專利名稱：一種蛋白水解度的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白水解度的測定方法，尤其是涉及一種乳中游離氨基氮的定量檢測方法。
背景技術(shù)：
牛乳是優(yōu)秀的營養(yǎng)食品，蛋白含量為3.0％～3.5％，其中酪蛋白(CN)含量較高，約占總蛋白的80％。酪蛋白主要有四種即αs1-、αs2-、β-、κ-CN，牛乳中酪蛋白與乳清蛋白的含量比為80∶20，而人乳中酪蛋白與乳清蛋白的含量比為60∶40。由于其與人乳中的蛋白組成不同，有很多人飲用了牛乳后會產(chǎn)生過敏現(xiàn)象。許多研究表明牛乳中αs-酪蛋白、β-乳球蛋白(β-LG)是最主要的過敏原，其中約82％的牛乳過敏人都對β-LG過敏，尤其是嬰兒。
為了解決牛乳過敏的問題，要對牛乳蛋白進行改性研究。目前，研究熱點集中在通過酶水解牛乳蛋白來降低或消除過敏原。因此開發(fā)一種準確可行的蛋白水解度測定方法具有深遠的意義。
目前檢測蛋白水解度的方法有很多，如鄰苯二甲醛(OPA)法、茚三酮比色法、甲醛滴定法和三硝基苯磺酸(TNBS)方法等。但每種方法的適用性不同，有的顯色液不穩(wěn)定，且測定不同的蛋白需要不同的顯色液，稍有不慎即會使結(jié)果出現(xiàn)偏差；有的實驗步驟操作繁雜；有的實驗試劑用量太大。因此研究一種適合于乳蛋白水解度測定，既穩(wěn)定準確又簡單快速的方法非常有意義。本發(fā)明人研發(fā)了一種新的測定蛋白水解度的方法，可以彌補現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足。

發(fā)明內(nèi)容
蛋白水解度(Degree of Hydrolysis，DH)的定義是指蛋白肽鍵裂解的百分比，通過水解后增加的游離氨基氮占總蛋白的百分比來表示。本方法適用于乳中游離氨基氮的檢測和牛乳蛋白水解度的檢測，也可以檢測牛乳中摻入的外源水解蛋白，作為摻假的監(jiān)測手段。其中蛋白水解度測定中的總氮測定采用IDF20-22001的乳中氮含量的測定方法。
本方法是通過測定水解前后乳中游離氨基氮的含量，來計算蛋白水解度的一種方法。在水解牛乳樣中加入三氯乙酸(TCA)溶液使蛋白沉淀，然后過濾掉沉淀的蛋白，通過水解后在三氯乙酸(TCA)溶液中增加的游離氨基酸與TNBS反應的顏色變化來測定蛋白水解度。以甘氨酸為標準物質(zhì)，在420nm處有吸收峰。本方法結(jié)果重現(xiàn)性好，檢驗耗時短，試劑用量少，可操作性高，只用分光光度計即可滿足測定需求。
具體方法如下取乳樣，加入2倍乳樣體積的0.7N-0.8N的三氯乙酸，室溫下放置20min-30min，過濾取上清液，加入10倍上清液體積的0.095M-0.15M硼酸鈉，再加入4倍上清液體積的4.95mM-5.05mM TNBS，室溫下暗處放置20min-30min，加入4倍上清液體積的2M混合終止劑，所述混合終止劑為包含17.95mM/L-18.05mM/L亞硫酸鈉的1.95M/L-2.05M/L磷酸二氫鈉，混勻，在420nm處測定吸光值。
所述硼酸鈉的pH為9.0-9.4。
所述TNBS和混合終止液現(xiàn)用現(xiàn)配。
所述測定方法還包括以不同濃度的甘氨酸為標準物質(zhì)繪制標準曲線，通過標準曲線計算樣品中游離氨基氮的含量。
所述方法測得的乳樣吸光值在標準曲線濃度范圍之內(nèi)。
根據(jù)公式1和公式2分別計算游離氨基氮的含量和蛋白水解度。游離氨基氮的含量按下式計算C＝B□A----------------------------1其中C樣品中游離氨基酸的含量，mM/L，B根據(jù)濾液的吸光度，通過標準曲線計算出的游離氨基氮的濃度，mM/L，A稀釋因子。
蛋白水解度按下式計算 其中DH％蛋白肽鍵裂解的百分比，C1水解前樣品中游離氨基氮的含量，mM/L，C2水解后樣品中游離氨基氮的含量，mM/L，Pro樣品中蛋白質(zhì)的濃度，g/100mL，htot為每克蛋白質(zhì)的肽鍵的豪摩爾數(shù)，htot對于某一特定蛋白質(zhì)來講是一個常數(shù)(乳清蛋白htot＝8.8(mM/g))。


附圖1甘氨酸標準曲線。
具體實施例方式實施例1水解酪蛋白中的游離氨基氮的測定適當稀釋樣品。然后取稀釋后的樣品2mL，加入4mL 0.7N的TCA，20℃放置20min，過濾取上清液待測。取上清液0.2mL加入2mL 0.095M硼酸鈉，0.8mL 4.95mM TNBS，20℃暗處放置30min，加入0.8mL 2M混合終止劑(所述混合終止劑為包含18mM/L亞硫酸鈉的2M/L磷酸二氫鈉)，混勻，同時用未水解的牛奶作對照，用蒸餾水做空白試驗，在分光光度計上，用1cm直徑吸收池，以空白為參比，于波長420nm測其吸光度，顏色可穩(wěn)定近1h。分別移取不同濃度的甘氨酸標準溶液2mL于不同的試管中，加入4mL 0.75N的TCA，后續(xù)處理同樣品分析。然后以吸光度與濃度繪制標準曲線。通過標準曲線求出樣品的濃度。同一試樣做兩次平行，取平均值；重復測定3次。根據(jù)公式1計算游離氨基氮的含量，結(jié)果見表1。
表1水解酪蛋白水解樣品游離氨基氮的測定結(jié)果單位mM/L

實施例2酶水解乳清蛋白水解度的測定適當稀釋酶水解后的乳清蛋白樣品。然后取稀釋后的樣品2mL，加入4mL 0.8N的TCA，25℃放置30min，過濾取上清液待測。取上清液0.2mL加入2mL 0.15M硼酸鈉，0.8mL 5.05mM TNBS，25℃暗處放置20min，加入0.8mL 2M混合終止劑(所述混合終止劑為包含17.95mM/L亞硫酸鈉的2.05M/L磷酸二氫鈉)，混勻，同時用未水解的牛奶作對照，用蒸餾水做空白試驗，在分光光度計上，用1cm直徑吸收池，以空白為參比，于波長420nm測其吸光度，顏色可穩(wěn)定近1h。分別移取不同濃度的甘氨酸標準溶液2mL于不同的試管中，加入4mL 0.75N的TCA，后續(xù)處理同樣品分析。然后以吸光度與濃度繪制標準曲線。通過標準曲線求出樣品的濃度。同一試樣做兩次平行測定。根據(jù)公式1和公式2分別計算游離氨基氮的含量和蛋白水解度，結(jié)果見表2和表3。
表2酶水解乳清蛋白樣品游離氨基氮及水解度的測定結(jié)果

表3酶水解乳清蛋白樣品水解度的測定結(jié)果的分析表

實施例3水解酪蛋白中的游離氨基氮的測定適當稀釋樣品。然后取稀釋后的樣品2mL，加入4mL 0.75N的TCA，22℃放置20min，過濾取上清液待測。取上清液0.2mL加入2mL 0.1M硼酸鈉，0.8mL 5mMTNBS，22℃暗處放置30min，加入0.8mL 2M混合終止劑(所述混合終止劑為包含18mM/L亞硫酸鈉的2M/L磷酸二氫鈉)，混勻，同時用未水解的牛奶作對照，用蒸餾水做空白試驗，在分光光度計上，用1cm直徑吸收池，以空白為參比，于波長420nm測其吸光度，顏色可穩(wěn)定近1h。分別移取不同濃度的甘氨酸標準溶液2mL于不同的試管中，加入4mL 0.75N的TCA，后續(xù)處理同樣品分析。然后以吸光度與濃度繪制標準曲線。通過標準曲線求出樣品的濃度。同一試樣做兩次平行測定，取平均值；重復測定3次。根據(jù)公式1計算游離氨基氮的含量，結(jié)果見表4。
表4水解酪蛋白水解樣品游離氨基氮的測定結(jié)果單位mM/L

權(quán)利要求
1.一種蛋白水解度的測定方法，其特征在于取乳樣，加入2倍乳樣體積的0.7N-0.8N的三氯乙酸，室溫下放置20min-30min，過濾取上清液，加入10倍上清液體積的0.095M-0.15M硼酸鈉，再加入4倍上清液體積的4.95mM-5.05mM TNBS，室溫下暗處放置20min-30min，加入4倍上清液體積的2M混合終止劑，所述混合終止劑為包含17.95mM/L-18.05mM/L亞硫酸鈉的1.95M/L-2.05M/L磷酸二氫鈉，混勻，在420nm處測定吸光值。
2.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中所述硼酸鈉的pH為9.0-9.4。
3.權(quán)利要求1所述的測定方法，其中所述TNBS和混合終止液現(xiàn)用現(xiàn)配。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的測定方法，其中還包括以不同濃度的甘氨酸為標準物質(zhì)繪制標準曲線，通過標準曲線計算樣品中游離氨基氮的含量。
5.權(quán)利要求4所述的測定方法，乳樣測得的吸光值在標準曲線濃度范圍之內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白水解度的測定方法。本方法是通過測定水解前后乳中游離氨基氮的含量，來計算蛋白水解度的一種方法。在水解牛乳樣中加入三氯乙酸(TCA)溶液使蛋白沉淀，然后過濾掉沉淀的蛋白，通過水解后在三氯乙酸(TCA)溶液中增加的游離氨基酸與TNBS反應的顏色變化來測定蛋白水解度。本方法操作簡便，可省時、增效。
文檔編號G01N21/31GK1987470SQ200610156368
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月31日
發(fā)明者王彩云, 云戰(zhàn)友, 李翠枝 申請人:內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司