基于rpa技術檢測向日葵莖潰瘍病菌的方法、rpa引物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種引物對，其中一條引物包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，另一條引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了所述的引物對在檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌，或制備檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品中的應用；以及基于RPA技術的檢測向日葵莖潰瘍病菌的方法。經(jīng)實驗證明，本發(fā)明的RPA引物特異性好、靈敏度高、檢測時間短、不需要特殊的儀器和適用范圍廣，且基于該引物建立的向日葵莖潰瘍病菌的RPA檢測方法靈敏、準確、簡便和快速，對進出口相關貨物及產(chǎn)品檢疫具有指導意義。
【專利說明】
基于RPA技術檢測向日葵莖演瘍病菌的方法、RPA引物及試 劑盒
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及生物檢測領域，特別設及檢測向日葵莖潰瘍病菌的方法、引物及試劑 盒。
【背景技術】
[0002] 向日葵莖潰瘍病菌（Phomopsis helianthi)即向日葵擬莖點霉褐色莖腐病菌 (Phomopsis helianthi M.Muntanola-Cvetkovic et al.)，在真菌系統(tǒng)中分類地位：無性 態(tài)屬于半知菌亞口（Deuteromycotina)腔抱綱（Coelomyceres)球殼抱目 (Sphaeropsidales)擬莖點霉屬（Phomopsis);有性態(tài)屬于子囊菌亞口（Ascomyxotin-a)核 菌綱（Pyrenomycetes )球科目（Sphaeroaes)間座殼科（Diapo;rthaceae)間座科屬 (Dispodhe)。是向日葵上一種毀滅性真菌病害，主要危害向日葵莖、葉、芙和種子，可造成 莖部潰瘍，植株枯萎，莖桿弱，易倒伏。病株花盤小，種子輕。該病菌已列入我國進境植物檢 疫性有害生物。近年來，我國從向日葵莖潰瘍病疫區(qū)國家進口向日葵種子的數(shù)量逐年增加， 專家分析認為，該病菌傳入我國的風險極大。
[0003] 1975年美國最先報道了向日葵莖潰瘍病的危害性，1981-1986年匈牙利、羅馬尼 亞、法國相繼報道了該病的發(fā)生情況。近幾年來，意大利、保加利亞，原捷克斯洛伐克，美國， 加拿大和阿根廷等國都報道過該病的大發(fā)生。原蘇聯(lián)于1985年，在烏克蘭外喀爾己巧州烏 日哥羅德區(qū)在向日葵雜交種索耳道爾上首次發(fā)現(xiàn)此病，1988-1989年在摩爾達瓦大部分地 區(qū)，烏克蘭的外喀爾己巧州，教德薩州和基洛夫格勒州也發(fā)現(xiàn)了該病，此病在大多數(shù)向日葵 種植國家流行，給向日葵生產(chǎn)造成極大危害。
[0004] 國內(nèi)外對此病菌的研究較少，2001年，Veronique等人用AFLP分析了該病菌的系統(tǒng) 發(fā)育；2004年，Mariarosaria等人用PCR，RFLP和Southern雜交技術，檢驗了該菌的遺傳生物 型和流行病學差異之間的關系；2007年，Mara等人研究了該病菌的病原形態(tài)、生物學特性及 品種抗病性。
[0005] RPA(Recombinase polymerase amplifcation)是一項新型的等溫擴增技術，其主 要原理為利用重組酶和引物形成微絲在模板DNA上捜索到與之完全互補配對的序列時，在 單鏈DNA結合蛋白的幫組下使模板DNA解鏈，引物于模板DNA開始配對，并在DNA聚合酶的作 用下復制延伸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種靈敏、準確、簡便和快速的基于RPA技術的檢 測向日葵莖潰瘍病菌的方法，本發(fā)明還提供了用于該方法的特異性好、靈敏度高、檢測時間 短、不需要特殊的儀器和適用范圍廣的RPA引物和含有該RPA引物的試劑盒。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn)：
[000引本發(fā)明第一方面提供了一種引物對，其中一條引物包含SEQ ID NO: 1所示的核巧 酸序列，另一條引物包含SEQ ID NO :2所示的核巧酸序列。
[0009] 本發(fā)明第二方面提供了所述的引物對在檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌，或制 備檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品中的應用；
[0010] 在一優(yōu)選例中，所述檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌包括:檢測或輔助檢測待 測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌，W及檢測或輔助檢測待測病原菌是否為或候選為向曰 葵莖潰瘍病菌；
[0011] 在一優(yōu)選例中，所述制備檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品包括:制備檢 測或輔助檢測待測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品，W及制備檢測或輔助檢測待測 病原菌為或候選為向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品。
[0012 ]本發(fā)明第立方面提供了一種試劑盒，包括所述的引物對。
[001引在一優(yōu)選例中，還包括RPA恒溫擴增試劑;
[0014] 在一優(yōu)選例中，所述RPA恒溫擴增試劑包括來自TwistDX公司的RPA擴增試劑盒 TwistAmp Basic kits所包含的試劑。
[001引在一優(yōu)選例中，還包括植物基因組DNA提取試劑；
[0016] 在一優(yōu)選例中，植物基因組DNA提取試劑包括來自天根生物科技有限公司貨號為 DP305-02的植物基因組DNA提取試劑盒所包含的試劑。
[0017] 本發(fā)明第四方面提供了一種試劑盒在檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌，或制備 檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品中的應用；
[0018] 在一優(yōu)選例中，所述檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌包括:檢測或輔助檢測待 測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌，W及檢測或輔助檢測待測病原菌是否為或候選為向曰 葵莖潰瘍病菌；
[0019] 在一優(yōu)選例中，所述制備檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品包括:制備檢 測或輔助檢測待測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品，W及制備檢測或輔助檢測待測 病原菌為或候選為向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品。
[0020] 本發(fā)明第五方面提供了一種檢測或輔助向日葵莖潰瘍病菌的方法，包括使用所述 的引物對或所述試劑盒的步驟。
[0021] 在一優(yōu)選例中，所述檢測或輔助向日葵莖潰瘍病菌包括:檢測或輔助檢測待測植 株是否感染向日葵莖潰瘍病菌；W及檢測或輔助檢測待測病原菌是否為或候選為向日葵莖 潰瘍病菌。
[0022] 在一優(yōu)選例中，所述的方法包括如下步驟：
[0023] 1)RPA 擴增
[0024] W待測植株或待測病原菌含有的DNA為模板與所述的引物對或所述試劑盒進行 RPA擴增，
[0025] 2)根據(jù)RPA擴增的結果判斷待測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌，或待測病原菌 是否為或候選為向日葵莖潰瘍病菌；
[0026] 在一優(yōu)選例中，所述RPA擴增的結果判斷的標準為：
[0027] 若所述RPA擴增得到的RPA擴增產(chǎn)物含有大小為234bp的片段，則所述待測植株感 染向日葵莖潰瘍病菌，或待測病原菌為或候選為向日葵莖潰瘍病菌；
[0028] 若所述RPA擴增產(chǎn)物不含有大小為234bp的片段，則所述待測植株未感染向日葵莖 潰瘍病菌，或待測病原菌不為或候選不為向日葵莖潰瘍病菌。
[0029] 在一優(yōu)選例中，在步驟1)之前還包括在待測植株或待測病原菌中提取DNA的步驟。
[0030] 在一優(yōu)選例中，所述在待測植株或待測病原菌中提取DNA是采用購買于天根生物 科技有限公司且貨號為DP305-02的植物基因組DNA提取試劑盒進行。
[0031 ] 在一優(yōu)選例中，所述RPA擴增的反應體系如下：
[0032] 含有凍干酶粉的0.2mL TwistAmp反應管
[0033] 再水化緩沖液29.化L
[0034] 沈Q ID N0:1和沈Q ID N0:2各化L，引物的終濃度均為0.4皿ol/L
[0035] 模板 DM 50ng，
[0036] 醋酸儀溶液 2.^iL，濃度為280mmol/L
[0037] 去離子水 12.化1
[0038] 在一優(yōu)選例中，所述RPA擴增的反應條件如下:所述RPA擴增的溫度為37°C，時間為 40min。
[0039] 本發(fā)明提到的待測植株，可為植物的根、莖、葉等部分的成長的植物體;而待測病 原菌則是一種純菌種或至少二種W上的菌種的混合。
[0040] 本發(fā)明的有益效果包括：
[0041 ] (1)本發(fā)明針對向日葵莖潰瘍病菌設計特異性RPA引物，建立了向日葵莖潰瘍病菌 RPA檢測方法，可對向日葵莖潰瘍病菌進行定性檢測。
[0042] (2)本發(fā)明針對向日葵莖潰瘍病菌僅設計了一對引物即可完成擴增，省去了復雜 的引物設計過程;本發(fā)明的引物擴增只需要37°C下恒溫反應即可，不需要特殊的熱循環(huán)設 備;反應時間僅需40min，檢測時間短;不像LAMP產(chǎn)物的彌散帶，RPA擴增產(chǎn)物根據(jù)引物設計 位點具有特定大小的條帶，其結果易于判斷。
[0043] (3)本發(fā)明的RPA擴增引物特異性好、靈敏度高且適用范圍廣。
[0044] (4)本發(fā)明建立的向日葵莖潰瘍病菌RPA檢測方法，靈敏、準確、簡便和快速，對進 出口相關貨物及產(chǎn)品檢驗檢疫具有指導意義。
【附圖說明】
[0045] 圖1是基于RPA引物的向日葵莖潰瘍病菌的RPA檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖，共有S 條泳道:其中M為marker化2000,1為向日葵莖潰瘍病菌的RPA擴增產(chǎn)物，2為陰性對照。
[0046] 圖2是采用本發(fā)明的RPA引物對多種向日葵病菌進行RPA檢測的瓊脂糖凝膠電泳 圖，共有十條泳道:其中M為marker化2000，1為向日葵莖潰瘍病菌的RPA擴增產(chǎn)物，2為向日 葵黑莖病菌的RPA擴增產(chǎn)物，3為向日葵白誘病菌的RPA擴增產(chǎn)物，4為向日葵黑白輪枝菌的 RPA擴增產(chǎn)物，5為向日葵大麗輪枝菌的RPA擴增產(chǎn)物，6為向日葵霜霉病菌的RPA擴增產(chǎn)物，7 為向日葵菌核病菌的RPA擴增產(chǎn)物，8為向日葵褐斑病菌的RPA擴增產(chǎn)物，9為向日葵誘病菌 的RPA擴增產(chǎn)物，10為陰性對照。
[0047] 圖3是采用本發(fā)明的RPA引物對梯度稀釋的向日葵莖潰瘍病菌進行RPA檢測的瓊脂 糖凝膠電泳圖，共有屯條泳道:其中M為marker化2000，1-6分別為稀釋度依次為100、1〇-1、 1〇-2、1〇-3、1〇-4和1〇-5向日葵莖潰瘍病菌DNA的RPA擴增產(chǎn)物。
[0048] 圖4是采用PCR引物對梯度稀釋的向日葵莖潰瘍病菌進行PCR檢測的瓊脂糖凝膠電 泳圖，共有屯條泳道:其中M為marker DL2000，1-6分別為稀釋度依次為1〇\ 1〇-1、1〇-2、10一3、 1(T4和1(T5的向日葵莖潰瘍病菌DNA的PCR擴增產(chǎn)物。
【具體實施方式】：
[0049] 除非特殊說明，本發(fā)明所用術語具有本發(fā)明所屬領域中的一般含義。
[0050] 下面參考具體實施例和附圖，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，運些實施例僅僅 是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領 域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠 商者，均為可W通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0化1]實施例1
[0052]本實施例提供了一種RPA引物及其應用。
[005引 RPA引物的篩選方法為：針對向日葵莖潰瘍病菌的cal基因（Genbank登錄號 KC343357.1)的保守序列，設計檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌的RPA引物，設計了多條 RPA引物后進行了大量篩選，綜合其特異性、靈敏度和所使用的各引物與RPA擴增試劑盒的 適配性，最終篩選出特異性好、靈敏度高且適用范圍廣的一對RPA引物。
[0化4] 此RPA引物具體序列如下：
[0055] 上游引物DH-Rf: 5' -GTACCCCGAGCGACCGATCATTAAATCTATCA CG-3'(沈Q ID NO: 1);
[0056] 下游引物DH-Rr:5'-CACCGCCCGATATGCAGTGTACGAGAATCTAAACG-3'(沈QIDN0: 2)。
[0057] 上述RPA引物由上海生工生物技術有限公司合成。
[0058] 利用上述RPA引物針對向日葵莖潰瘍病菌的cal基因進行RPA擴增，得到的RPA擴增 產(chǎn)物大小為234bp。
[0059] 上述RPA引物可應用于檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌上，例如檢測或輔助檢 測待測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌，或檢測或輔助檢測待測病原菌是否為或候選為向 日葵莖潰瘍病菌;還可W用來制備檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品，例如制備檢 測或輔助檢測待測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品，或制備檢測或輔助檢測待測病 原菌為或候選為向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品。
[0060] 實施例2
[0061 ]本實施例提供了一種試劑盒及其應用，所述試劑盒包括：
[0062] (1)上游引物DH-Rf和下游引物DH-Rr (來自實施例1);
[0063] (2)含凍干酶粉管；
[0064] (3)再水化緩沖液；
[0065] (4)醋酸儀溶液。
[0066] 上述含凍干酶粉管、再水化緩沖液（Rehydration Buffer)和醋酸儀溶液 (280mmol/L)均來源于RPA擴增試劑盒TwistAmp Basic kits(Twist DX公司，產(chǎn)品目錄號為 TABAS03KIT)。
[0067] 進一步優(yōu)選包括植物基因組DNA提取試劑盒(購自天根生物科技有限公司，貨號為 DP305-02)
[006引實驗證明，上述植物基因組DNA提取試劑盒與RPA擴增試劑盒TwistA mp Basic ki ts、上游引物DH-Rf和下游引物DH-化的聯(lián)合使用，效果更加優(yōu)越，具體表現(xiàn)在特異性強， 靈敏度與普通PCR相當，而且不需要昂貴的熱循環(huán)儀器，恒溫反應即可，反應時間僅需30分 鐘，結果容易判斷。
[0069] 上述試劑盒可應用于檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌上，例如檢測或輔助檢測 待測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌，或檢測或輔助檢測待測病原菌是否為或候選為向日 葵莖潰瘍病菌;還可W用來制備檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品，例如制備檢測 或輔助檢測待測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品，或制備檢測或輔助檢測待測病原 菌為或候選為向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品。
[0070] 實施例3
[0071] 本實施例提供了一種檢測或輔助向日葵莖潰瘍病菌的方法，例如檢測或輔助檢測 待測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌，或檢測或輔助檢測待測病原菌是否為或候選為向日 葵莖潰瘍病菌，該方法使用了實施例1的RPA引物和實施例2的試劑盒。
[0072] 上述方法包括如下步驟：
[0073] (l)RPA 擴增
[0074] W待測植株或待測病原菌的DNA為模板，采用DH-Rf和DH-化引物進行RPA擴增，得 到RPA擴增產(chǎn)物，同時設置空白對照(模板為超純水）。
[00對 RPA擴增體系的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0.2mL TwistAmp反應管中加入 再水化緩沖液(Rehydration Buffer)29 .!5化、去離子水12.5化、上、下游引物（實施例1的 畑-Rf和DH-Rr)各化L(引物的終濃度均為0.4皿ol/L)，模板DNA 5化g，最后再加入醋酸儀溶 液2.5]iL(280mmol/L)。
[0076] RPA擴增反應條件：將上述RPA擴增體系充分混勻，置于3 7 °C的金屬浴上反應 40min，得到RPA擴增產(chǎn)物。
[0077] (2)RPA擴增產(chǎn)物的電泳檢測
[007引RPA反應結束后，向上述RPA擴增產(chǎn)物中加入50化苯酪/氯仿（1:1)溶液，充分混勻 后1200化pm離屯、2min，取扣L上清液于1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果， 并對RPA擴增產(chǎn)物進行測序。
[0079] 所述RPA擴增的結果判斷的標準為：
[0080] 若所述RPA擴增得到的RPA擴增產(chǎn)物含有大小為234bp的片段，則所述待測植株感 染向日葵莖潰瘍病菌，或待測病原菌為或候選為向日葵莖潰瘍病菌；
[0081] 若所述RPA擴增產(chǎn)物不含有大小為234bp的片段，則所述待測植株未感染向日葵莖 潰瘍病菌，或待測病原菌不為或候選不為向日葵莖潰瘍病菌。
[0082] 如果待測植株或待測病原菌還未提取DNA，上述方法步驟（l)RPA擴增之前還可W 包括使用植物基因組DNA提取試劑盒(購自天根生物科技有限公司，貨號為DP305-02)按照 試劑盒說明書對待測植株或待測病原菌中的DNA進行提取的步驟。
[0083] 實施例4
[0084] 本實施例對實施例3建立的檢測或輔助向日葵莖潰瘍病菌的方法進行了有效性驗 證。
[00化]步驟一:基因組DNA的提取
[0086]將向日葵莖潰瘍病菌(保存于中華人民共和國伊準出入境檢驗檢疫局)經(jīng)5-7天純 培養(yǎng)后，挑取菌絲冷凍干燥后，用液氮充分研磨，然后采用植物基因組DM提取試劑盒(購自 天根生物科技有限公司，貨號為DP305-02)提取基因組DNA，提取方法按照試劑盒說明書進 行。
[0087] 步驟二:RPA擴增
[008引 W步驟一獲得的基因組DNA為模板，采用實施例1的DH-Rf和DH-化引物進行RPA擴 增，同時設置空白對照(DNA模板為超純水）。
[0089] RPA擴增體系的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0.2mL TwistAmp反應管中加入 再水化緩沖液(Rehydration Buffe;r)29 .!5化，去離子水12.5化，上、下游引物（實施例1的 畑-Rf和DH-Rr)各化L(引物的終濃度均為0.4皿ol/L)，模板DNA 5化g，最后再加入醋酸儀溶 液2.5]iL(280mmol/L)。
[0090] R P A擴增反應條件：將上述R P A擴增體系充分混勻，置于3 7 °C的金屬浴上反應 40min，得到RPA擴增產(chǎn)物。
[0091] 步驟S: RPA擴增產(chǎn)物的電泳檢測
[0092] RPA反應結束后，向RPA擴增產(chǎn)物中加入50化苯酪/氯仿（1: 1)溶液，充分混勻后 1200化pm離屯、2min，取上清液化L于1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果，并 對RPA擴增產(chǎn)物進行測序
[0093] 結果如圖1所示：向日葵莖潰瘍病菌的RPA擴增產(chǎn)物含有1個條帶，大小為234bp，而 陰性對照無條帶，說明本發(fā)明的基于RPA引物及RPA試劑盒建立的檢測或輔助向日葵莖潰瘍 病菌的方法可W有效檢測向日葵莖潰瘍病菌。
[0094] 實施例5
[009引本實施例對實施例1的RPA引物進行了特異性驗證，所用的供試材料如下：向日葵 莖潰瘍病菌、向日葵黑莖病菌、向日葵白誘病菌、向日葵黑白輪枝菌、向日葵大麗輪枝菌、向 日葵霜霉病菌、向日葵菌核病菌、向日葵褐斑病菌、向日葵誘病菌共9種菌株，編號依次為1， 2,3,…，8,9,均保存于中華人民共和國伊準出入境檢驗檢疫局。
[0096] 表2、供試菌株
[0097]
[0098] 特異性驗證方法如下：
[0099] 對不可培養(yǎng)的菌株(表2中編號為3、6、9)可直接采集感病植株，液氮充分研磨;對 可培養(yǎng)的菌株(表2中編號為1、2、4、5、7、8)經(jīng)5-7天純培養(yǎng)后，挑取菌絲冷凍干燥后，用液氮 充分研磨，然后采用植物基因組DNA提取試劑盒（購自天根生物科技有限公司，貨號為 DP305-02)參照試劑盒說明書操作提取研磨處理后的感病植株(表2中編號為3、6、9)或純菌 株(表2中編號為1、2、4、5、7、8)的基因組DNA。
[0100] W提取的基因組DNA為模板，進行RPA擴增和RPA擴增產(chǎn)物的電泳檢測，RPA擴增和 RPA擴增產(chǎn)物的電泳檢測的方法同實施例4的步驟二和步驟=。
[0101] 結果分析：
[0102] 結果如圖2所示，從圖中可W看出：僅有向日葵莖潰瘍病菌的RPA擴增產(chǎn)物含有1個 大小為234bp的條帶，其它8種參照菌株均無條帶，由此證明本發(fā)明實施例1的RPA引物具有 高特異性;進一步的，本發(fā)明基于RPA引物及RPA試劑盒建立的檢測或輔助向日葵莖潰瘍病 菌的方法能夠準確的對向日葵莖潰瘍病菌進行檢測。
[0103] 實施例6
[0104] 本實施例對實施例1的RPA引物進行了靈敏度的驗證，其方法如下：
[010日]步驟一 :DNA的提取
[0106] 參照實施例5的方法對向日葵莖潰瘍病菌(保存于中華人民共和國伊準出入境檢 驗檢疫局）提取基因組DNA，并將提取的基因組DNA進行梯度稀釋，分別得到稀釋度為10<\10 -1、10-2、10-3、10-4和10-5(對應濃度分別為100雌/化、10叫/化、1叫/化、0.1雌/化、0.01雌/化 和0.0 Olng/化)的向日葵莖潰瘍病菌的DNA。
[0107] 步驟二:擴增 [010 引（l)RPA 擴增
[0109] 分別W上述步驟一得到的稀釋度為1〇*\1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇- 4和1〇-5的向日葵莖潰瘍 病菌的DNA為模板，模板量均取化L，進行RPA擴增和RPA擴增產(chǎn)物的電泳檢測，RPA擴增和RPA 擴增產(chǎn)物的電泳檢測的方法同實施例4的步驟二和步驟=。
[0110] (2)PCR 擴增
[0111] 分別W上述步驟一得到的稀釋度為1〇*\ 1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4和1〇-5的向日葵莖潰瘍 病菌的DNA為模板，模板量均取化L，采用引物PHDF巧日P皿F2進行PCR擴增，得到預期326bp的 擴增產(chǎn)物。
[0112] 引物序列如下：
[0113] PHDF1:5' -TCGCCGCTGGATTTCA-3';
[0114] PHDF2：5' -CCTGGGAACAGGGAGCAGC-3' 〇
[0115] PCR擴增的體系和反應條件參考文獻"應用PCR法檢測向日葵莖潰瘍病菌的研究， 新疆農(nóng)業(yè)科學，2102，49 (3): 470-47護中的方法。
[0116] 步驟S :電泳檢測
[0117] (1 )RPA擴增反應結束后，分別向RPA擴增產(chǎn)物中加入50化苯酪/氯仿（1:1)溶液，充 分混勻，12000rpm離屯、2min，取扣L上清液于1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察 結果。RPA電泳結果如圖3所示。
[0118] (2 )PCR擴增反應結束后，取扣L的PCR擴增產(chǎn)物于1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成 像系統(tǒng)上觀察結果。PCR電泳結果如圖4所示。
[0119] 從圖巧P圖4中可W看出，本發(fā)明的RPA方法與普通PCR的靈敏度相當，均為1(T3稀釋 度。
【主權項】
1. 一種引物對，其中一條引物包含SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，另一條引物包含 SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。2. 權利要求1所述的引物對在檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌，或制備檢測或輔助 檢測向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品中的應用； 任選的，所述檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌包括:檢測或輔助檢測待測植株是否 感染向日葵莖潰瘍病菌，以及檢測或輔助檢測待測病原菌是否為或候選為向日葵莖潰瘍病 菌； 任選的，所述制備檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品包括：制備檢測或輔助檢 測待測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品，以及制備檢測或輔助檢測待測病原菌為或 候選為向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品。3. -種試劑盒，其特征在于:包括權利要求1所述的引物對。4. 根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，其特征在于:還包括RPA恒溫擴增試劑； 任選的，所述RPA恒溫擴增試劑包括來自TwistDX公司的RPA擴增試劑盒TwistAmp Basic kits所包含的試劑。5. 根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于:還包括植物基因組DNA提取試劑； 任選的，植物基因組DNA提取試劑包括來自天根生物科技有限公司貨號為DP305-02的 植物基因組DNA提取試劑盒所包含的試劑。6. 權利要求3至5任一項所述的試劑盒在檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌，或制備檢 測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品中的應用； 任選的，所述檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌包括:檢測或輔助檢測待測植株是否 感染向日葵莖潰瘍病菌，以及檢測或輔助檢測待測病原菌是否為或候選為向日葵莖潰瘍病 菌； 任選的，所述制備檢測或輔助檢測向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品包括：制備檢測或輔助檢 測待測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品，以及制備檢測或輔助檢測待測病原菌為或 候選為向日葵莖潰瘍病菌的產(chǎn)品。7. -種檢測或輔助向日葵莖潰瘍病菌的方法，其特征在于:包括使用權利要求1所述的 引物對或權利要求3-5中任一項所述試劑盒的步驟。 任選的，所述檢測或輔助向日葵莖潰瘍病菌包括:檢測或輔助檢測待測植株是否感染 向日葵莖潰瘍病菌；以及檢測或輔助檢測待測病原菌是否為或候選為向日葵莖潰瘍病菌。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于:包括如下步驟： 1. RPA擴增 以待測植株或待測病原菌含有的DNA為模板與權利要求1所述的引物對或權利要求3-4 中任一項所述試劑盒進行RPA擴增， 2) 根據(jù)RPA擴增的結果判斷待測植株是否感染向日葵莖潰瘍病菌，或待測病原菌是否 為或候選為向日葵莖潰瘍病菌； 任選的，所述RPA擴增的結果判斷的標準為： 若所述RPA擴增得到的RPA擴增產(chǎn)物含有大小為234bp的片段，則所述待測植株感染向 日葵莖潰瘍病菌，或待測病原菌為或候選為向日葵莖潰瘍病菌;若所述RPA擴增產(chǎn)物不含有 大小為234bp的片段，則所述待測植株未感染向日葵莖潰瘍病菌，或待測病原菌不為或候選 不為向日葵莖潰瘍病菌。9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于:在步驟1)之前還包括在待測植株或待測病 原菌中提取DNA的步驟； 任選的，所述在待測植株或待測病原菌中提取DNA是采用購買于天根生物科技有限公 司且貨號為DP305-02的植物基因組DNA提取試劑盒進行。10. 根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于:所述RPA擴增的反應體系如下：任選的，所述RPA擴增的反應條件如下:所述RPA擴增的溫度為37°C，時間為40min。
【文檔編號】C12N15/11GK106048010SQ201610390338
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】乾義柯, 張娜, 魏霜, 張祥林, 李芳 , 尚爽, 陸平
【申請人】伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心, 新疆出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心