一種多重pcr快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于農(nóng)作物病原菌有性生殖類(lèi)型鑒定領(lǐng)域，尤其涉及一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，專(zhuān)用于檢測(cè)稻曲菌有性生殖交配型基因,包括稻曲菌分離培養(yǎng)、制備稻曲菌基因組DNA保存?zhèn)溆?、PCR擴(kuò)增反應(yīng)和凝膠電泳檢測(cè)等步驟，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，有效提高稻曲菌交配型基因檢測(cè)和交配型類(lèi)型鑒定的準(zhǔn)確度，且保證了擴(kuò)增的特異性，提高了擴(kuò)增效率，不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性和非特異擴(kuò)增。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)作物病原菌有性生殖類(lèi)型鑒定領(lǐng)域，尤其涉及一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，專(zhuān)用于檢測(cè)稻曲菌有性生殖交配型基因。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]稻曲菌[Ustilaginoidea virens Cooke Tanaka]是引起水稻稻曲病的真菌病原菌，主要侵染水稻的穗部，將稻粒轉(zhuǎn)變成大于其數(shù)倍的稻曲球，這嚴(yán)重降低了水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量。該菌無(wú)性態(tài)屬于半知菌亞門(mén)瘤座孢科;有性態(tài)[Villosiclava virens (Nakata) E.Tanaka & C.Tanaka]屬于子囊菌亞門(mén)麥角菌科。
[0004]真菌的交配型基因(Mating-typegene)是控制其有性生殖、生存力和毒性等的遺傳基礎(chǔ)，已知研究的真菌交配類(lèi)型為異宗配合或同宗配合。交配型基因主要參與有性生殖過(guò)程基因表達(dá)調(diào)控，不同細(xì)胞融合識(shí)別，以及調(diào)控信息素及其受體等。
[0005]近些年來(lái)，研究者們對(duì)稻曲菌的交配型基因進(jìn)行了一些研究，例如根據(jù)子囊菌交配型基因的核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增到了稻曲菌一種交配型基因(Matl-2-1)的部分序列；或根據(jù)稻曲菌同屬真菌的交配型基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增到了交配型基因Matl-1-1和Matl-2-l部分序列。以上研究方法都是采用的常規(guī)PCR方法，且引物都是設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物，因而較難擴(kuò)增到特異的交配型核苷酸序列，且耗時(shí)。
[0006]多重PCR是在常規(guī)PCR技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的，是在同一PCR反應(yīng)加入兩對(duì)或兩對(duì)以上的特異引物，能同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核苷酸序列的PCR反應(yīng)。利用一次多重PCR反應(yīng)，可以同時(shí)檢測(cè)、鑒別出多種基因，且操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高;可以大大提高檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本，具有很尚的經(jīng)濟(jì)效益。
[0007]但多重PCR檢測(cè)方法雖具有特異靈敏性，簡(jiǎn)便快速，高通量的檢測(cè)技術(shù)，但其在實(shí)際運(yùn)用中也存在不少問(wèn)題，比如引物二聚體的形成，以及引物與模板的錯(cuò)配問(wèn)題；比如污染問(wèn)題就是其中之一。一旦有極少量外源性DNA污染，就可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增，各種實(shí)驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)擴(kuò)增失敗或非特異性產(chǎn)物，引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇不當(dāng)?shù)榷伎赡芙档推潇`敏度和特異性。還有菌的培養(yǎng)基選擇不當(dāng)，也會(huì)易使菌生長(zhǎng)緩慢或被抑制，導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，其具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，有效提高稻曲菌交配型基因檢測(cè)和交配型類(lèi)型鑒定的準(zhǔn)確度，且保證了擴(kuò)增的特異性，提高了擴(kuò)增效率，不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性和非特異擴(kuò)增。
[0010]解決以上技術(shù)問(wèn)題的本發(fā)明的一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:包括以下步驟:
(1)稻曲菌分離培養(yǎng):
在稻曲病發(fā)病高峰期，收集稻曲球樣本，室內(nèi)保存?zhèn)溆?，進(jìn)行分離培養(yǎng)；
(2)提取稻曲菌基因組DNA保存?zhèn)溆?采用液氮研磨菌絲體，應(yīng)用CTAB法提取各菌株DNA，得到的樣品-22—18° C保存?zhèn)溆茫?br> (3)PCR擴(kuò)增反應(yīng):以稻曲菌DNA為模版，在PCR反應(yīng)體系中加入兩對(duì)特異引物MATlFl/MAT1RUMAT2F1/MAT2R1進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，質(zhì)量濃度比為1:1，該兩對(duì)特異引物的序列分別為:
特異引物MAT1F1:5’-CTT TGA GGT TGA GTT TCG TTC AGC-3，，
特異引物MATlRl:5’-CAT TTG AAA CCG ATA GAA GCG GG-3，，
特異引物MAT2F1:5’-CCT CGC TGT ATT ATG GCA GTT TCT-3，，
特異引物MAT2R1:5’-CCC CAC AAA AAG ACC GTC CCG GA-3’。
[0011]引物是根據(jù)稻曲菌交配型基因核心序列(編碼alpha-box和HMG結(jié)構(gòu)域)并應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。
[0012](4)最后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)；
PCR產(chǎn)物與10 XPCR上樣緩沖液(loading buffer)液混合，在加核酸燃料(Goldview)染色的3%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳后用紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，如果擴(kuò)增到兩條核苷酸序列，則為說(shuō)明稻曲菌有性生殖為同宗配合，如果擴(kuò)增到一條序列，則說(shuō)明稻曲菌有性生殖為異宗配合。
[0013]所述采用稻曲球厚垣孢子懸浮液分離方法分離稻曲菌，稻曲菌菌株接種到PSA固體培養(yǎng)基上，25-30° C培養(yǎng)12-16天;挑取稻曲菌菌絲塊于PS液體培養(yǎng)基中，置于23-30° C震蕩培養(yǎng)5-8天，過(guò)濾收集菌絲于50mlEP管中，-75—65° C保存?zhèn)溆谩?br>[0014]優(yōu)化方案中，所述的分離培養(yǎng)為采用稻曲球厚垣孢子懸浮液分離方法分離稻曲菌，稻曲菌菌株接種到馬鈴薯蔗糖瓊脂糖(PSA)固體培養(yǎng)基上，28° C培養(yǎng)14d左右;挑取稻曲菌菌絲塊于PS液體培養(yǎng)基中，置于28° C震蕩培養(yǎng)7天左右，過(guò)濾收集菌絲于50mlEP管中，-70° C保存?zhèn)溆茫?br> 所述PCR反應(yīng)體系為:基因組DNA 10 pM 2yL，含Mg2+的 10XPCR buffer lyL，dNTP 5μL，特異引物MAT1F1/MAT1R1、MAT2F1/MAT2R1 各I yL，Taq聚合酶 0.5pL,無(wú)菌dd H20 37.5μL，反應(yīng)終體積為50yL。
[0015]所述基因組DNA的質(zhì)量濃度為10 pM,dNTP 5仙的質(zhì)量濃度為2.5mM，Taq聚合酶質(zhì)量濃度為5U/UL。
[0016]所述特異引物MAT1F1/MAT1R1 或 MAT2F1/MAT2R1 質(zhì)量濃度為 0.1-0.25μΜ。
[0017]所述特異引物MAT1F1/MAT1R1 或 MAT2F1/MAT2R1 質(zhì)量濃度為 0.2μΜ。
[0018]基因組DNA10 pM 2yL:模板DNA量小時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物強(qiáng)度相應(yīng)減弱，當(dāng)模板量大時(shí)，會(huì)出現(xiàn)大片段擴(kuò)增產(chǎn)物丟失或無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，且點(diǎn)樣孔至電泳道出現(xiàn)強(qiáng)的彌散背景。本發(fā)明選用模板DNA濃度10 pM，能擴(kuò)增到條帶清晰、穩(wěn)定、分辨率到的產(chǎn)物。
[0019]特異引物MATlFl/MATlRl、MAT2Fl/MAT2Rl(0.2yM)各IyL:引物為PCR反應(yīng)提供核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，特異的結(jié)合在核苷酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，有效的得到目的序列；不同引物濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增結(jié)果不一致，當(dāng)引物濃度高于0.25μΜ時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)彌散背景，并且有些擴(kuò)增帶發(fā)生減弱或消失。本發(fā)明經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)確定引物MAT1F1/MAT1R1、MAT2Fl/MAT2Rl(0.2yM)各I yL為宜。
[0020]所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?93-96°C預(yù)變性l-3min; 93-96°C變性20_60s，45°C_60°C退火45s-90s，70?75°C 延伸30-60s，30-40個(gè)循環(huán)；最后72° C延伸8min，4° C保存。
[0021 ]本發(fā)明中的優(yōu)化方案為所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95° C預(yù)變性2min; 95° C變性35s，56° C退火Imin，72° C延伸40s，35個(gè)循環(huán);最后72° C延伸8min，4° C保存。
[0022]95° C預(yù)變性2min:預(yù)變性是為了打開(kāi)模板DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，DNA雙鏈充分打開(kāi)后，在第一次退火過(guò)程中引物可以盡多的結(jié)合到靶序列上;溫度不同，預(yù)變性時(shí)間不同，本發(fā)明中95° C預(yù)變性2min是適宜稻曲菌DNA預(yù)變性條件。
[0023]95°C變性35s:變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因，但溫度不能過(guò)高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響，此步若不能使靶基因模板完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗;本發(fā)明經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)確定95° C變性35s是最佳。
[0024]56° C退火Imin:退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素，變性后溫度快速冷卻至45°C_60°C，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于本試驗(yàn)引物23-24個(gè)核苷酸，G+C含量約45%-52%，56° C退火Imin可以使引物與模板完全結(jié)合。
[0025]72。(:延伸408:?0?反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70?75°(:之間，常用溫度為72°(:，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，是根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，本發(fā)明72° C延伸40s就能保證靶序列合成。
[0026]35個(gè)循環(huán):循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量，但循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。本發(fā)明中35個(gè)循環(huán)既保證靶序列的量，又避免了非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
[0027]本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于:
(1)本發(fā)明選用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能針對(duì)性的檢測(cè)出稻曲菌交配型基因單一的目的片段，具有很高的特異性和靈敏度，不會(huì)檢測(cè)出其它一些基因，同時(shí)受菌株本身污染干擾小，準(zhǔn)確率高；
(2)本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、快速，大大提高了檢測(cè)效率、縮短了一半檢測(cè)時(shí)間、降低了檢測(cè)成本，同時(shí)能根據(jù)擴(kuò)增交配型基因核苷酸序列有無(wú)快速的鑒定稻曲菌有性生殖類(lèi)型。
[0028](3)本發(fā)明靈敏度高、特異性強(qiáng)，引物的設(shè)計(jì)解決了反應(yīng)過(guò)程中引物二聚體的形成，以及引物與模板的錯(cuò)配問(wèn)題，避免了外源DNA污染導(dǎo)致假陽(yáng)性。
[0029]
【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1是本發(fā)明的實(shí)施例的凝膠電泳結(jié)果圖。
[0031](其中，M為T(mén)rans2KDNA marker，1-17號(hào)為多重PCR擴(kuò)增16株稻曲菌交配型基因結(jié)果:1.陰性對(duì)照；
2.Uvcdl,3.Uvcd2,4.Uvcd6,5.Uvcd8,6.Uvql2,7.Uvql3,8.Uvql5,9.Uvql6,10.Uvyal；11.Uvya2,12.Uvya3,13.Uvya5,14.Uvnc2,15.Uvnc3,16.Uvnc5,17.Uvnc6)
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0033]實(shí)施例1
稻曲菌分離培養(yǎng):在稻曲病發(fā)病高峰期，從四川各地收集稻曲球樣本，室內(nèi)保備用;采用稻曲球厚垣孢子懸浮液分離方法分離稻曲菌，把分離純化得到的稻曲菌菌株接種到馬鈴薯蔗糖瓊脂糖(PSA)固體培養(yǎng)基上，28° C培養(yǎng)14d左右;挑取稻曲菌菌絲塊于PS液體培養(yǎng)基中，置于28° C震蕩培養(yǎng)7d左右，過(guò)濾收集菌絲于50mlEP管中，-70。C保存?zhèn)溆?稻曲菌為常見(jiàn)菌種。
[0034]其次提取稻曲菌基因組DNA保存?zhèn)溆?采用液氮研磨菌絲體，應(yīng)用CTAB法提取各菌株DNA，得到的樣品-20° C保存?zhèn)溆谩?br>[0035]實(shí)施例2
其它內(nèi)容如實(shí)施例1，其中25°C培養(yǎng)16d左右;挑取稻曲菌菌絲塊于PS液體培養(yǎng)基中，置于23° C震蕩培養(yǎng)8d左右，過(guò)濾收集菌絲于50mlEP管中，-75° C保存?zhèn)溆茫?br> 其次提取稻曲菌基因組DNA保存?zhèn)溆?采用液氮研磨菌絲體，應(yīng)用CTAB法提取各菌株DNA，得到的樣品-22° C保存?zhèn)溆谩?br>[0036]實(shí)施例3
其它內(nèi)容如實(shí)施例1，其中30°C培養(yǎng)12d左右;挑取稻曲菌菌絲塊于PS液體培養(yǎng)基中，置于30° C震蕩培養(yǎng)5d左右，過(guò)濾收集菌絲于50mlEP管中，-65° C保存?zhèn)溆茫?br> 其次提取稻曲菌基因組DNA保存?zhèn)溆?采用液氮研磨菌絲體，應(yīng)用CTAB法提取各菌株DNA，得到的樣品-18° C保存?zhèn)溆谩?br>[0037]實(shí)施例4
然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng):以稻曲菌DNA為模版，在PCR反應(yīng)體系中加入兩對(duì)特異引物MAT1F1/MAT1R1、MAT2F1/MAT2R1進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，質(zhì)量濃度比例為1:1，該兩對(duì)特異引物的序列分別為:
特異引物MAT1F1:5’-CTT TGA GGT TGA GTT TCG TTC AGC-3，，
特異引物MATlRl:5’-CAT TTG AAA CCG ATA GAA GCG GG-3，，
特異引物MAT2F1:5’-CCT CGC TGT ATT ATG GCA GTT TCT-3，，
特異引物MAT2R1:5’-CCC CAC AAA AAG ACC GTC CCG GA-3’。
[0038]引物是根據(jù)稻曲菌交配型基因核心序列(編碼alpha-box和HMG結(jié)構(gòu)域)并應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由北京華大基因公司合成并提供。
[0039]PCR 反應(yīng)體系為:基因組DNA 2yL，10XPCR buffer(含 Mg2+)lyL，dNTP(2.5mM) 5μL，特異引物MAT1F1/MAT1R1、MAT2F1/MAT2R1 各I yL，Taq聚合酶(5U/yL)0.5yL，無(wú)菌dd H2037.5yL，反應(yīng)終體積為50UL; (PCR)
PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95° C預(yù)變性2min ； 95° C變性35s，56° C退火Imin，72° C延伸40s，35個(gè)循環(huán);最后72° C延伸8min，4° C保存。
[0040]最后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，5yL PCR產(chǎn)物與IyLlO XPCR loading buffer混合，在加Goldview染色的3%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳后進(jìn)行紫外檢測(cè)儀檢測(cè)電泳，拍照得到圖1o
[0041 ] 實(shí)施例5
其它內(nèi)容如實(shí)施例4中的內(nèi)容，其中基因組DNA的質(zhì)量濃度為10pM，dNTP 5仙的質(zhì)量濃度為2.5mM，Taq聚合酶質(zhì)量濃度為5U/UL，特異引物MAT1F1/MAT1R1或MAT2F1/MAT2R1質(zhì)量濃度為0.ΙμΜ。
[0042]PCR擴(kuò)增程序?yàn)?93° C預(yù)變性Imin; 93-96° C變性20s，45°C °C退火45ss，70°C延伸30s，30個(gè)循環(huán);最后72° C延伸8min，4° C保存。
[0043]實(shí)施例6
其它內(nèi)容如實(shí)施例4中的內(nèi)容，其中基因組DNA的質(zhì)量濃度為10pM，dNTP 5仙的質(zhì)量濃度為2.5mM，Taq聚合酶質(zhì)量濃度為5U/UL。特異引物MAT1F1/MAT1R1或MAT2F1/MAT2R1質(zhì)量濃度為 0.25μΜ。
[0044]PCR擴(kuò)增程序?yàn)?96°(:預(yù)變性311^11; 96°C變性60s，60°C退火90s，75°C延伸60s，40個(gè)循環(huán);最后72° C延伸8min，4° C保存。
[0045]實(shí)施例7
其它內(nèi)容如實(shí)施例4中的內(nèi)容，其中基因組DNA的質(zhì)量濃度為10pM，dNTP 5仙的質(zhì)量濃度為2.5mM，Taq聚合酶質(zhì)量濃度為5U/UL，特異引物MAT1F1/MAT1R1或MAT2F1/MAT2R1質(zhì)量濃度為0.2μΜ。
[0046]PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95° C預(yù)變性2min; 94° C變性40s，55°C退火60s，73°C 延伸40s，38個(gè)循環(huán);最后72° C延伸8min，4° C保存。
[0047]實(shí)施例8
本實(shí)施例中，以清水作為陰性對(duì)照，同樣進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，標(biāo)記為I。
根據(jù)圖1中目的片段MATl-1為256 bp和MAT1-2為220 bp的有無(wú)判斷檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示:樣品 2- Uvcd1、3-Uvcd2、4-Uvcd6、5-Uvcd8、6-Uvql 2、7-Uvql3、8-Uvql 5、9-Uvql6、10_Uvyal、11-Uvya2、12_Uvya3、13_Uvya5、14_Uvnc2、15_Uvnc3、16_Uvnc5、17- Uvnc6都檢測(cè)出交配型基因MATl-1和MAT1-2，結(jié)果說(shuō)明這些菌株同時(shí)擁有這兩種基因，因此推斷稻曲菌為同宗配合的真菌。
[0048]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)稻曲菌分離培養(yǎng): 在稻曲病發(fā)病高峰期，收集稻曲球樣本，分離培養(yǎng)； (2)提取稻曲菌基因組DNA保存?zhèn)溆?采用液氮研磨菌絲體，應(yīng)用CTAB法提取各菌株DNA，得到的樣品-22—18° C保存?zhèn)溆茫? (3)PCR擴(kuò)增反應(yīng):以稻曲菌DNA為模版，在PCR反應(yīng)體系中加入兩對(duì)特異引物MATlFl/MAT1RUMAT2F1/MAT2R1進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，質(zhì)量濃度比為1:1，該兩對(duì)特異引物的序列分別為: 特異引物MAT1F1:5’-CTT TGA GGT TGA GTT TCG TTC AGC-3，， 特異引物MATlRl:5’-CAT TTG AAA CCG ATA GAA GCG GG-3，， 特異引物MAT2F1:5’-CCT CGC TGT ATT ATG GCA GTT TCT-3，， 特異引物MAT2R1:5’-CCC CAC AAA AAG ACC GTC CCG GA_3，; (4)凝膠電泳檢測(cè)； PCR產(chǎn)物與1 X PCR上樣緩沖液混合，在加核酸燃料染色的3%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳后用紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，如果擴(kuò)增到兩條核苷酸序列，則稻曲菌有性生殖為同宗配合，如果擴(kuò)增到一條序列，則稻曲菌有性生殖為異宗配合。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述采用稻曲球厚垣孢子懸浮液分離方法分離稻曲菌，稻曲菌菌株接種到PSA固體培養(yǎng)基上，25-30° C培養(yǎng)12-16天;挑取稻曲菌菌絲塊于PS液體培養(yǎng)基中，置于23-30° C震蕩培養(yǎng)5-8天，過(guò)濾收集菌絲于50mlEP管中，-75—65° C保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述采用稻曲球厚垣孢子懸浮液分離方法分離稻曲菌，稻曲菌菌株接種到PSA固體培養(yǎng)基上，28° C培養(yǎng)14天;挑取稻曲菌菌絲塊于PS液體培養(yǎng)基中，置于28° C震蕩培養(yǎng)7天，過(guò)濾收集菌絲于50mlEP管中，-70° C保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述PCR反應(yīng)體系為:基因組DNA 2口1^，含]\%2+的10\?0? buffer IpL, dNTP 5yL，特異引物MAT1F1/MAT1R1、MAT2F1/MAT2R1 各I yL，Taq聚合酶 0.5pL,無(wú)菌dd H20 37.5yL，反應(yīng)終體積為50yL。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述基因組DNA的質(zhì)量濃度為10 pM,dNTP 的質(zhì)量濃度為2.5mM，Taq聚合酶質(zhì)量濃度為 5U/yL。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述特異引物MAT1F1/MAT1R1或MAT2F1/MAT2R1質(zhì)量濃度為0.1-0.25μΜ。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述特異引物MAT1F1/MAT1R1或MAT2F1/MAT2R1質(zhì)量濃度為0.2μΜ。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?93-96° C預(yù)變性l-3min ； 93-96° C變性20_60s，45 V-60 V退火45s-90s，70?75°C 延伸30-60s，30-40個(gè)循環(huán)；最后72° C延伸8min，4° C保存。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種多重PCR快速檢測(cè)稻曲菌交配型基因的方法，其特征在于:所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95° C預(yù)變性2min; 95° C變性35s，56° C退火Imin，72° C延伸 40s，35個(gè)循環(huán);最后72° C延伸8min，4° C保存。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106048046SQ201610552647
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月14日
【發(fā)明人】伏榮桃, 盧代華, 王劍, 龔學(xué)書(shū), 陳誠(chéng), 鄭愛(ài)萍, 林乾
【申請(qǐng)人】四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所