專利名稱：一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中藥注射液源自中醫(yī)藥經(jīng)典驗(yàn)方，對(duì)治療疾病起著重要的作用，并在臨床上廣泛應(yīng)用，但是，中藥注射液導(dǎo)致的過(guò)敏反應(yīng)卻制約了其進(jìn)一步的發(fā)展。產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的原因有中藥注射液成分復(fù)雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、含有大分子物質(zhì)如植物蛋白、鞣酸等以及大量半抗原成分。其中，大分子物質(zhì)可以通過(guò)超濾以及分子篩等方法加以去除，但是中藥注射液中的小分子半抗原除了少數(shù)已知的，如小檗堿、茶堿、丹參酮等，還有很多未知的半抗原成分，目前還沒(méi)有一種確切的方法加以分離和鑒定。半抗原又叫做不完全抗原，在免疫學(xué)中指只有抗原性而無(wú)免疫原性的物質(zhì)。半抗原分子量小，只有與體內(nèi)的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等結(jié)合后才能形成完全抗原，常規(guī)分離抗原的方法難以分離半抗原。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法， 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供谷胱甘肽在分離中藥注射液中半抗原的應(yīng)用。技術(shù)方案對(duì)于利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法，本發(fā)明是利用谷胱甘肽分離中藥注射液中的半抗原，采用固定有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的層析柱來(lái)分離獲得能與谷胱甘肽結(jié)合的半抗原成分。本發(fā)明利用半抗原的親電子基團(tuán)易同蛋白質(zhì)的親核基團(tuán)反應(yīng)這一特性，使半抗原與谷胱甘肽反應(yīng)生成以共價(jià)鍵結(jié)合的復(fù)合物，再用能與谷胱甘肽特異性結(jié)合的GST將上述復(fù)合物從混合液中分離出來(lái)。值得注意的是，本發(fā)明所述谷胱甘肽包括但不限于谷胱甘肽，所述谷胱甘肽還包括含有谷胱甘肽的多肽以及谷胱甘肽類似物，所述谷胱甘肽能和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶發(fā)生酶-底物結(jié)合反應(yīng)。另外，本發(fā)明所述的混合液是包含若干種已知或未知半抗原以及其他成分的混合液。本發(fā)明所述半抗原是可與谷胱甘肽形成共價(jià)復(fù)合物的半抗原。利用本發(fā)明所述方法分離混合液中的半抗原都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明主要包括如下步驟(I)制備固定有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的親和層析柱；(2)將混合液與還原型谷胱甘肽溶液充分混勻，反復(fù)通過(guò)步驟(I)制得的親和層析柱，用高濃度還原型谷胱甘肽溶液沖洗親和層析柱洗，洗脫結(jié)合到谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶上的谷胱甘肽-半抗原復(fù)合物；(3)去除步驟(2)洗脫后的溶液中多余的谷胱甘肽，利用高效液相色譜法分離獲得谷胱甘肽-半抗原復(fù)合物的各個(gè)單一組分。
所述步驟⑴中固定有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的親和層析柱，其制備方法是PCR擴(kuò)增 PGEX4T1質(zhì)粒中的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶DNA序列，將其連接到pET28a(+)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌，繼續(xù)培養(yǎng)并篩選出能正確表達(dá)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的陽(yáng)性克隆，繼續(xù)培養(yǎng)使細(xì)菌大量繁殖，收集細(xì)菌，用超聲破碎細(xì)菌，離心后取上清液通過(guò)鎳層析柱，將谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶固定在層析柱上。所述谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶是末端含有6個(gè)組氨酸的重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明是利用6個(gè)組氨酸能夠與鎳離子螯合的特性，將末端含有6個(gè)組氨酸的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶固定在層析柱上。添加組氨酸標(biāo)簽對(duì)于重組蛋白質(zhì)的分離與純化十分有利，細(xì)菌自身蛋白質(zhì)不包含連續(xù)的6個(gè)組氨酸序列，而該序列可以同鎳離子形成牢固的螯合物，從而將重組表達(dá)的蛋白質(zhì)固定在親和層析柱上，這種結(jié)合可以被高濃度的咪唑破壞，方便將重組表達(dá)的蛋白質(zhì)解離下來(lái)，而達(dá)到分離和純化的目的。該方法步驟簡(jiǎn)單，可獲得大量重組蛋白，并且純度高，雜蛋白少。有益效果本發(fā)明的一種利用谷胱甘肽分離中藥注射液中半抗原的方法可以迅速獲得大量潛在的半抗原，方法簡(jiǎn)單易行，耗時(shí)短，可以有效節(jié)省時(shí)間和財(cái)力，還可為后續(xù)半抗原分析提供有力的技術(shù)支持。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例II.制備固定有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的親和層析柱，利用重組谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的 His-Tag連接到鎳層析柱，制備成可以和谷胱甘肽進(jìn)行特異性結(jié)合的GST親和層析柱，具體步驟如下(I)按照商業(yè)化試劑盒(B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒，北京博大泰克)的方法收集pGEX4Tl質(zhì)粒，用PCR方法擴(kuò)增質(zhì)粒中谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶DNA序列；正向引物序列為GGAGGATCCGTATTCATGTCCCCTATACTAGGT，反向引物序列為GGACTCGAGAACCAGATCCGAITTTGGAGGATGGT。PCR 反應(yīng)體系如下5· 0μ I 的 10XPCR 緩沖液，5. O μ I 25mMMgCl2,4. O μ I dNTP (IOmM)混合物，I. 0μ I pGEX4Tl質(zhì)粒，2. O μ I正、反向引物混合物，37. 5 μ I ddH20和
O.5 μ ITaq酶(5單位/ μ I)。梯度PCR的反應(yīng)條件為94°C，5分鐘；94°C 30秒，63°C 30秒， 720C 45秒循環(huán)4次；退火溫度每降低1°C再循環(huán)4次，94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 45秒，循環(huán)20次；72°C，10分鐘，4°C保溫。I %的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，收集堿基在750bp 左右的條帶，按照膠回收試劑盒(北京博大泰克)的方法回收PCR產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶 BamHI 和 Xho I 進(jìn)行酶切反應(yīng)，條件為7. 4 μ I ddH20,1.6μ I IOXK 緩沖液，1μ I BamH I， I μ I Xho I和5 μ I PCR膠回收產(chǎn)物，混合均勻后37°C反應(yīng)2小時(shí)。(2)按照試劑盒的方法收集pET28a(+)質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I進(jìn)行酶切，條件為7. 4μ I ddH20,1.6μ I IOXK 緩沖液，1μ I BamH Ι，1μ1 Xho I 和 5μ1 質(zhì)粒，混合均勻后37°C反應(yīng)2小時(shí)。(3)將步驟⑴和步驟⑵的酶切產(chǎn)物分別用I %的瓊脂糖凝膠電泳分離，收集目的條帶。膠回收產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，條件為酶切后的PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)質(zhì)粒片段各 5μ1，1.6μ1 Τ4連接酶緩沖液，3. 4μ I ddH20和Ιμ Τ4連接酶，混合均勻，4°C連接過(guò)夜。
(4)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒取上述連接產(chǎn)物8 μ I與100 μ I的Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)菌混合，置于冰水浴中30分鐘，然后放入42°C水浴中90秒，迅速取出置于冰上冷卻5分鐘，加入800 μ I LB 培養(yǎng)基(每升中含IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，用IM NaOH調(diào)節(jié)pH 7. 0,121°C 滅菌15分鐘)，以200rpm的速度于37°C振搖45分鐘。10，OOOXg離心I分鐘，棄去上清， 細(xì)菌沉淀用200μ I LB培養(yǎng)基重懸，用接種棒將菌液均勻涂布在含有卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基(每升中含IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，用IM NaOH調(diào)節(jié)pH 7.0，15g瓊脂， 121°C滅菌15分鐘，在凝固前加入終濃度為30mg/l的卡那霉素，混合均勻后鋪在培養(yǎng)皿中) 上，37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)。(5)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在有肉眼可見(jiàn)的菌斑出現(xiàn)時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。用接種針挑取單個(gè)克隆，接入到4ml含30mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm振搖培養(yǎng)過(guò)夜。收集部分菌液進(jìn)行PCR及酶切鑒定。合格的陽(yáng)性克隆再進(jìn)行DNA序列測(cè)定，選出能正確表達(dá)蛋白質(zhì)的陽(yáng)性克隆。(6)提取上一步中序列正確的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)菌中。鋪瓊脂板后培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，部分用于保種，其余以200rpm的速度于37°C培養(yǎng)。當(dāng)OD6tltl達(dá)到O. 6-0. 8左右時(shí)，加入 75nM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。收集菌液，10，000 X g離心I分鐘，棄去上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)菌沉淀兩遍，PBS重懸細(xì)菌沉淀。用超聲儀在冰水浴中破碎細(xì)菌，10，OOOXg 離心10分鐘,收集上清。(7)將上清溶液恒速通過(guò)HiTrap Chelating純化柱。按照純化柱說(shuō)明書(shū)用IOml 結(jié)合緩沖液洗滌純化柱，隨后分別用20，40，60，100,300,500mM的咪唑洗滌緩沖液梯度洗脫，收集蛋白質(zhì)溶液。將蛋白質(zhì)組分用G25分離、純化。測(cè)定濃度后分裝、凍干備用。(8)用適量的ddH20溶解谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶，使溶液通過(guò)HiTrap Chelating純化柱，將其固定在柱上備用。2.用蛋白質(zhì)過(guò)濾裝置過(guò)濾混合液，收集濾液，制成凍干粉，每克凍干粉用5 30mlddH20溶解后，加入還原型谷胱甘肽溶液，使其終濃度為100 μ Μ，混勻后于37°C恒溫水浴，反應(yīng)30 60分鐘。反復(fù)通過(guò)固定了谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的純化柱。用PBS沖洗純化柱， 去除未與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的組分。再用IOmM還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液(由50mM Tris-HCl配制，pH 8.0)沖洗親和層析柱，洗脫結(jié)合到谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶上的半抗原復(fù)合物。凍干，備用。3.上一步驟的洗脫液中含有谷胱甘肽-半抗原復(fù)合物及多余的谷胱甘肽，采用高效液相色譜法去除混合物中多余的谷胱甘肽，分離主要的谷胱甘肽-半抗原復(fù)合物。高效液相色譜分析條件流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(41. 7-58-0. 3，v/v/v);流速為lml/min ； 檢測(cè)波長(zhǎng)為29Inm;柱溫是35°C。通過(guò)高效液相的分離方法可以獲得多個(gè)谷胱甘肽-半抗原復(fù)合物純品，用于后續(xù)的質(zhì)譜等鑒定。實(shí)施例2本發(fā)明還可用于中藥注射液中半抗原成分的分離，并可進(jìn)一步用于半抗原的區(qū)分和鑒定。本實(shí)施例的混合液采用雙黃連注射液，其主要成分是金銀花、黃芩、連翹的提取物。制備固定有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的親和層析柱方法如實(shí)施例I所示，然后用蛋白質(zhì)過(guò)濾裝置過(guò)濾雙黃連注射液，收集濾液，制成凍干粉，每克凍干粉用10 20ml ddH20溶解后，加入還原性谷胱甘肽溶液，使其終濃度為100 μ Μ，混勻后于37°C恒溫水浴，反應(yīng)40 50 分鐘。反復(fù)通過(guò)固定了谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的純化柱。用PBS沖洗純化柱，去除未與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶結(jié)合的組分。再用IOmM還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液(由50mM Tris-HCl配制， PH 8.0)沖洗親和層析柱，洗脫結(jié)合到谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶上的半抗原復(fù)合物。凍干，備用。用高效液相色譜法去除洗脫液中多余的谷胱甘肽，分離主要的谷胱甘肽-半抗原復(fù)合物。高效液相色譜分析條件流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(41. 7-58-0. 3，v/v/v);流速為lml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為291nm ;柱溫是35°C。通過(guò)高效液相的分離方法可以制備多個(gè)谷胱甘肽-半抗原復(fù)合物純品，用于后續(xù)的質(zhì)譜等鑒定。試驗(yàn)例I雙黃連注射液中的主要活性成分是金銀花、黃芩、連翹，目前已知該方劑中存在綠原酸，綠原酸起到抗菌消炎、保肝利膽的作用，同時(shí)也是具有致敏作用的半抗原。本試驗(yàn)例通過(guò)小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明所述方法可以有效分離雙黃連注射液中的致敏成分，包括綠原酸。按照實(shí)施例2的方法，將雙黃連注射液的凍干粉溶解于還原型谷胱甘肽溶液中， 連續(xù)通過(guò)固定有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的親和層析柱，將過(guò)柱前、后的溶液分別制成凍干粉。將上述注射液凍干粉溶解在DMSO中，配制成5%的溶液，綠原酸配制成O. 2%的 DMSO溶液，分別涂布于Balb/c小鼠的耳朵上，25 μ I/耳，連續(xù)涂布3天。以O(shè). 05%二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)為陽(yáng)性對(duì)照。在第6天將小鼠處死,分別取小鼠引流淋巴結(jié)，制備淋巴結(jié)細(xì)胞懸液，二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)I小時(shí)，加入5mg/ml MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，1，000 Xg離心5分鐘，棄上清，加入DMSO 100 μ I/孔，使紫色結(jié)晶溶解。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570nm測(cè)定吸光度(A)值。與溶劑對(duì)照組小鼠進(jìn)行比較，計(jì)算刺激指數(shù)，刺激指數(shù)=A( ^^fe)/A(_WM)。刺激指數(shù)大于等于3的化合物有致敏性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下表所示。表I.局部淋巴結(jié)試驗(yàn)結(jié)果
受試物淋巴結(jié)重量 (mg)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù) (106/ml)吸光度(A)值刺激指數(shù)空白對(duì)照6.3 ±1.95.2±1.10.49 士 0.05—DMSO6.7 士 1.85·5 士 1.20.55 士 0.07—0.2%綠原酸14.5 士 2.413.1 士 2.21.76 士 0.193.25%過(guò)柱前成分16.9 士 2.914.7 士 2.71.92 士 0.243.55%過(guò)柱后成分10.7 士 1.89.1 ±1.40.83 士 0.101.50.05% DNFB20.1 士 2.617.9 士 2.62.28 士 0.214.1由表I可見(jiàn)，DNFB這種已知的半抗原作為陽(yáng)性對(duì)照可以刺激引流淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞增殖，刺激指數(shù)達(dá)到4. I。通過(guò)將綠原酸與DMSO比較，綠原酸可引起淋巴細(xì)胞增殖，吸光度增加，刺激指數(shù)為3. 2，表明綠原酸具有致敏性。而比較通過(guò)重組谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶層析柱前、后的雙黃連注射液的成分，發(fā)現(xiàn)過(guò)柱后的雙黃連注射液很少引起淋巴細(xì)胞增值，刺激指數(shù)小于3，注射液通過(guò)重組谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶層析柱后可以顯著降低該注射液的致敏性，顯示大部分致敏物質(zhì)被分離并去除。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法，其特征在于包括如下步驟(1)制備固定有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的親和層析柱；(2)將混合液與還原型谷胱甘肽溶液充分混勻，反復(fù)通過(guò)步驟(I)制得的親和層析柱， 用高濃度還原型谷胱甘肽溶液沖洗親和層析柱洗，洗脫結(jié)合到谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶上的谷胱甘肽-半抗原復(fù)合物；(3)去除步驟(2)洗脫后的溶液中多余的谷胱甘肽，利用高效液相色譜法分離獲得谷胱甘肽-半抗原復(fù)合物的各個(gè)單一組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法，其特征在于所述谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶是末端含有6個(gè)組氨酸的重組蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法，其特征在于，所述步驟(I)中固定有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的親和層析柱，其制備方法是PCR擴(kuò)增 PGEX4T1質(zhì)粒中的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶DNA序列，將其連接到pET28a ( + )質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌，繼續(xù)培養(yǎng)并篩選出能正確表達(dá)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)一定時(shí)間后破碎細(xì)胞，離心后取上清液通過(guò)鎳離子親和層析柱，將谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶固定在層析柱上。
4.谷胱甘肽在分離中藥注射液中半抗原的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用谷胱甘肽分離混合液中半抗原的方法及應(yīng)用，包括如下步驟制備固定有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的親和層析柱，向混合液中加入還原型谷胱甘肽溶液，混勻后恒溫水浴，反復(fù)通過(guò)親和層析柱，再用高濃度谷胱甘肽溶液沖洗親和層析柱以洗脫結(jié)合到谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶上的半抗原復(fù)合物；分離步驟洗脫液中多余的谷胱甘肽，利用高效液相色譜法獲得谷胱甘肽-半抗原復(fù)合物的各個(gè)單一組分。用本發(fā)明的方法可以迅速分離得到大量潛在的半抗原成分，方法簡(jiǎn)單易行，耗時(shí)短，可以有效節(jié)省時(shí)間和財(cái)力，還可為后續(xù)半抗原分析提供有力的技術(shù)支持。
文檔編號(hào)B01D15/10GK102600639SQ201210003620
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者易宏偉 申請(qǐng)人:東南大學(xué)