǎng)基中還添加有載體，所述載體為聚乳酸、淀粉、聚苯乙締 W葡萄糖水溶 液為介質(zhì)在60~8(TC下通過(guò)聚合反應(yīng)生成的微孔材料。在培養(yǎng)過(guò)程中，保持?jǐn)埌瑁鰯埌?速度為30~50r/min。
[0031] 所述載體中W重量份計(jì):聚苯乙締為30~50份，聚乳酸為5~15份，淀粉為5~15份，葡 萄糖水溶液濃度為5~10%。
[0032] 步驟=:藥物處理:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)24 h同步化后進(jìn)行藥物處理，加入終濃 度為25~100皿ol/L的姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)2地； 所述步驟=中，在加入姜黃素進(jìn)行乙酷化的過(guò)程中，同時(shí)加入去甲氧基姜黃素，所述去 甲氧基姜黃素用量為姜黃素用量的^5%。
[0033] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟一中，膜酶溶液完成消化后，加入膜酶抑制劑 解除膜酶溶液的消化作用，之后加入PBS緩沖液、甘油醇進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)高速離屯、機(jī)將整個(gè) 混合液進(jìn)行離屯、，將上清液棄去后，收集細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。
[0034] 所述步驟S中，在提取細(xì)胞時(shí)，先在步驟二培養(yǎng)基中加入0.25%的膜酶、0.02%的 抓TA、0.02%的海藻糖、5%的丙S醇、0.5%的憐酸甘油，余量為PBS緩沖液，消化5min后，使得 細(xì)胞從載體上脫落，取出載體，通過(guò)PBS緩沖液沖洗至少=次，沖下來(lái)的液體倒回原培養(yǎng)基， 加入膜酶抑制劑解除膜酶溶液的消化作用，之后加入PBS緩沖液、甘油醇進(jìn)行稀釋?zhuān)?jīng)過(guò)告 訴離屯、后的到的細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)24 h同步化后進(jìn)行藥物處理，加入終濃度為 25~100皿ol/L的姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)2地。
[0035] 步驟四：mRNA提取，采用TRIzol -步法從細(xì)胞中提取總RNA，取RNA模板化g用 Prime Script II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cD-NA第一鏈，再W逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液化1作 為模板，加入相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物的序列為： GAP畑：F: 5 ' TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3 ' R:5 ' AGATCCACAACGGATACATT3 ' GDNF: F:5 ' GACTTGGGTTTGGGCTACGA3 ' R:5 ' TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3 '； 步驟五:反應(yīng):95 °C預(yù)變性30s;95°C變性20S，60°C退火15s; 72°C延伸15s，擴(kuò)增40個(gè) 循環(huán)； 步驟六:計(jì)算:樣品WGAPDH基因的mRNA表達(dá)作為內(nèi)參照，通過(guò)相對(duì)定量（2~-AACT) 法計(jì)算目的基因在各樣品中相對(duì)mRNA的表達(dá)水平。
[0036] 本發(fā)明的有益效果，通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞GDNF基因 mRNA的表 達(dá)更加穩(wěn)定。
[0037] 首先，經(jīng)過(guò)步驟一處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，能夠在被處理完過(guò)后，仍然能夠保持較好的 活性，加入膜酶，將細(xì)胞與細(xì)胞之間分離，W便后續(xù)處理能夠是的細(xì)胞能夠W單個(gè)細(xì)胞存 在。膜酶的處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞被膜酶分解，從而被破壞。之后將分離的細(xì) 胞放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。運(yùn)樣就能夠培養(yǎng)出完整性較好的細(xì)胞。最后制得細(xì)胞株。
[0038] 之后將細(xì)胞株進(jìn)一步培養(yǎng)，胎牛血清主要是給細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，而青霉素和鏈 霉素主要是保證細(xì)胞不會(huì)被感染，保證細(xì)胞的存活率的同時(shí)，也保證不會(huì)導(dǎo)入其他DNA或者 RNA。
[0039] 而步驟=中，選用姜黃素作為乙酷化的試劑，能夠更好地將組織蛋白乙酷化。乙酷 化程度更高。使得之后進(jìn)入步驟四mRNA提取過(guò)程中，逆轉(zhuǎn)錄的表達(dá)更加準(zhǔn)確。
[0040] 在步驟五中，通過(guò)設(shè)定的參數(shù)，能夠得到更加準(zhǔn)確的詩(shī)句。最后通過(guò)對(duì)比，得到 mRNA的表達(dá)水平。
[0041 ]而在步驟一中，先將樣本碎片通過(guò)酒精清洗，先初步清洗掉黏附在樣本細(xì)胞表面 的雜質(zhì)，之后通過(guò)清洗劑浸泡，清洗劑中的去離子水、氯化鋼、氯化鐘、憐酸二氨鐘、憐酸氨 二鋼能夠形成適應(yīng)細(xì)胞生存的體系，特別是膠質(zhì)瘤細(xì)胞，其細(xì)胞活性能夠得到極大限度的 保證，同時(shí)通過(guò)憐酸甘油和海藻糖的加入，能夠進(jìn)一步保證細(xì)胞的活性，特別是蛋白質(zhì)的活 性，是的后期mRNA的表達(dá)更加準(zhǔn)確。同時(shí)，膜酶溶液中EDTA能夠提高膜酶的分離細(xì)胞的效 果，同時(shí)海藻糖、丙=醇、憐酸甘油的加入，一方面保證了膜酶溶液的活性，同時(shí)液保護(hù)細(xì)胞 組織不會(huì)被膜酶過(guò)度分解導(dǎo)致細(xì)胞失活。
[0042] 另外在步驟二中的培養(yǎng)基中添加海藻糖、殼聚糖、琉基乙醇、亞砸酸鋼，海藻糖能 夠?qū)δ[瘤細(xì)胞起到保護(hù)作用，使得細(xì)胞活性更高，同時(shí)亞砸酸鋼能夠提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需要 的微量元素，而殼聚糖不僅僅能夠起到保護(hù)細(xì)胞，提高活性，還能夠調(diào)整整體液體的粘稠 度，是使得細(xì)胞生存的環(huán)境更加穩(wěn)定。
[0043] 在步驟=中姜黃素乙酷化過(guò)長(zhǎng)中加入去甲氧基姜黃素，能夠提高姜黃素的穩(wěn)定 性，提高其乙酷化的表達(dá)。
[0044] 步驟一中，在完成膜酶消化后，通過(guò)膜酶抑制劑的加入能夠徹底抑制膜酶的分解 反應(yīng)，使得膜酶失活，而不會(huì)造成腫瘤細(xì)胞的失活，之后再清洗過(guò)程中，加入的甘油醇也同 樣能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞形成保護(hù)，目的是為了防止膜酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生損傷。
[0045] 在分離膜酶后，浸泡清洗液也是為了能夠去除腫瘤細(xì)胞表面的雜質(zhì)W外，還能夠 對(duì)腫瘤細(xì)胞起到一個(gè)保護(hù)作用。使得后期培養(yǎng)前就保證了腫瘤細(xì)胞的活性。
[0046] 另外，在培養(yǎng)過(guò)程中，加入了載體，通過(guò)聚乳酸、淀粉、聚苯乙締制備的載體，是一 種環(huán)保型載體，給細(xì)胞生長(zhǎng)提供了一個(gè)優(yōu)質(zhì)的環(huán)境，載體是一個(gè)多孔材料是的細(xì)胞生長(zhǎng)能 夠有更多的貼壁面積，更好的模擬了生物體內(nèi)的環(huán)境，保證了其細(xì)胞培養(yǎng)的成活率W及活 性。
[0047] 而在使用載體后，為了使得細(xì)胞從載體上脫落就需要用膜酶溶液進(jìn)行浸泡，之后 沖洗，沖洗下來(lái)的沖洗液為了充分利用，倒回到培養(yǎng)基中，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的提取。
[004引對(duì)比例1: 選用中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)的大鼠 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，大鼠 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株用含10%胎 牛血清、lOOU/ml青霉素，lOOU/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)24 h同步化后進(jìn)行藥物處理，分別加入Curcumin繼續(xù)培養(yǎng) 2地。
[0049] 采用TRIzol-步法從細(xì)胞中提取總RNA，取RNA模板化g用Prime ScriptTM II逆 轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cD-NA第一鏈，再W逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液化1作為模板，加入相應(yīng)引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件設(shè)置如下:95 °C預(yù)變性30s ;95°C變性20S，60°C 退火15s; 72°C延伸15s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。通過(guò)溶解曲線分析PCR產(chǎn)物特異性。每個(gè)樣品W GAPDH基因的mRNA表達(dá)作為內(nèi)參照，通過(guò)相對(duì)定量（2-AACT)法計(jì)算目的基因在各樣品 中相對(duì)mRNA的表達(dá)水平。
[0050] 對(duì)比例二： 取出生48 h內(nèi)的SD大鼠的雙側(cè)大腦皮質(zhì)，剪碎并用PBS沖洗數(shù)次，加入0.25 %膜酶37 °C消化5min。收集細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每周換液兩次。在原代 培養(yǎng)7-9天后，將培養(yǎng)瓶置于恒溫?fù)u床37°C，200rpm，20h震蕩純化，W去除小膠質(zhì)細(xì)胞及少 突膠質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)GFAP免疫巧光鑒定陽(yáng)性的細(xì)胞視為成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞。取第4代的處于 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。
[0051 ] 采用TRIzol-步法從細(xì)胞中提取總RNA，取RNA模板化g用Prime ScriptTM II逆 轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cD-NA第一鏈，再W逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液化1作為模板，加入相應(yīng)引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件設(shè)置如下:95 °C預(yù)變性30s ;95°C變性20S，60°C 退火15s; 72°C延伸15s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。通過(guò)溶解曲線分析PCR產(chǎn)物特異性。每個(gè)樣品W GAPDH基因的mRNA表達(dá)作為內(nèi)參照，通過(guò)相對(duì)定量（2~-AACT)法計(jì)算目的基因在各樣 品中相對(duì)mRNA的表達(dá)水平。
[0化2] 上述實(shí)施例和對(duì)比例一均做10次檢測(cè)，W及對(duì)比例二為空白試驗(yàn)對(duì)照組，并且記 錄其2 A ACT，進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)記錄其標(biāo)準(zhǔn)差。
[0化3] 表1
通過(guò)上述數(shù)據(jù)，可W得出，在癌變細(xì)胞中，2-AACT的表達(dá)水平有明顯提高。同時(shí)通過(guò) 實(shí)施例和對(duì)比例一的對(duì)比，能夠得，通過(guò)本發(fā)明處理過(guò)程后，經(jīng)過(guò)檢測(cè)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞2~-A ACT表達(dá)水平更高，同時(shí)通過(guò)兩者方差對(duì)比，本發(fā)明的檢測(cè)方法，2~-AACT的表達(dá)水平更 加穩(wěn)定。
[0054] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施 例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，運(yùn)些改進(jìn)和潤(rùn)飾也 應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子檢測(cè)方法，其特征在于： 步驟一:提取膠質(zhì)瘤細(xì)胞:取48h內(nèi)的膠質(zhì)瘤樣本，首先剪碎并用清洗，加入0.25 %胰酶 溶液在37°C條件下消化5min;收集細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每周換 液兩次;在原代培養(yǎng)7-9天后，將培養(yǎng)瓶置于恒溫?fù)u床37°C，200rpm，20h震蕩純化，以去除小 膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞； 經(jīng)GFAP免疫熒光鑒定陽(yáng)性的細(xì)胞視為成熟的細(xì)胞，取第4代的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為膠質(zhì) 瘤細(xì)胞株； 步驟二:細(xì)胞培養(yǎng):膠質(zhì)瘤細(xì)胞株用含10%胎牛血清、l〇〇U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素 的培養(yǎng)基，置于37 °C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 步驟三:藥物處理:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)24 h同步化后進(jìn)行藥物處理，加入終濃度為 25~100ymol/L的姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)24h; 步驟四：mRNA提取，采用TRIzol -步法從細(xì)胞中提取總RNA，取RNA模板2yg用Prime Script II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cD-NA第一鏈，再以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液ΙμL作為模板， 加入相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物的序列為： GAPDH:F:5 ' TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3 ' R:5 ' AGATCCACAACGGATACATT3 ' ⑶NF: F:5' GACTTGGGTTTGGGCTACGA3' R:5，TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3，； 步驟五：反應(yīng):95 °C預(yù)變性30s;95°C變性20S，60°C退火15s; 72°C延伸15s，擴(kuò)增40個(gè) 循環(huán)； 步驟六:計(jì)算:樣品以GATOH基因的mRNA表達(dá)作為內(nèi)參照，通過(guò)相對(duì)定量（2~-AACT) 法計(jì)算目的基因在各樣品中相對(duì)mRNA的表達(dá)水平。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子檢測(cè)方法，其特征在 于:所述步驟一中，在將樣本剪碎后，通過(guò)75%的酒精進(jìn)行一次清洗，之后通過(guò)清洗液中浸泡 15min后，在用清洗液沖洗至少三次，所述清洗液包括下列重量份組成： 去離子水 800~1000份 氯化鈉 5~10份 氯化鉀 0.1~1份 磷酸二氫鉀0.1~1份 磷酸氫二鈉1~2份 磷酸甘油 1~2份 海藻糖 0.1~1份； 再加入0.25 %胰酶溶液在37 °C條件下消化5min，所述胰酶溶液包括：0.25%的胰酶、 0.02%的EDTA、0.02%的海藻糖、5%的丙三醇、0.5%的磷酸甘油，余量為PBS緩沖液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子檢測(cè)方法，其特征在于:所述步 驟二中，培養(yǎng)基為以DMEM/F12培養(yǎng)液為基體，再添加海藻糖、殼聚糖、巰基乙醇、亞硒酸鈉， 所述海藻糖添加量為DMEM/F12培養(yǎng)液質(zhì)量的0.5%，殼聚糖為DMEM/F12培養(yǎng)液質(zhì)量的1~5 %， 所述亞硒酸鈉最終濃度為5~7ng/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子檢測(cè)方法，其特征在于:所述步 驟三中，在加入姜黃素進(jìn)行乙?；倪^(guò)程中，同時(shí)加入去甲氧基姜黃素，所述去甲氧基姜黃 素用量為姜黃素用量的1~5%。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子mRNA檢測(cè)方法，其特征在于:所 述步驟一中，胰酶溶液完成消化后，加入胰酶抑制劑解除胰酶溶液的消化作用，之后加入 PBS緩沖液、甘油醇進(jìn)行稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)高速離心機(jī)將整個(gè)混合液進(jìn)行離心，將上清液棄去后，收 集細(xì)胞培養(yǎng)于含有1 〇%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子檢測(cè)方法，其特征在于:所述步 驟一種，分離得到去胰酶的細(xì)胞后，再通過(guò)清洗液浸泡5min，浸泡過(guò)后在使用清洗劑清洗至 少三次，收集細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子檢測(cè)方法，其特征在于:所述步 驟二中的培養(yǎng)基中還添加有載體，所述載體為聚乳酸、淀粉、聚苯乙烯以葡萄糖水溶液為介 質(zhì)在60~80 °C下通過(guò)聚合反應(yīng)生成的微孔材料。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子mRNA檢測(cè)方法，其特征在于:所 述載體中以重量份計(jì):聚苯乙烯為30~50份，聚乳酸為5~15份，淀粉為5~15份，葡萄糖水溶液 濃度為5~10%。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子檢測(cè)方法，其特征在于:所述步 驟二中，在培養(yǎng)過(guò)程中，保持?jǐn)嚢瑁鰯嚢杷俣葹?0~50r/min。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GDNF基因啟動(dòng)子檢測(cè)方法，其特征在于:所述 步驟三中，在提取細(xì)胞時(shí)，先在步驟二培養(yǎng)基中加入0.25%的胰酶、0.02%的EDTA、0.02%的海 藻糖、5%的丙三醇、0.5%的磷酸甘油，余量為PBS緩沖液，消化5min后，使得細(xì)胞從載體上脫 落，取出載體，通過(guò)PBS緩沖液沖洗至少三次，沖下來(lái)的液體倒回原培養(yǎng)基，加入胰酶抑制劑 解除胰酶溶液的消化作用，之后加入PBS緩沖液、甘油醇進(jìn)行稀釋?zhuān)?jīng)過(guò)高速離心后的到的 細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)24 h同步化后進(jìn)行藥物處理，加入終濃度為25~100μ mol/L的 姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)24h。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106048002SQ201610372267
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】陳茂華, 孫軍, 陸川, 陳獻(xiàn)東, 巴華君, 蔡建勇
【申請(qǐng)人】溫州市中心醫(yī)院