專利名稱：用于檢測流感病毒的裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測或定量流感病毒的裝置、用于檢測或定量流感病毒的試劑 盒、用于檢測或定量流感病毒的方法、人類抗A型流感病毒核蛋白抗體和人類抗B型流感病 毒核蛋白抗體。
背景技術：
使用抗原-抗體反應的免疫測量方法被廣泛用于測量樣品中的待測量物，并且已 開發(fā)大量測量方法，例如酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、化學發(fā)光 酶免疫分析法、散射免疫比濁法和使用表面等離子體共振(SPR)的測量方法。最近，從簡便性和速度的觀點來看，免疫層析受到關注，許多基于這種技術的產品 已在市場上出現。免疫層析根據測量原理被分成直流型和側流型；但是，側流型免疫層析在 近年已變成主流。對于側流型免疫層析而言，已報道的裝置包含下列區(qū)域帶有以允許遷移 的方式保持在支持物上的被標記抗體的區(qū)域，被標記抗體是以允許遷移的方式保持在支持 物上的抗體，其與被測量物結合并在其上結合有標記物；以及帶有固定化的與被測量物結 合的抗體的區(qū)域。從古時起，流感就已在世界范圍內周期性重復流行，并且每次都引起大量死亡；但 是，在1931年才檢測到作為病因的病毒并發(fā)現闡明病因的方式。流感的致病性病毒，根據 在病毒內部發(fā)現的可溶性核蛋白(在后文中簡稱NP)的抗原性分成三種類型A型、B型和 丙型。此外，根據病毒表面上存在的兩種包膜糖蛋白，紅細胞凝集素(簡稱HA)和神經氨酸 酶(簡稱NA)將其分成亞型。從1972年起，已使用醚處理后用福爾馬林失活的疫苗用于預防流感。近年中，除 了用于預防的疫苗之外，抗流感藥劑已被發(fā)現并廣泛用作治療藥劑。這些治療藥劑是例如 適用于B型流感病毒的鹽酸金剛烷胺和適用于A型流感病毒和A型的扎那米韋和磷酸奧司 他韋。在選擇這些治療藥劑時，重要的是檢測樣品中的流感病毒并確定感染是否由流感 病毒引起，以及病毒的類型是A型還是B型。此外，A型流感病毒與B型流感病毒相比具有 更強的傳染性并引起更嚴重的癥狀；因此，確定所感染病毒的類型對于早期治療是重要的。常規(guī)情況下，流感病毒的檢測使用抗流感病毒抗體進行。已知的針對流感病毒的 抗體是識別HA區(qū)的抗體、識別NA區(qū)的抗體、識別基質蛋白(例如Ml)的抗體、識別非結構 蛋白(例如NSl)的抗體、特異性識別NP的抗體等。此外，在非專利文獻1和非專利文獻2 中描述的抗體被稱為人類抗A型流感病毒核蛋白抗體。近些時候，已經開發(fā)了用于容易和快速檢測流感病毒的免疫層析裝置[參見專 利文獻1到14]，并且大量產品已經供應市場[例如“ESPLINE Influenza A&B-N，，(由 Fujirebio Inc.制 造)；"QuickVueRapid SP influ，，(由 DS Pharma Biomedical Co. , Ltd.制造)；"POCTEMInfluenza A/B，，(由 Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.禾口 SysmexCorporation 制造)；"Clearview-Influenza A/B，，(由 Sanwa Kagaku Co.Ltd制造)；"Quick S-Influ Α/Β “Seiken""(由 Denka Seiken Co. Ltd 制造)；"Quick Ex-Flu‘、eiken，，，，(由 Denka Seiken Co. Ltd 制造)；"Rapid Testa FLU stick，，(由 Daichi Pure Chemicals Co. Ltd 制造)；"Capilia Flu A ;B，，(由 Alfresa Pharma Corporation 制 造)以及 ‘‘QuickChaser Flu A，B” (由 Mizuho Medy Co. Ltd.制造)]?，F有技術文獻專利文獻專利文獻1 :W0 2005/007697，小冊子專利文獻2 =WO 2005/007698，小冊子專利文獻3 日本實用新型登記號No. 3088698專利文獻4 日本專利申請公開公布號No. (JP-A) 2004-279208(未經審查的出版 的日本專利申請)專利文獻5 JP-A (Kokai) 2004-279158專利文獻6 JP-A (Kokai) 2006-189317專利文獻7 JP-A (Kokai) 2006-194687專利文獻8 JP-A (Kokai) 2006-194688專利文獻9 JP-A (Kokai) 2007-93292專利文獻10 JP-A (Kokai) 2007-33293
專利文獻 11 JP-A (Kokai) 2006-153523專利文獻12 JP-A (Kokai) 2006-67979專利文獻13 JP-A (Kokai) 2000-55918專利文獻14 JP-A (Kokai) 2007-33293非專利文獻非專利文獻1 Journal of General Virology, Vol. 64，p. 697-700(1983)非專利文獻2 =Nature Vol. 453，p. 667-672 (2008)發(fā)明簡述[本發(fā)明待解決的問題]但是，在這些裝置中使用的抗體都是非人類抗體，使得對于應用來說靈敏性不夠， 對重復突變的流感病毒的特異性也不足。因此，需要開發(fā)用于檢測或定量流感病毒的裝置、 用于檢測或定量流感病毒的試劑盒、產生足夠的靈敏性并具有廣泛特異性的用于檢測或定 量流感病毒的方法，以及適合于檢測或定量流感病毒的抗體。[解決問題的手段]為了解決這些問題，本發(fā)明人進行了專門研究，結果發(fā)現，人類抗流感病毒核蛋白 抗體可用于檢測或定量流感病毒的裝置和檢測或定量流感病毒的試劑盒。此外，他們發(fā)現 可以從接種流感疫苗的人類獲取的淋巴細胞中獲得具有高親和力的抗體，因此他們完成了 本發(fā)明。因此，本發(fā)明涉及下列[1]到[37][1] 一種用于檢測或定量樣品中的流感病毒的裝置，所述裝置包含帶有固定化在 支持物上的人類抗流感病毒核蛋白抗體的檢測區(qū)、樣品供應區(qū)和樣品遷移區(qū)；[2] 一種用于檢測或定量樣品中的流感病毒的裝置，所述裝置包含帶有固定化在 支持物上的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)的檢測區(qū)、樣品供應區(qū)和樣品遷移區(qū)，其中從樣品供應區(qū)提供帶有與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體幻結合的標記物的標記抗體，并且其 中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體；[3] 一種用于檢測或定量樣品中的流感病毒的裝置，所述裝置包含帶有固定化在 支持物上的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)的檢測區(qū)、以允許遷移的方式保持在支持物上 的帶有與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體幻結合的標記物的標記抗體的標記試劑區(qū)、樣品供 應區(qū)和樣品遷移區(qū)，其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體；[4] [2]或[3]的裝置，其還包含至少一個選自展開溶液供應區(qū)、過量液體吸收區(qū) 和樣品供應驗證區(qū)的區(qū)域；[5] [1]到[4]任一項的裝置，其中人類抗流感病毒核蛋白抗體是人類抗A型流感 病毒核蛋白抗體；[6] [5]的裝置，其中人類抗A型流感病毒核蛋白抗體是人類抗A型流感病毒核蛋 白單克隆抗體，其與A型流感病毒核蛋白特異性反應但是不與B型流感病毒核蛋白反應；[7] [6]的裝置，其中人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基 酸序列包含SEQ ID NO :8到13任一個的氨基酸序列，人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗 體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO 22到27任一個的氨基酸序列；[8] [1]到[4]任一項的裝置，其中人類抗流感病毒核蛋白抗體是人類抗B型流感 病毒核蛋白抗體；[9] [8]的裝置，其中人類抗B型流感病毒核蛋白抗體是人類抗B型流感病毒核蛋 白單克隆抗體，其與B型流感病毒核蛋白特異性反應但是不與A型流感病毒核蛋白反應；[10] [9]的裝置，其中人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨 基酸序列包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的輕鏈 可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ IDNO 28的氨基酸序列；[11] 一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含有固定在載體上的人類抗流 感病毒核蛋白抗體的固相；[12] 一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含有固定在載體上的抗流感病 毒核蛋白抗體(抗體1)的固相和含有抗流感病毒核蛋白抗體(抗體幻的試劑，并且其中 抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體；[13] 一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含固相和含有標記抗體的試 劑，所述固相中抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)固定在載體上，所述標記抗體中的標記物 與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體幻結合，并且其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗 流感病毒核蛋白抗體；[14] 一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含固相和含有標記的抗原類似 物的試劑，所述固相中人類抗流感病毒核蛋白抗體固定在載體上，所述標記的抗原類似物 中的標記物與流感病毒核蛋白抗原類似物結合；[15] 一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含固相和含有標記抗體的試 劑，所述固相中流感病毒核蛋白抗原類似物固定在載體上，所述標記抗體中標記物與人類 抗流感病毒核蛋白抗體結合；[16] [11]到[15]任一項的試劑盒，其中人類抗流感病毒核蛋白抗體是人類抗A型 流感病毒核蛋白抗體；
[17] [16]的試劑盒，其中人類抗A型流感病毒核蛋白抗體是人類抗A型流感病毒 核蛋白單克隆抗體，其與A型流感病毒核蛋白特異性反應但是不與B型流感病毒核蛋白反 應；[18] [17]的試劑盒，其中人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的 氨基酸序列包含SEQ ID NO :8到13任一個的氨基酸序列，人類抗A型流感病毒核蛋白單克 隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO 22到27任一個的氨基酸序列；[19] [11]到[15]任一項的試劑盒，其中人類抗流感病毒核蛋白抗體是人類抗B型 流感病毒核蛋白抗體；[20] [19]的試劑盒，其中人類抗B型流感病毒核蛋白抗體是人類抗B型流感病毒 核蛋白單克隆抗體，其與B型流感病毒核蛋白特異性反應但是不與A型流感病毒核蛋白反 應；[21] [20]的試劑盒，其中人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的 氨基酸序列包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的輕 鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列；[22] 一種用于檢測或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步驟(1)將樣品與固定在載體上的人類抗流感病毒核蛋白抗體反應；以及(2)測量在步驟(1)中產生的物理變化；[23] 一種用于檢測或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步驟(1)將樣品與固定在載體上的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)反應，以在載體上 形成抗體1/流感病毒核蛋白復合物；(2)將步驟(1)中在載體上形成的復合物與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體幻進行 反應；以及(3)測量在步驟O)中產生的物理變化；其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體；[24] [22]或[23]的方法，其中物理變化是濁度變化或質量變化；[25] 一種用于檢測或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步驟(1)將樣品與固定在載體上的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)反應，以在載體上 形成抗體1/流感病毒核蛋白復合物；(2)將步驟(1)中在載體上形成的復合物與標記抗體(標記的抗體2)進行反應， 所述標記的抗體的標記與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體幻結合以在載體上形成抗體1/流 感病毒核蛋白/標記的抗體2復合物；(3)在步驟(2)后清洗載體以除去未與載體結合的物質；以及(4)測量步驟C3)后載體上的抗體1/流感病毒核蛋白/標記的抗體2復合物中的 標記物；其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體；[26] 一種用于檢測或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步驟(1)將樣品與標記抗體(標記的抗體2、反應，所述標記抗體中標記物與抗流感病 毒核蛋白抗體(抗體2、結合，以形成標記的抗體2/流感病毒核蛋白復合物；(2)將步驟(1)中形成的復合物與固定在載體上的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)反應，以在載體上形成抗體1/流感病毒核蛋白/標記的抗體2復合物；(3)在步驟(2)后清洗載體以除去未與載體結合的物質；以及(4)測量步驟C3)后載體上的抗體1/流感病毒核蛋白/標記的抗體2復合物中的 標記物；其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體；[27] 一種用于檢測或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步驟(1)在同時存在抗原類似物的情況下將樣品與固定在載體上的人類抗流感病毒核 蛋白抗體反應，以在載體上形成人類抗流感病毒核蛋白抗體/流感病毒核蛋白復合物和人 類抗流感病毒核蛋白抗體/標記的抗原類似物復合物，所述標記的抗原類似物中標記物與 流感病毒核蛋白抗原類似物結合；(2)在步驟(1)后清洗載體以除去未與載體結合的物質；以及(3)在步驟( 后測量載體上的復合物中的標記物；[28] 一種用于檢測或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步驟(1)在同時存在標記抗體的情況下將樣品與固定在載體上的流感病毒核蛋白抗原 類似物反應，以在載體上形成流感病毒核蛋白抗原類似物/標記抗體復合物，所述標記抗 體中標記物與人類抗流感病毒核蛋白抗體結合，；(2)在步驟(1)后清洗載體以除去未與載體結合的物質；以及(3)在步驟( 后測量載體上的復合物中的標記物；[29] [22]到[28]任一項的方法，其中人類抗流感病毒核蛋白抗體是人類抗A型流 感病毒核蛋白抗體；[30] [29]的方法，其中人類抗A型流感病毒核蛋白抗體是人類抗A型流感病毒 核蛋白單克隆抗體，其與A型流感病毒核蛋白特異性反應但是不與B型流感病毒核蛋白反 應；[31] [30]的方法，其中人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨 基酸序列包含SEQ ID NO :8到13任一個的氨基酸序列，人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆 抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO 22到27任一個的氨基酸序列；[32] [22]到[28]任一項的方法，其中人類抗流感病毒核蛋白抗體是人類抗B型流 感病毒核蛋白抗體；[33] [32]的方法，其中人類抗B型流感病毒核蛋白抗體是人類抗B型流感病毒 核蛋白單克隆抗體，其與B型流感病毒核蛋白特異性反應但是不與A型流感病毒核蛋白反 應；[34] [33]的方法，其中人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨 基酸序列包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的輕鏈 可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQID NO 28的氨基酸序列；[35] 一種人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體，其與A型流感病毒核蛋白特異 性反應但是不與B型流感病毒核蛋白反應，其中重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO 8到13任一個的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO 22到27任一個的 氨基酸序列；[36] 一種人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體，其與B型流感病毒核蛋白特異性反應但是不與A型流感病毒核蛋白反應；以及[37] 一種人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體，其與B型流感病毒核蛋白特異 性反應但是不與A型流感病毒核蛋白反應，其中重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO :28的氨基酸序列。本發(fā)明的效果本發(fā)明提供了用于檢測或定量流感病毒的裝置、用于檢測或定量流感病毒的試劑 盒、高度靈敏并具有廣泛特異性的檢測或定量流感病毒的方法，以及適用于檢測或定量流 感病毒的抗體。附圖簡述

圖1顯示了本發(fā)明的裝置的反應(免疫層析反應)模式。(a)樣品供應區(qū)；(b)標 記試劑區(qū)；(c)檢測區(qū)；(d)樣品遷移區(qū)；(e)展開溶液供應區(qū)；(f)樣品供應驗證區(qū)；以及 (g)過量液體吸收區(qū)。(1)顯示了本發(fā)明的裝置的反應模式，其包含樣品供應區(qū)、標記試劑 區(qū)、樣品遷移區(qū)和檢測區(qū)。(2)顯示了本發(fā)明的裝置的反應模式，其中(1)的樣品供應區(qū)也 起到標記試劑區(qū)的作用。(3)顯示了本發(fā)明的裝置的反應模式，其中(1)還包含展開溶液供 應區(qū)、樣品供應驗證區(qū)和過量液體吸收區(qū)。圖2-a顯示了本發(fā)明的使用人類抗A型流感病毒核蛋白抗體的裝置(實施例1的 裝置)的免疫層析圖。圖2-a顯示了使用各種不同的用于檢測區(qū)(在圖中標為“固相”)的 抗體和用于標記(在圖中標為“標記物”)的抗體的組合的裝置的免疫層析圖。圖2-b顯示了本發(fā)明的使用人類抗A型流感病毒核蛋白抗體的裝置(實施例1的 裝置)的免疫層析圖。圖2-b顯示了使用23G268作為用于檢測區(qū)(在圖中標為“固相”) 的抗體和23G285作為用于標記(在圖中標為“標記物”)的抗體的裝置的免疫層析圖。圖3顯示了本發(fā)明的使用人類抗B型流感病毒核蛋白抗體的裝置(實施例1的裝 置)的免疫層析圖。圖4_a顯示了在本發(fā)明的人類抗流感病毒核蛋白抗體的生產中使用的抗體Y鏈 表達載體和抗體λ鏈表達載體。圖4-a顯示了用于表達抗體重鏈的載體。圖4_b顯示了在本發(fā)明的人類抗流感病毒核蛋白抗體的生產中使用的抗體Y鏈 表達載體和抗體λ鏈表達載體。圖4-b顯示了用于表達抗體輕鏈的載體1。圖4-C顯示了在本發(fā)明的人類抗流感病毒核蛋白抗體的生產中使用的抗體Y鏈 表達載體和抗體λ鏈表達載體。圖4-c顯示了用于表達抗體輕鏈的載體2。圖5-a顯示了本發(fā)明的人類抗A型流感病毒核蛋白抗體對流感病毒核蛋白抗原的 競爭性抑制分析(特異性結合分析)的結果。圖5_b顯示了本發(fā)明的人類抗B型流感病毒核蛋白抗體對流感病毒核蛋白抗原的 競爭性抑制分析(特異性結合分析)的結果。圖6顯示了本發(fā)明的人類抗流感病毒核蛋白抗體的特異性。圖7顯示了本發(fā)明的人類抗A型流感病毒核蛋白抗體的組合與靈敏性以及特異性 之間的關系。圖8顯示了本發(fā)明的人類抗B型流感病毒核蛋白抗體和可商購的小鼠抗B型流感 病毒抗體與靈敏性以及特異性之間的關系。圖9-a是傳感圖，顯示了可商購的小鼠抗A型流感病毒核蛋白抗體M322211與流感病毒的結合能力。圖9-b是傳感圖，顯示了本發(fā)明的人類抗A型流感病毒核蛋白抗體23G272與流感 病毒的結合能力。圖9-c顯示了每種本發(fā)明的抗體結合的流感病毒的量。圖10顯示了每種本發(fā)明的抗A型流感病毒核蛋白抗體的抗原結合能力。圖11-a顯示了人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G268的H鏈的編碼DNA(SEQ ID NO :1)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、 2和3的DNA序列。圖11-b顯示了人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G268的L鏈的編碼DNA(SEQ ID NO 15)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、2和3的DNA序列。圖11-c顯示了對應于人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G268的H鏈的氨基酸序列 (SEQ ID NO :8)。下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖11-d顯示了對應于人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G268的L鏈的氨基酸序列 (SEQ ID N0:22)。下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖12-a顯示了人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G272的H鏈的編碼DNA(SEQ ID NO :2)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、 2和3的DNA序列。圖12-b顯示了人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G272的L鏈的編碼DNA(SEQ ID NO 16)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、2和3的DNA序列。圖12-C顯示了對應于人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G272的H鏈的氨基酸序列 (SEQ ID NO :9)。下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖12-d顯示了對應于人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G272的L鏈的氨基酸序列 (SEQ ID N0:23)。下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖13-a顯示了人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G285的H鏈的編碼DNA(SEQ ID NO :3)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、 2和3的DNA序列。圖13-b顯示了人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G285的L鏈的編碼DNA(SEQ ID NO 17)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、2和3的DNA序列。圖13-c顯示了對應于人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G285的H鏈的氨基酸序列 (SEQ ID N0:10)。下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖13-d顯示了對應于人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G285的L鏈的氨基酸序列 (SEQ ID NO 24) 0下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖14-a顯示了人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G312的H鏈的編碼DNA(SEQ ID NO 4)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、 2和3的DNA序列。圖14-b顯示了人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G312的L鏈的編碼DNA(SEQ IDNO 18)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、2和3的DNA序列。圖14-c顯示了對應于人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G312的H鏈的氨基酸序列 (SEQ ID N0:11)。下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖14-d顯示了對應于人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G312的L鏈的氨基酸序列 (SEQ ID NO 25) 0下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖15-a顯示了人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G447的H鏈的編碼DNA(SEQ ID NO :5)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、 2和3的DNA序列。圖15-b顯示了人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G447的L鏈的編碼DNA(SEQ ID NO 19)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、2和3的DNA序列。圖15-c顯示了對應于人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G447的H鏈的氨基酸序列 (SEQ ID N0:12)。下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖15-d顯示了對應于人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G447的L鏈的氨基酸序列 (SEQ ID NO 26) 0下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖16-a顯示了人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G494的H鏈的編碼DNA(SEQ ID NO :6)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、 2和3的DNA序列。圖16-b顯示了人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G494的L鏈的編碼DNA(SEQ ID NO 20)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、2和3的DNA序列。圖16-c顯示了對應于人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G494的H鏈的氨基酸序列 (SEQ ID N0:13)。下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖16-d顯示了對應于人類抗A型流感病毒蛋白抗體23G494的L鏈的氨基酸序列 (SEQ ID N0:27)。下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖17-a顯示了人類抗B型流感病毒蛋白抗體23G327的H鏈的編碼DNA(SEQ ID NO :7)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、 2和3的DNA序列。圖17-b顯示了人類抗B型流感病毒蛋白抗體23G327的L鏈的編碼DNA(SEQ ID NO 21)。下劃線部分標出了對應于框架1、2和3的DNA序列，加框部分標出了對應于CDR 1、2和3的DNA序列。圖17-c顯示了對應于人類抗B型流感病毒蛋白抗體23G327的H鏈的氨基酸序列 (SEQ ID N0:14)。下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。圖17-d顯示了對應于人類抗B型流感病毒蛋白抗體23G327的L鏈的氨基酸序列 (SEQ ID NO 28) 0下劃線、雙下劃線和波形線分別標出了 CDR 1、2和3。執(zhí),行本發(fā)明的方式[用于檢測或定量流感病毒的裝置]本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的裝置是能夠用于檢測或定量流感病毒的裝
13置，具體來說，它們是適合于免疫層析等的裝置。本發(fā)明的裝置可以是直通型或側流型的。本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的裝置的實施方案，包括包含檢測區(qū)、樣品供 應區(qū)和樣品遷移區(qū)的裝置，其中檢測區(qū)中的支持物在其上固定化有人類抗流感病毒核蛋白 抗體。裝置適合石英晶體微天平OiCM)傳感器或碳納米管(CNT)傳感器。在向樣品供應區(qū) 供應樣品后，樣品展開通過樣品遷移區(qū)，在檢測區(qū)中發(fā)生抗體與樣品中存在的流感病毒核 蛋白之間的反應，并且在這之后，在檢測區(qū)中發(fā)生了物理變化。物理變化的實例包括濁度變 化和質量變化。通過測量這樣的物理變化，可以對樣品中的流感病毒核蛋白進行檢測或定 量。因為流感病毒核蛋白存在于流感病毒中，因此流感病毒核蛋白的檢測或定量能夠檢測 或定量流感病毒。本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的裝置的另一個實施方案，包括含有檢測區(qū)、 樣品供應區(qū)和樣品遷移區(qū)的裝置，其中在檢測區(qū)中，抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)被固 定化在構成該區(qū)的支持物上，從樣品供應區(qū)供應帶有與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體2)結 合的標記物的標記抗體，并且抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體。 盡管這些裝置不包含標記試劑區(qū)，但標記抗體與樣品一起從樣品供應區(qū)供應。通過標記抗 體與樣品中的流感病毒核蛋白之間的反應所產生的流感病毒核蛋白/標記抗體復合物，通 過樣品遷移區(qū)到達檢測區(qū)。復合物與檢測區(qū)中固定化的抗體1反應，并在檢測區(qū)中產生抗 體1/流感病毒核蛋白/標記抗體復合物。通過在產生的抗體1/流感病毒核蛋白/標記抗 體復合物中檢測標記物，可以對流感病毒進行檢測或定量。本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的裝置的另一個實施方案，包括含有檢測區(qū)、 樣品供應區(qū)、樣品遷移區(qū)和標記試劑區(qū)的裝置，其中在檢測區(qū)中，抗流感病毒核蛋白抗體 (抗體1)被固定化在構成該區(qū)的支持物上，帶有與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體幻結合的 標記物的標記抗體以允許遷移的方式保持在標記試劑區(qū)中，并且抗體1和抗體2中的至少 一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體。在這種裝置中，供應到樣品供應區(qū)的樣品展開通過樣 品遷移區(qū)并達到標記試劑區(qū)。在標記試劑區(qū)中，樣品中的流感病毒核蛋白與標記抗體反應 并產生流感病毒核蛋白/標記抗體復合物。產生的復合物通過樣品遷移區(qū)進一步展開并到 達檢測區(qū)。在檢測區(qū)中發(fā)生這些復合物與固定化的抗體1之間的反應，并在檢測區(qū)中產生 抗體1/流感病毒核蛋白/標記抗體復合物。在產生的抗體1/流感病毒核蛋白/標記抗體 復合物中標記物的檢測，能夠檢測或定量樣品中的流感病毒。在這種裝置中，樣品供應區(qū)也 可以起到標記試劑區(qū)的作用[參見圖1(1)和1(2)]。此外，本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的裝置還包括含有帶有固定化到支持物 上的人類抗流感病毒核蛋白抗體的檢測區(qū)、樣品供應區(qū)和樣品遷移區(qū)的裝置，其中從樣品 供應區(qū)供應標記的抗原類似物，所述的標記的抗原類似物中標記物與流感病毒核蛋白抗原 結合；以及含有帶有固定化到支持物上的人類抗流感病毒核蛋白抗體的檢測區(qū)、標記試劑 區(qū)、樣品供應區(qū)和樣品遷移區(qū)的裝置，所述標記試劑區(qū)有標記的抗原類似物，所述標記的抗 原類似物中標記物與流感病毒核蛋白抗原結合，所述流感病毒核蛋白抗原以允許遷移的方 式保持在支持物上。此外，本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的裝置還包括包含在支持物上固定化有 流感病毒核蛋白抗原類似物的檢測區(qū)、樣品供應區(qū)和樣品遷移區(qū)的裝置，其中從樣品供應 區(qū)供應標記抗體，所述標記抗體中標記物與人類抗流感病毒核蛋白抗體結合；以及包含在支持物上固定化有流感病毒核蛋白抗原類似物的檢測區(qū)、具有標記抗體的標記試劑區(qū)、樣 品供應區(qū)和樣品遷移區(qū)的裝置，所述標記抗體中標記物與人類抗流感病毒核蛋白抗體結 合，所述人類抗流感病毒核蛋白抗體以允許遷移的方式保持在支持物上。對于在使用本發(fā)明的裝置檢測或定量流感病毒中使用的樣品沒有具體限制，只要 它們是從人類收集的可能含有流感病毒的樣品即可，其實例包括生物樣品例如鼻腔拭子、 鼻腔吸出物、咽拭子和漱口物。在本發(fā)明中，這些生物樣品可以原樣使用，并且也可以使用 預處理的生物樣品。對于用于預處理的預處理藥劑沒有具體限制，只要它們是破壞流感病 毒的核并能夠與抗流感病毒核蛋白抗體反應的預處理藥劑即可，其實例包括表面活性劑。 表面活性劑的實例包括非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑和兩性 離子表面活性劑，優(yōu)選的是非離子表面活性劑。非離子表面活性劑的實例是聚氧乙烯類型 的表面活性劑(例如Nonidet P-40)。此外，如果需要，在預處理藥劑中可以包含水性溶劑、 緩沖液、防腐劑、鹽類、糖類、金屬離子、蛋白質等。水性溶劑的實例包括去離子水、蒸餾水和 膜過濾水。緩沖液的實例包括乳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩 沖液、鄰苯二甲酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、二乙醇胺緩沖液、賴氨酸緩沖 液、巴比妥酸緩沖液、咪唑緩沖液、蘋果酸鹽緩沖液、草酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽 緩沖液、碳酸鹽緩沖液和Good緩沖液。Good緩沖液的實例包括Tris [三(羥甲基)氨基甲 烷]緩沖液、MES (2-嗎啉乙磺酸)緩沖液、Bis-Tris [雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基) 甲烷]緩沖液、ADA [N-乙酰胺)亞氨基二乙酸]緩沖液、PIPES [哌嗪-N，N’ -雙O-乙 磺酸)]緩沖液、ACES {2-[N-乙酰胺)氨基]乙磺酸}緩沖液、MOPSO (3-嗎啉-2-羥基 丙磺酸)緩沖液、BES {2-[N，N-雙O-羥乙基)氨基]乙磺酸}緩沖液、MOPS (3-嗎啉丙磺 酸)緩沖液、TES<2-{N-[三(羥甲基)甲基]氨基}乙磺酸>緩沖液、HEPES[N-(2-羥 乙基)-N，-(2-磺乙基)哌嗪]緩沖液、DIPSO {3-[N, N-雙(2-羥乙基)氨基]_2_羥基 丙磺酸}緩沖液、TAPSO <2-羥基-3-{[N-三(羥甲基)甲基]氨基}丙磺酸>緩沖液、 POPSO [哌嗪-N，N，-雙(2-羥基丙烷-3-磺酸)]緩沖液、HEPPSO [N- (2-羥乙基)-N，- (2-羥 基-3-磺丙基)哌嗪]緩沖液、EPPS[N-(2-羥乙基)-N’ -(3-磺丙基)哌嗪]緩沖液、 Tricine[N-三(羥甲基)甲基甘氨酸]緩沖液、Bicine[N，N-雙羥乙基)甘氨酸]緩 沖液、TAPS{3-[N-三(羥甲基)甲基]氨基丙磺酸}緩沖液、CHES[2-(N-環(huán)己基氨基)乙 磺酸]緩沖液、CAPSO [3-(N-環(huán)己基氨基)-2-羥基丙磺酸]緩沖液和CAPS [3-(N-環(huán)己基 氨基)丙磺酸]。防腐劑的實例包括疊氮鈉和抗生素。鹽類的實例包括堿金屬鹵化物鹽例如氯 化鈉和氯化鉀。糖類的實例包括甘露糖醇、山梨糖醇和蔗糖。金屬離子的實例包括鎂離 子、錳離子和鋅離子。蛋白質的實例包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、Block Ace (由 DainipponPharmaceutical 制造)禾口云力物血清。下面，在圖1(1)的基礎上對本發(fā)明的裝置的實例進行解釋。當向樣品供應區(qū)加入樣品時，樣品通過毛細作用在支持物上展開并到達標記試劑 區(qū)。在該標記試劑區(qū)中，樣品中的流感病毒核蛋白與標記抗體2反應，在標記試劑區(qū)中產生 流感病毒核蛋白/標記抗體復合物(復合物1)，在標記抗體2中，標記物與抗流感病毒核 蛋白抗體(抗體2)結合。產生的復合物1通過毛細作用在支持物上進一步展開，并到達檢 測區(qū)。到達檢測區(qū)的復合物1與該區(qū)域中固定化的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)反應，并產生了固定化在支持物上的抗體1/流感病毒核蛋白/標記抗體2復合物(復合物2)。 接下來，通過測量產生的復合物2的標記物，可以對樣品中的流感病毒進行檢測或定量。在 此，抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體?？贵w1和抗體2的組合 的實例包括人類抗流感病毒核蛋白抗體/非人類抗流感病毒核蛋白抗體組合、非人類抗流 感病毒核蛋白抗體/人類抗流感病毒核蛋白抗體組合，以及人類抗流感病毒核蛋白抗體/ 人類抗流感病毒核蛋白抗體組合。作為檢測或定量目標的流感病毒的實例包括A型流感病毒和B型流感病毒。因為 流感病毒核蛋白是存在于流感病毒的核中的蛋白并因而是流感病毒的一個組成成分，因此 通過測量流感病毒核蛋白能夠檢測或定量樣品中的流感病毒。當使用本發(fā)明的裝置檢測或定量A型流感病毒時，抗A型流感病毒核蛋白抗體 (抗體Al)被用作抗體1，抗A型流感病毒核蛋白抗體(抗體似)被用作抗體2?？贵wAl和 抗體A2中的一個是人類抗體，更具體來說是人類抗A型流感病毒核蛋白抗體。抗體Al和 抗體A2的組合的實例包括人類抗A型流感病毒核蛋白抗體與人類抗A型流感病毒核蛋白 抗體的組合、人類抗A型流感病毒核蛋白抗體與非人類抗A型流感病毒核蛋白抗體的組合， 以及非人類抗A型流感病毒核蛋白抗體與人類抗A型流感病毒核蛋白抗體的組合。人類抗 A型流感病毒核蛋白抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且優(yōu)選情況下是單克隆抗體。 在單克隆抗體的情況下，A型流感病毒核蛋白中被抗體Al識別的區(qū)域和A型流感病毒核蛋 白被抗體A2識別的區(qū)域可以是相同的，也可以不同，并且優(yōu)選是不同的。當使用本發(fā)明的 裝置檢測或定量A型流感病毒時，在標記試劑區(qū)中產生了 A型流感病毒核蛋白/標記抗體 A2的移動復合物(復合物Al)，并在檢測區(qū)中產生了抗體A1/A型流感病毒核蛋白/標記抗 體A2的固定化的復合物(復合物A2)。當使用本發(fā)明的裝置檢測或定量B型流感病毒時，抗B型流感病毒核蛋白抗體 (抗體Bi)被用作抗體1，抗B型流感病毒核蛋白抗體(抗體B2)被用作抗體2?？贵wBl和 抗體B2中的一個是人類抗體，更具體來說是人類抗B型流感病毒核蛋白抗體?？贵wBl和 抗體B2的組合的實例包括人類抗B型流感病毒核蛋白抗體與人類抗B型流感病毒核蛋白 抗體的組合、人類抗B型流感病毒核蛋白抗體與非人類抗B型流感病毒核蛋白抗體的組合， 以及非人類抗B型流感病毒核蛋白抗體與人類抗B型流感病毒核蛋白抗體的組合。人類抗 B型流感病毒核蛋白抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且優(yōu)選情況下是單克隆抗體。 在單克隆抗體的情況下，B型流感病毒核蛋白中被抗體Bl識別的區(qū)域和B型流感病毒核蛋 白被抗體B2識別的區(qū)域可以是相同的，也可以不同，并且優(yōu)選是不同的。當使用本發(fā)明的 裝置檢測或定量B型流感病毒時，在標記試劑區(qū)中產生了 B型流感病毒核蛋白/標記抗體 B2的移動的復合物(復合物B 1)，并在檢測區(qū)中產生了抗體B1/B型流感病毒核蛋白/標 記抗體B2的固定化的復合物(復合物B2)。人類抗A型流感病毒核蛋白抗體的實例包括下面所述的人類抗A型流感病毒核蛋 白抗體。人類抗B型流感病毒核蛋白抗體的實例包括下面所述的人類抗B型流感病毒核蛋 白抗體。本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的裝置還可以包含一個或多個選自展開溶液 供應區(qū)、過量液體吸收區(qū)和樣品供應驗證區(qū)的區(qū)域。添加到展開溶液供應區(qū)的展開溶液通 過毛細作用在支持物上展開，并使樣品遷移到標記試劑區(qū)，也使在標記試劑區(qū)中產生的復合物1(復合物Al ；復合物Bi)遷移到檢測區(qū)。展開溶液供應區(qū)也可以起到樣品供應區(qū)的 作用。不包括在檢測區(qū)中產生的復合物2 (復合物A2;復合物B2)的過量液體在過量液體 吸收區(qū)中被吸收。此外，樣品的加入可以通過提供含有固定化在支持物上的抗人類IgG抗 體的樣品供應驗證區(qū)來驗證。-支持物對于本發(fā)明裝置中的支持物沒有具體限制，只要它是允許溶液在樣品遷移區(qū)中展 開的材料即可，實例包括玻璃纖維、纖維素、尼龍、交聯(lián)葡聚糖、各種類型的層析紙、硝酸纖 維素以及金屬例如金。該支持物的尺寸沒有限制，優(yōu)選的是寬度在3mm到IOmm左右、長度 在30mm到IOOmm左右的條板?？梢允褂煤穸葹?00 μ m到Imm的支持物。此外，支持物可 以在用例如蔗糖、酪蛋白或動物血清例如牛血清白蛋白(BSA)和酪蛋白阻斷部分或全部支 持物后使用，以防止在測量時來自樣品的蛋白非特異性吸附到支持物上。-檢測區(qū)抗流感病毒核蛋白抗體被固定化在本發(fā)明的裝置的檢測區(qū)中。檢測區(qū)可以與支 持物分開形成，但在優(yōu)選情況下它形成在支持物上。固定化在檢測區(qū)中的抗流感病毒核蛋 白抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并優(yōu)選是單克隆抗體。固定化在檢測區(qū)中的抗流 感病毒核蛋白抗體和形成了以允許遷移的方式保持在標記試劑區(qū)中的標記的抗流感病毒 核蛋白抗體的抗流感病毒核蛋白抗體中的至少一個是人類抗體，并且兩種抗體優(yōu)選都是單 克隆抗體。固定化在檢測區(qū)中的抗流感病毒核蛋白抗體的實例包括下面描述的人類抗A 型流感病毒核蛋白抗體、人類抗B型流感病毒核蛋白抗體以及這些人類抗體的片段[Fab， F(ab，)2，F(ab，)]。用于將抗流感病毒核蛋白抗體固定化到檢測區(qū)的方法的實例，包括將抗流感病毒 核蛋白抗體直接物理吸附到支持物上的方法和通過化學鍵例如共價鍵將抗體固定到支持 物上的方法。此外，可以將抗流感病毒核蛋白抗體與不溶性載體粒子結合，并將它們包含在 支持物中。不溶性載體粒子的實例包括聚苯乙烯乳膠粒子、磁性粒子和玻璃纖維。用于將 抗流感病毒核蛋白抗體與不溶性載體粒子結合的方法的實例，包括上述的物理吸附和化學
纟口口。檢測區(qū)位于標記試劑區(qū)、樣品供應區(qū)、樣品遷移區(qū)和展開溶液供應區(qū)的下游，并位 于過量液體吸收區(qū)的上游。-標記試劑區(qū)在本發(fā)明的裝置的標記試劑區(qū)中，標記抗體以允許遷移的方式保持，所述標記抗 體中，標記物與抗流感病毒核蛋白抗體結合。標記試劑區(qū)可以與支持物分開形成，但在優(yōu)選 情況下它形成在支持物上。形成了以允許遷移的方式保持在標記試劑區(qū)中的標記的抗流感 病毒核蛋白抗體的抗流感病毒核蛋白抗體，可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并優(yōu)選為單 克隆抗體。以允許遷移的方式保持在標記試劑區(qū)中的抗流感病毒核蛋白抗體的實例，包括 下面描述的人類抗A型流感病毒核蛋白抗體、人類抗B型流感病毒核蛋白抗體以及這些人 類抗體的片段[Fab，F(ab’)2，F(ab’)]。用于構建標記試劑區(qū)的方法的實例包括將含有標 記抗體的試劑點樣到支持物上的方法，以及將浸漬有含標記抗體試劑的吸水性襯墊層化在 支持物上的方法。吸水性襯墊的實例包括用于下面所述的樣品供應區(qū)中的吸水性襯墊。形成標記抗體的標記物的實例包括酶例如過氧化物酶、堿性磷酸酶和β -D-半乳糖苷酶、金屬膠體粒子例如金膠體粒子和硒膠體粒子、有色乳膠粒子、發(fā)光物質和熒光物 質。用于制備標記抗體的方法的實例，包括通過共價鍵將標記物和抗體連接的方法以 及通過非共價鍵將標記物和抗體連接的方法。具體來說，實例包括已知方法例如戊二醛方 法、高碘酸方法、馬來酰亞胺方法、吡啶基-二硫化物方法，以及使用各種不同類型交聯(lián)劑 的方法[參見Tanpakushitsu Kakusan Koso (蛋白質、核酸禾口醇(Protein，Nucleic Acidand Enzyme)), (31 Supp 1), pp. 37-45 (1985) ] 0可以使用的交聯(lián)劑的實例包括N-琥珀酰亞胺 基-4-馬來酰亞胺基丁酸酯(GMBQ、N-琥珀酰亞胺基-6-馬來酰亞胺基己酸酯和N-琥珀 酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯。在利用共價鍵的方法中，可以使 用抗體上存在的官能團，并且可以通過常規(guī)方法引入例如官能團例如氨基、羧基、羥基、巰 基，然后可以通過上面提到的方法制備標記抗體。此外，通過非共價結合的方法的實例包括 物理吸附方法。-樣品供應區(qū)本發(fā)明的裝置中的樣品供應區(qū)位于檢測區(qū)的上游，并且通過該區(qū)域供應樣品。樣 品供應區(qū)形成在支持物中，并且該區(qū)域也可以通過將吸水性襯墊層化在支持物上來形成。 支持物和形成樣品供應區(qū)的吸水性襯墊在適合情況下可以包含鹽類、表面活性劑等。鹽類 和表面活性劑的實例包括上面提到的鹽類和表面活性劑。吸水性襯墊的實例包括例如玻璃 纖維、纖維素、無紡布和聚乙烯醇。此外，樣品供應區(qū)也可以起到上面提到的標記試劑區(qū)的作用，并且在這種情況下， 通過將浸漬有含標記抗體試劑的吸水性襯墊層化在支持物上，可以有效地吸收樣品。對于 吸水性襯墊沒有具體限制，只要它是吸收標記抗體和流感病毒核蛋白并顯示出低的吸附性 的材料即可，其實例包括上面描述的那些。-樣品遷移區(qū)本發(fā)明的裝置的樣品遷移區(qū)存在于整個支持物上，并且是樣品、標記抗體和下面 描述的展開溶液遷移的區(qū)域。供應到樣品供應區(qū)的樣品與標記抗體一起運輸通過樣品遷移 區(qū)到檢測區(qū)。此外，樣品可以由從下述展開溶液供應區(qū)供應的展開溶液運輸通過樣品遷移 區(qū)到檢測區(qū)。-展開溶液供應區(qū)本發(fā)明的裝置中的展開溶液供應區(qū)被提供在支持物的一個末端，是供應展開溶液 的區(qū)域。通過使已經向樣品供應區(qū)供應了樣品的裝置的展開溶液供應區(qū)浸透展開溶液，樣 品可以由于展開溶液的作用在支持物上遷移，并通過樣品遷移區(qū)運輸到檢測區(qū)。在此過程 中，樣品中的流感病毒核蛋白與在標記試劑區(qū)中的標記抗體反應，產生的移動的標記抗體/ 流感病毒核蛋白復合物進一步運輸到檢測區(qū)，并在檢測區(qū)中產生抗流感病毒核蛋白抗體/ 流感病毒核蛋白/標記抗體復合物。樣品可以不使用展開溶液在支持物上展開，并且通過 使用展開溶液，樣品可以有效展開。展開溶液是使樣品在支持物上展開的水性溶劑；此外， 如果需要，該水性溶劑可以包括添加劑，例如上面提到的緩沖液、表面活性劑、防腐劑、鹽 類、糖類、金屬離子和蛋白質。-樣品供應驗證區(qū)本發(fā)明的裝置中的樣品供應驗證區(qū)提供在過量液體吸收區(qū)上游，是用于確定驗證樣品已被加到裝置的樣品供應區(qū)的區(qū)域。在使用兩種抗體(抗體1和抗體幻的本發(fā)明的裝置中，當樣品供應到樣品供應區(qū) 時，未反應的標記抗體和通過樣品中的流感病毒核蛋白與標記抗體(標記的抗流感病毒核 蛋白抗體)之間的反應形成的流感病毒核蛋白/標記抗體復合物一起，展開通過樣品遷移 區(qū)。因此，當樣品確實供應時，未反應的標記抗體展開通過樣品遷移區(qū)。樣品供應驗證區(qū)是 捕獲這些未反應的標記抗體的區(qū)域，并且可以通過固定化和固定針對標記抗體的抗體來構 建。與標記抗體反應的抗體的實例包括針對抗流感病毒核蛋白抗體的抗體和針對標記物的 抗體。用于固定化與標記抗體反應的抗體的方法的實例，包括上面提到的在檢測區(qū)中固定 化抗體的方法。此外，樣品供應驗證區(qū)也可以通過固定化和固定針對樣品中共同包含的物 質(例如酶)的抗體來構建(參見圖1的(3))。同樣地，在使用單個抗體的本發(fā)明的裝置中，可以通過固定化和固定針對樣品中 共同包含的物質(例如酶)的抗體、針對標記的抗原類似物(標記的流感病毒核蛋白抗原 類似物)的抗體或針對標記抗體(標記的人類抗流感病毒核蛋白抗體)的抗體，來構建樣 品供應驗證區(qū)。-過量液體吸收區(qū)本發(fā)明的裝置中的過量液體吸收區(qū)被提供在支持物上的最下游。概括來說，與展 開溶液一起在支持物上展開的樣品和標記抗體被捕獲在檢測區(qū)中以產生抗流感核蛋白抗 體/流感核蛋白/標記抗體復合物，而該區(qū)域用于在復合物產生后吸收過量液體。過量液 體吸收區(qū)可以從支持物形成，它也可以通過向支持物附加吸水性物質來形成，或者它也可 以通過將吸水性物質層化在支持物上來形成。吸水性物質的實例包括高度吸水性濾紙和海 綿。[使用裝置檢測和定量流感病毒]使用本發(fā)明的裝置檢測和定量流感病毒，可以如下所示進行。-實施方案1供應到樣品供應區(qū)的樣品展開通過檢測遷移區(qū)并到達檢測區(qū)。在檢測區(qū)，樣品中 的流感病毒核蛋白與人類抗流感病毒核蛋白抗體反應形成流感病毒核蛋白/人類抗流感 病毒核蛋白抗體復合物。通過測量與該復合物形成相伴的物理變化，可以對流感病毒進行 檢測和定量。本文中的物理變化的實例包括質量變化。-實施方案2供應到樣品供應區(qū)的樣品和標記抗體(標記的抗流感病毒核蛋白抗體)展開通過 檢測遷移區(qū)并到達檢測區(qū)。在供應或展開步驟過程中產生的流感病毒核蛋白/標記抗體復 合物與檢測區(qū)中的抗流感病毒核蛋白抗體反應，產生抗流感病毒核蛋白抗體/流感病毒核 蛋白/標記抗體復合物。通過測量檢測區(qū)中產生的這些抗流感病毒核蛋白抗體/流感病毒 核蛋白/標記抗體復合物中的標記物，可以對流感病毒進行檢測或定量。-實施方案3供應到樣品供應區(qū)的樣品在標記試劑區(qū)中與標記的抗流感病毒核蛋白抗體(標 記抗體2、反應并產生流感病毒核蛋白/標記抗體2復合物(復合物1)。然后，展開通過樣 品遷移區(qū)到檢測區(qū)的復合物1與檢測區(qū)中的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)反應，在檢測 區(qū)中產生固定化形式的抗體1/抗流感病毒核蛋白/標記抗體2復合物(復合物2~)，并通過測量過檢測區(qū)中產生的復合物2的標記物，可以對流感病毒進行檢測或定量。在這里，抗體 1和構成標記的抗流感病毒核蛋白抗體(標記抗體幻的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體2) 中的至少一種是人類抗體。展開溶液也可以用于供應到樣品供應區(qū)的樣品的展開以及在標 記試劑區(qū)中產生的復合物1向檢測區(qū)的展開。-實施方案4供應到樣品供應區(qū)的樣品和標記的抗原類似物(標記的流感病毒核蛋白抗原類 似物)展開通過檢測遷移區(qū)并到達檢測區(qū)。在檢測區(qū)中，樣品中的流感病毒核蛋白抗原與 標記的抗原類似物競爭性地與人類抗流感病毒核蛋白抗體反應，導致產生人類抗流感病毒 核蛋白抗體/流感病毒核蛋白抗原復合物和人類抗流感病毒核蛋白抗體/標記的抗原類似 物復合物。通過測量在檢測區(qū)中產生的這些復合物中的標記物，可以對流感病毒進行檢測 或定量。-實施方案5供應到樣品供應區(qū)的樣品展開通過樣品遷移區(qū)并到達標記試劑區(qū)。到達標記試劑 區(qū)的樣品與標記的抗原類似物(標記的流感病毒核蛋白抗原類似物)進一步展開通過樣品 遷移區(qū)，并到達檢測區(qū)。在檢測區(qū)中，樣品中的流感病毒核蛋白抗原與標記的抗原類似物競 爭性地與人類抗流感病毒核蛋白抗體反應，導致產生人類抗流感病毒核蛋白抗體/流感病 毒核蛋白抗原復合物和人類抗流感病毒核蛋白抗體/標記的抗原類似物復合物。通過測量 在檢測區(qū)中產生的這些復合物中的標記物，可以對流感病毒進行檢測或定量。-實施方案6供應到樣品供應區(qū)的樣品和標記抗體(標記的人類抗流感病毒核蛋白抗體)展開 通過檢測遷移區(qū)。在供應或展開步驟過程中產生的流感病毒核蛋白/標記抗體復合物與未 反應的標記抗體一起到達檢測區(qū)。在檢測區(qū)中，未反應的標記抗體與流感病毒核蛋白抗原 類似物反應產生流感病毒核蛋白抗原類似物/標記抗體復合物。通過測量在檢測區(qū)中產生 的這些流感病毒核蛋白抗原類似物/標記抗體復合物中的標記物，可以對流感病毒進行檢 測或定量。-實施方案7供應到樣品供應區(qū)的樣品展開通過樣品遷移區(qū)并到達標記試劑區(qū)。在標記試劑區(qū) 中，流感病毒核蛋白與標記抗體(標記的人類抗流感病毒核蛋白抗體)反應并產生流感病 毒核蛋白/標記抗體復合物。產生的復合物與未反應的標記抗體進一步展開通過樣品遷移 區(qū)并到達檢測區(qū)。在檢測區(qū)中，未反應的標記抗體與流感病毒核蛋白抗原類似物反應，產生 流感病毒核蛋白抗原類似物/標記抗體復合物。通過測量在檢測區(qū)中產生的這些流感病毒 核蛋白抗原類似物/標記抗體復合物中的標記物，可以對流感病毒進行檢測或定量。在本文中，在檢測區(qū)中產生的復合物中的標記物可以使用已知方法測量。當標記 物是金膠體粒子或有色乳膠粒子時，可以通過測量由于復合物的產生而在支持物上產生的 條帶的吸光度，來進行測量。當標記物是酶時，可以通過允許酶的底物在酶上作用來測量標 記物。檢測方法可以根據使用的酶和酶的底物來選擇。酶的底物可以包含在展開溶液中，它也可以允許遷移的方式承載在裝置中提供的 底物試劑區(qū)中。當酶是過氧化物酶時，其底物的實例包括發(fā)色底物和發(fā)光底物。發(fā)色底 物的實例包括無色型發(fā)色團與過氧化氫的組合，以及過氧化氫與包含兩種化合物的組合的偶聯(lián)型發(fā)色團的組合。無色型發(fā)色團的實例包括2，2’_連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑 啉-6-磺酸)(ABTS)、3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、10-N-羧甲 基氨甲?；?3，7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)UO-N-甲基氨甲?；?3，7-雙 (二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’ -雙(二甲基氨基)二 苯基胺鈉鹽(DA-64)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3，7_雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪鈉鹽 (DA-67)、4，4’_雙(二甲基氨基)二苯基胺和雙[3-雙(4-氯苯基)甲基_4_ 二甲基氨基 苯基]胺(BCMA)。含有兩種化合物的組合的偶聯(lián)型發(fā)色團的實例包括偶聯(lián)劑與苯胺或苯 酚的組合。偶聯(lián)劑的實例包括4-氨基安替比林G-AA)和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙。 苯胺的實例包括N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’ -琥珀?；叶?EMSE)、N_(3，5_ 二甲 氧基苯基)-N’ -琥珀?；叶封c鹽(DOSE)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)_3_甲 基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、 N-(3-磺基丙基)_3，5- 二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3，5- 二甲基苯胺、N-乙 基-N-(3-磺基丙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺、 N-乙基-N- (2-羥基-3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺基丙基)-3-甲基苯 胺鈉鹽二水化物(TOOS)、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺基丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺、N- (2-羥 基-3-磺基丙基)_3，5- 二甲氧基苯胺鈉鹽(HSDA)、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺基丙基)-3， 5-二甲基苯胺、N-(3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺和N-乙 基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-4-氟-3，5-二甲氧基苯胺鈉鹽(F-DAOS)。苯酚的實例包括 苯酚和3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸。發(fā)色底物的實例包括魯米諾與過氧化氫的組合和異 魯米諾與過氧化氫的組合。當酶是堿性磷酸酶時，其底物時例如發(fā)色底物、熒光底物或發(fā)光底物?？梢酝ㄟ^ 當底物是發(fā)色底物時測量吸光度、當底物是熒光底物時測量熒光強度、當底物是發(fā)光底物 時測量發(fā)光強度來進行檢測或定量。發(fā)色底物的實例包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸 酯(BCIP)和4-硝基苯基磷酸酯。熒光底物的實例包括4-甲基傘酮基磷酸酯(4MUP)和 用于β -D-半乳糖苷酶的4-甲基傘酮基苯基-β -D-半乳糖苷(4MUG)。發(fā)光底物的實例 包括3-(2’ -螺金剛烷)-4-甲氧基_4-(3’ -磷酰氧基)苯基-1，2-二氧雜環(huán)丁烷二鈉鹽 (AMPPD)、2-氯-5-{4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2，-(5，-氯)三環(huán)[3. 3. 1. 13， 7]癸]_4_基}苯基磷酸二鈉鹽(CDP-MarTM)、3-{4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3， 2，-(5，-氯)三環(huán)[3. 3. 1. 13，7]癸]_4_基}苯基磷酸二鈉鹽(CSPD )和[10-甲 基-9 (IOH)-亞吖啶基]苯氧基甲基磷酸二鈉鹽(Lumigen APS-5)。當酶是β-D-半乳糖苷酶時，該酶的底物的實例包括發(fā)光底物例如3- ’-螺金剛 烷)-4-甲氧基-4-(3”-i3-D-吡喃半乳糖基)苯基-1，2-二氧雜環(huán)丁烷(AMGPD)。此外，本發(fā)明的裝置應該只包含人類抗流感病毒核蛋白抗體作為其組分，并且對 于檢測區(qū)中的檢測方法沒有具體限制。不僅可以使用上面提到的發(fā)色方法(吸光度方法)、 熒光方法和發(fā)光方法作為檢測方法，檢測質量變化的方法也可以使用。用于檢測質量變 化的方法的實例包括表面等離子體共振(SPR)方法和使用壓電振動器的方法(參見例如 W02005/015217 公開)。使用本發(fā)明的裝置對樣品中的流感病毒定量可以如下進行。首先，使用從流感病 毒制備的具有已知濃度的流感病毒核蛋白作為樣品，將這些樣品供應到本發(fā)明的裝置的樣品供應區(qū)，在檢測區(qū)測量信息(例如吸光度)，并產生顯示出流感病毒濃度與信息的量之間 的關系的校正曲線。然后，使用實際目標樣品進行類似測量，并將獲得的信息量與以前制備 的校正曲線相關聯(lián)，以確定濃度。[用于檢測或定量流感病毒的方法]本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的方法是在其中使用至少一種或者多種人類 抗流感病毒核蛋白抗體的方法。流感病毒可以使用將在下面描述的本發(fā)明的用于檢測或定 量流感病毒的試劑盒進行檢測或定量。本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的方法沒有具體限制，只要它們是能夠檢測或 定量流感病毒的方法即可，其實例包括放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA)、酶聯(lián)免 疫吸附分析(ELISA)、均相酶免疫分析、熒光免疫分析(FIA)、免疫熒光分析(IFMA)、熒光偏 振分析、化學發(fā)光免疫分析(CLIA)、化學發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)、比濁免疫分析和表面等 離子體共振(SPR)方法。本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的方法包括如下所示的方法。-方法1一種用于檢測或定量流感病毒的方法，其包含下列步驟(1)將樣品與固定在載體上的人類抗流感病毒核蛋白抗體反應；以及(2)測量在步驟(1)中產生的物理變化。在本方法中物理變化的量中的物理變化的實例包括濁度變化和質量變化。該方法 可以應用于測量伴隨著抗原抗體反應出現的反應溶液的濁度變化的比濁免疫分析，或應用 于測量伴隨著抗原抗體反應出現的質量變化的表面等離子體共振(SPR)方法。-方法2一種用于檢測或定量流感病毒的方法，其包含下列步驟(1)將樣品與固定在載體上的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)反應，以在載體上 形成抗體1/流感病毒復合物；(2)將在步驟(1)中在載體上形成的復合物與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體2)反 應；以及(3)測量在步驟O)中誘導的物理變化；其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體。抗體1和抗體2可以是單克隆抗體或多克隆抗體，優(yōu)選二者都是單克隆抗體。在本方法中物理變化的量中的物理變化的實例包括濁度變化和質量變化。該方法 可以應用于測量伴隨著抗原抗體反應出現的反應溶液的濁度變化的比濁免疫分析，或應用 于測量伴隨著抗原抗體反應出現的質量變化的表面等離子體共振(SPR)方法。步驟(1)和 步驟(2)可以同時進行。-方法3一種用于檢測或定量流感病毒的方法，其包含下列步驟(1)將樣品與固定在載體上的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)反應，以在載體上 形成抗體1/流感病毒核蛋白復合物；(2)將在步驟⑴中在載體上形成的復合物與標記抗體(標記抗體2)反應，以在 載體上形成抗體1/流感病毒核蛋白/標記抗體2復合物，所述標記抗體中標記物與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體幻結合；(3)在步驟(2)后清洗載體以除去未與載體結合的物質；以及(4)測量步驟C3)后載體上的抗體1/流感病毒核蛋白/標記抗體2復合物中的標 記物；其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體。上述方法是夾心方法的一種實施方案。對于上述方法中的抗體1和抗體2來說，流 感病毒核蛋白被相應抗體識別的區(qū)域可以相同或不同，并且優(yōu)選情況下區(qū)域是不同的。此 外，上述方法中的抗體1和抗體2可以各自是單克隆抗體或多克隆抗體，并且優(yōu)選情況下二 者都是單克隆抗體。在上述方法中，當源自于步驟中產生的復合物中的標記物的信息的量與源自 于在步驟O)中反應系統(tǒng)中存在的未反應標記抗體中的標記物的信息的量之間的差異顯 著時，步驟(3)的清洗步驟可以省略(均相方法)。此外，步驟(1)和步驟( 可以同時進 行，并且清洗步驟可以插入到步驟(1)與步驟⑵之間。用于測量上述方法的步驟中的標記物的方法的實例，包括上面提到的方法。-方法4一種用于檢測或定量流感病毒的方法，其包含下列步驟(1)將樣品與標記抗體(標記抗體2)反應，以形成標記抗體2/流感病毒核蛋白復 合物，所述標記抗體中，標記物與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體幻結合；(2)將步驟(1)中形成的復合物與固定在載體上的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體 1)反應，以在載體上形成抗體1/流感病毒核蛋白/標記抗體2復合物；(3)在步驟(2)后清洗載體以除去未與載體結合的物質；以及(4)測量步驟C3)后載體上的抗體1/流感病毒核蛋白/標記抗體2復合物中的標 記物；其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體。上述方法是夾心方法的另一種實施方案。對于上述方法中的抗體1和抗體2來說， 流感病毒核蛋白被相應抗體識別的區(qū)域可以相同或不同，并且優(yōu)選情況下區(qū)域是不同的。 此外，上述方法中的抗體1和抗體2可以各自是單克隆抗體或多克隆抗體，并且優(yōu)選情況下 二者都是單克隆抗體。在上述方法中，當源自于步驟O)中產生的復合物中的標記物的信息的量與源自 于在步驟O)中反應系統(tǒng)中存在的未反應標記抗體中的標記物的信息的量之間的差異顯 著時，步驟(3)的清洗步驟可以省略(均相方法)。此外，步驟(1)和步驟( 可以同時進 行，并且清洗步驟可以插入到步驟⑴與步驟⑵之間。用于測量上述方法的步驟中的標記物的方法的實例，包括上面提到的方法。-方法5一種用于檢測或定量流感病毒的方法，其包含下列步驟(1)在同時存在標記抗原類似物的情況下，將樣品與固定在載體上的人類抗流感 病毒核蛋白抗體反應，以在載體上形成人類抗流感病毒核蛋白抗體/流感病毒核蛋白復合 物和人類抗流感病毒核蛋白抗體/標記的抗原類似物復合物，所述標記抗原類似物中標記 物與流感病毒核蛋白抗原類似物結合；
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(2)在步驟(1)后清洗載體以除去未與載體結合的物質；以及(3)在步驟( 后測量載體上的復合物中的標記物。上述方法是競爭方法的一個實施方案。上述方法中的人類抗流感病毒核蛋白抗體 可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且優(yōu)選情況下它是單克隆抗體。用于測量上述方法的步驟(3)中的標記物的方法的實例，包括上面提到的方法。-方法6—種用于檢測或定量流感病毒的方法，其包含下列步驟(1)在同時存在標記抗體的情況下，將樣品與固定在載體上的流感病毒核蛋白抗 原類似物反應，以在載體上形成流感病毒核蛋白抗原類似物/標記抗體復合物，所述標記 抗體中標記物與人類抗流感病毒核蛋白抗體結合；(2)在步驟(1)后清洗載體以除去未與載體結合的物質；以及(3)在步驟( 后測量載體上的復合物中的標記物。上述方法是競爭方法的另一個實施方案。上述方法中的人類抗流感病毒核蛋白抗 體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且優(yōu)選情況下它是單克隆抗體。用于測量上述方法的步驟(3)中的標記物的方法的實例，包括上面提到的方法。本發(fā)明的方法中的反應條件可以由本技術領域的專業(yè)人員適當地設置，例如，反 應溫度為0°c到50°C、優(yōu)選為4°C到40°C，反應時間是1分鐘到M小時、優(yōu)選為3分鐘到12 小時。此外，當包含清洗步驟時，載體的清洗可以使用例如磷酸鹽緩沖的鹽水(PBQ進行。在本發(fā)明的方法中使用的固相具有固定化并固定在載體上的抗流感病毒核蛋白 抗體或標記的抗原類似物。對于載體沒有具體限制，只要它能夠允許抗流感病毒核蛋白抗 體或標記的抗原類似物的固定化和固定、并且不溶于水即可，其實例包括聚苯乙烯板例如 微量滴定板、由玻璃或合成樹脂制成的粒狀物質(珠子)、由玻璃或合成樹脂制成的球狀物 質(球)、乳膠、磁性粒子、硝酸纖維素膜、尼龍膜和由合成樹脂制成的管。用于將抗流感病 毒核蛋白抗體或標記的抗原類似物固定化和固定在載體上的方法的實例，包括直接方法和 間接方法。直接方法的實例包括通過共價鍵將載體上的官能團與抗流感病毒核蛋白抗體或 標記的抗原類似物中的官能團相連的方法。這里，載體上的官能團與抗流感病毒核蛋白抗 體或標記的抗原類似物中的官能團的組合的實例，包括氨基-羧基和羧基-氨基。間接方法的實例包括通過連接物將載體上的官能團與抗流感病毒核蛋白抗體或 標記的抗原類似物中的官能團間接相連的方法，以及使用物質之間的相互作用的方法。在 這里，載體上的官能團與抗流感病毒核蛋白抗體或標記的抗原類似物中的官能團的組合的 實例，包括氨基-氨基、氨基-羧基、氨基-巰基、羧基-氨基、羧基-羧基和羧基-巰基 等。官能團可以通過化學修飾導入。利用物質之間的相互作用的方法的實例包括利用親和 素-生物素相互作用的方法和利用糖-凝集素相互作用的方法。當利用親和素-生物素相 互作用例如通過將吸附有親和素的載體與生物素化的抗流感病毒核蛋白抗體或生物素化 的標記的抗原類似物進行反應時，可以將抗流感病毒核蛋白抗體或標記的抗原類似物固定 化并固定在載體上。此外，通過用牛血清白蛋白、酪蛋白等進一步阻斷其上帶有固定化并固定的抗流 感病毒核蛋白抗體或標記的抗原類似物的載體而制備的固相，可以用作在本發(fā)明的方法中 使用的固相。
在本發(fā)明的方法中使用的人類抗流感病毒核蛋白抗體的實例包括下面描述的人 類抗A型流感病毒核蛋白抗體和人類抗B型流感病毒核蛋白抗體。在本發(fā)明的方法中使用的標記物的實例包括上面提到的標記物。用于在本發(fā)明的 方法中測量標記物的方法的實例，包括上面提到的用于測量標記物的方法。在本發(fā)明的方法中使用的標記的抗流感病毒核蛋白抗體，可以按照上面描述的方 法從標記物和抗流感病毒核蛋白抗體制備。在本發(fā)明的方法中使用的流感病毒核蛋白抗原類似物是與樣品中的流感病毒核 蛋白競爭與固定在載體上的人類抗流感病毒核蛋白抗體的反應的物質，其實例不僅包括流 感病毒核蛋白本身，而且還包括含有在流感病毒核蛋白中發(fā)現的被抗流感病毒核蛋白抗體 識別的表位的物質。在本發(fā)明的方法中使用的標記的抗原類似物(標記的流感病毒核蛋白抗原類似 物)，可以通過與上述用于制備標記抗體的方法類似的方法來制備。[用于檢測或定量流感病毒的試劑盒]本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，是用于本發(fā)明的檢測或定量流感病 毒的方法的試劑盒。本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的試劑盒的實例包括下面描述的試劑盒。-試劑盒1一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含通過將人類抗流感病毒核蛋白抗 體固定到載體上而產生的固相。人類抗流感病毒核蛋白抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。本試劑盒適用于方法例如比濁免疫分析和表面等離子體共振(SPR)方法。-試劑盒2一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含通過將抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)固定到載體上而產生的固相，以及含有抗流感病毒核蛋白抗體(抗體2)的試劑，并且其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體?？贵w1和抗體2可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且優(yōu)選情況下二者都是單克 隆抗體。本試劑盒適用于方法例如比濁免疫分析和表面等離子體共振(SPR)方法。-試劑盒3一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含通過將抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)固定到載體上而產生的固相，以及含有標記抗體的試劑，所述標記抗體中標記物與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體2)
纟口 I=I，并且其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體?？贵w1和抗體2可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且優(yōu)選情況下二者都是單克 隆抗體。本試劑盒適用于基于夾心方法的免疫分析方法。-試劑盒4
一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含通過將人類抗流感病毒核蛋白抗 體固定到載體上而產生的固相，以及含有標記的抗原類似物的試劑，所述標記的抗原類似物中的標記物與流感病毒核 蛋白抗原類似物結合。本試劑盒適用于基于競爭方法的免疫分析方法。-試劑盒5一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含通過將流感病毒核蛋白抗原類似物固定到載體上而產生的固相，以及含有標記抗體的試劑，所述標記抗體中標記物與人類抗流感病毒核蛋白抗體結合。本試劑盒適用于基于競爭方法的免疫分析方法。在本發(fā)明的用于檢測或定量流感病毒的試劑盒中使用的固相的實例，包括上面提 到的固相。在本發(fā)明的試劑盒中使用的人類抗流感病毒核蛋白抗體的實例包括下面描述的 人類抗A型流感病毒核蛋白抗體和人類抗B型流感病毒核蛋白抗體。在本發(fā)明的試劑盒中使用的標記物的實例包括上面提到的標記物。用于測量本發(fā) 明的試劑盒中的標記物的方法和實例，包括上面提到的用于測量標記物的方法。根據需要，本發(fā)明的試劑盒不僅可以包括上面提到的水性溶劑，而且可以包括上 面提到的添加劑例如緩沖液、表面活性劑、防腐劑、鹽類、糖類、金屬離子和蛋白。這些添加 劑可以用作獨立于固相和構成本發(fā)明試劑盒的試劑的含添加劑試劑，它們也可以通過包含 在固相和構成本發(fā)明試劑盒的試劑中的任一或二者中來使用。[人類抗流感病毒核蛋白抗體]本發(fā)明的人類抗流感病毒核蛋白抗體是用于本發(fā)明的檢測或定量流感病毒的裝 置、本發(fā)明的檢測或定量流感病毒的試劑盒和本發(fā)明的檢測或定量流感病毒的方法的抗 體。其實例包括人類抗A型流感病毒核蛋白抗體和人類抗B型流感病毒核蛋白抗體。此外， 本發(fā)明的人類抗流感病毒核蛋白抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且它們優(yōu)選為單 克隆抗體。本發(fā)明的人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體優(yōu)選是與A型流感病毒核蛋白特 異性反應但是不與B型流感病毒核蛋白反應的抗體。此外，本發(fā)明的人類抗B型流感病毒 核蛋白單克隆抗體優(yōu)選是與B型流感病毒核蛋白特異性反應但是不與A型流感病毒核蛋白 反應的抗體。-用于產生人類抗流感病毒核蛋白單克隆抗體的方法如上所述，本發(fā)明的人類抗流感病毒核蛋白抗體優(yōu)選為人類抗流感病毒核蛋白單 克隆抗體。人類抗流感病毒核蛋白單克隆抗體可以通過已知的單克隆抗體生產方法來生產 [雜交瘤方法(參見例如In VitroCell Dev Biol. (1985)21(10) :593-596)，病毒感染方法 (參見例如 J. gen. Virol. (1983)，64，697-700)，噬菌體展示方法(參見例如 W02001/062907 公開)，淋巴細胞微陣列方法等]，并且淋巴細胞微陣列方法是優(yōu)選的。淋巴細胞微陣列方法是與單克隆抗體生產方法相關的技術，由富山大學 (University of Toyama)和SC World, Inc.聯(lián)合開發(fā)[日本專利申請公開出版號(JP-A) 2004-173681 (未經審查的已公布日本專利申請)JP-A(Kokai) 2004-187676 ； JP-A (Kokai) 2005-261339 ； JP-A (Kokai) 2007-14267 ；Anal. Chem. 77 (24), p.8050-8056(2005) ；Cytometry A71 (11), p. 961-967(2007) ；Cytometry A 71(12)， p. 1003-1010 (2007)]，并包括下列步驟[1]從人類血液制備B淋巴細胞的步驟；[2]篩選與測量物反應的B淋巴細胞的步驟；[3]從篩選到的B淋巴細胞獲得與測量物反應的抗體的相關基因的步驟；[4]使用獲得的基因表達抗體的步驟；以及[5]篩選具有所需性質的抗體的步驟。在后文中，描述了每個上面提到的與人類抗流感病毒核蛋白單克隆抗體的生產相 關的步驟。[1]從人類血液制備B淋巴細胞的步驟人類B淋巴細胞可以從人類外周血制備，具體來說，它們可以從具有流感病毒感 染史或流感疫苗接種史、在血清中可以證實流感病毒核蛋白抗體的存在的人類外周血制 備。理想情況下，通過在流感疫苗接種后經過一段時間、優(yōu)選為1到30天、更優(yōu)選5到10 天后收集血液來制備它們。制備方法的具體實例包括使用密度梯度離心、細胞分揀器、磁珠 等的方法。[2]篩選與測量物反應的B淋巴細胞的步驟特異性針對抗原的單一 B淋巴細胞的篩選，可以通過例如使用微孔陣列芯片的方 法來進行。在例如使用微孔陣列芯片的方法中，向用于抗原特異性B淋巴細胞檢測的微孔 陣列芯片的每個微孔加入抗原，所述芯片具有多個微孔，各含有單個測試B淋巴細胞，然后 檢測與抗原反應的B淋巴細胞，并通過從微孔收集檢測到的抗原特異性B淋巴細胞，可以獲 得特異性針對抗原的單個B淋巴細胞。在后文中，將更詳細地描述該方法?？梢允褂镁哂卸鄠€微孔并且其中每個微孔可以包含單個測試B淋巴細胞的微孔 陣列芯片。通過在每個微孔中包含單個測試B淋巴細胞，可以在細胞水平上鑒定抗原特異 性B淋巴細胞。也就是說，當使用該微孔陣列芯片時，包含在微孔中的測試B淋巴細胞是單 個細胞；因此，可以鑒定到作為單個細胞的與抗原反應的測試B淋巴細胞，因此可以檢測到 作為單個細胞的抗原特異性B淋巴細胞。然后，收集檢測到的單個抗原特異性B淋巴細胞 并克隆其基因。對于微孔的形狀或維度沒有具體限制，微孔的形狀可以是例如圓柱形，或 除此之外它可以是立方形、倒圓錐形、倒棱錐(倒三棱錐、倒四棱錐、倒五棱錐、倒六棱錐、 具有七個或以上側面的倒多棱錐)形，或者它可以是由兩種或以上這些形狀組合產生的形 狀。例如，一部分可以是圓柱形，剩余部分可以是倒圓錐形。此外，在倒圓錐或倒棱錐的情況 下，底面是微孔的開口 ；但是，形狀可以是其中倒圓錐或倒棱錐的一部分頂端被截去的形狀 (在這種情況下微孔的底部將是平的)。對于圓錐和立方體來說，微孔的底部一般是平的， 但是它也可以是曲面(凸面或凹面)。對于其中倒圓錐形或倒棱錐的一部分頂端被截去的 形狀來說，微孔的底部也可以制造成曲面。測試B淋巴細胞與培養(yǎng)溶液一起儲存在微孔中。 培養(yǎng)溶液的實例包括下列任一種1. 137mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl，1. 8mmol/L CaCl2, lmmol/LMgCl2, lmg/mL葡萄 糖，lmg/mL BSA,20mmol/L HEPES (pH7. 4)
2.含10% FCS (胎牛血清)的RPMI1640培養(yǎng)基3.含 lmg/mL BSA 的 RPMI1640 培養(yǎng)基4.含 10% FCS (胎牛血清)的 Dulbecco，s MEM 培養(yǎng)基5.含 lmg/mL BSA 的 Dulbecco，s MEM 培養(yǎng)基與抗原反應的細胞的檢測可以如下進行。例如，當抗原與B淋巴細胞的抗原受體(免疫球蛋白)結合時，首先發(fā)生細胞內信 號轉導，然后發(fā)生細胞增殖和抗體生產。因此，通過用各種不同方法檢測細胞內信號傳導、 細胞增殖或抗體產生，可以檢測與抗原反應的細胞。通過檢測細胞內信號傳導檢測與抗原 反應的細胞，可以通過例如使用Ca離子依賴性熒光染料觀察細胞內Ca離子濃度的變化來 進行。細胞內Ca離子濃度的變化使用Fura-2、Fluo-3或Fluo-4作為熒光染料、熒光顯微 鏡或微陣列掃描儀作為檢測裝置進行觀察。[3]從篩選到的B淋巴細胞獲得與測量物反應的抗體的相關基因的步驟使用細胞裂解試劑溶解收集到的抗原特異性B淋巴細胞，然后使用PCR克隆抗原 特異性免疫球蛋白(抗體)基因。作為細胞裂解試劑，可以使用已知是細胞裂解試劑的物 質，其實例包括下列Ix 第一鏈緩沖液[GIBC0-BRL,隨 SuperScriptII 提供]，0. 2mmo 1/LdNTP，0. 25% NP-40,0. lmg/mL BSA, 10mmol/L DTT，隨機引物 0. 05 μ mol/L，IU/μ L RNasin0B淋巴細胞中的抗原受體基因與抗體基因相同，作為蛋白，它被稱為免疫球蛋白。 抗原受體存在于B淋巴細胞表面上(膜類型免疫球蛋白)，而抗體一般作為分泌蛋白(分 泌型免疫球蛋白)產生。它們的區(qū)別在于蛋白的C-端一側。膜類型免疫球蛋白具有埋在 細胞膜中的膜結構域和伸出到胞質一側的部分。分泌型免疫球蛋白也從同樣基因產生。但 是，由于可能的剪接，分泌型免疫球蛋白白C-端一側與膜類型免疫球蛋白的蛋白C-端一側 不同，使得分泌型免疫球蛋白不具有任何膜結構域。結果，分泌型免疫球蛋白作為分泌蛋白 產生，并且這兩種蛋白的抗原結合位點是相同的。因此，在B淋巴細胞的情況下，抗體基因 的克隆和抗原受體基因的克隆是相同的。使用通過使用細胞裂解試劑溶解收集到的抗原特異性B淋巴細胞而獲得的溶液， 通過反轉錄酶進行cDNA的制備。接下來，通過DNA聚合酶在cDNA的3’ -端進行加尾反應，以執(zhí)行腺嘌呤、鳥嘌呤、 胞嘧啶或胸腺嘧啶向cDNA 3’ -端的加尾?？梢酝ㄟ^使用用于免疫球蛋白基因的引物混合物進行兩次PCR，來擴增所需抗原 特異性免疫球蛋白基因。通過反轉錄酶制備cDNA可以通過通用步驟來進行[例如Sambrook J,Russell Dff 《分子克隆實驗指南》(第三版)(MolecularCloning :A Laboratory Manual 3rd ed) (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York,2001)]。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用細胞裂解液直接進行RT反應，來代替使用從細胞提取和純 化的RNA進行反轉錄反應。(通過PCR方法擴增抗體基因)在通過PCR方法進行的抗體基因擴增中，優(yōu)選通過執(zhí)行兩次PCR反應來擴展抗體 基因的V區(qū)基因。
抗體分子由H鏈和L鏈的組合構成，并且在生殖細胞系中，人類抗體基因的H鏈由 約200種類型的V-區(qū)基因片段、約20種類型的D-片段和6種類型的J-片段構成。在分 化成B淋巴細胞后，各一種類型的V-、D-和J-片段通過基因重排(V/D/J重排)組合形成 了單個抗原結合位點。對于L鏈來說也是同樣。每個B淋巴細胞在細胞表面上表達一種類型的抗體分子。為了從抗原特異性B淋 巴細胞擴增抗原特異性抗體，需要使用與每個V-片段序列匹配的引物。[4]使用獲得的基因表達抗體的步驟如上所述，使用遺傳工程技術從細胞獲得編碼抗體重鏈(H)和輕鏈(L)的cDNA，產 生了將獲得的cDNA插入到用于抗體表達的載體的啟動子下游中的重組載體，并通過將該 載體導入宿主細胞獲得抗體表達細胞。通過將這些細胞在適合培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或通過將它 們給藥于動物以將細胞轉化成腹水腫瘤，并分離和純化培養(yǎng)溶液或腹水液，可以制備抗體。 這種用于抗體表達的載體是用于動物細胞的表達載體，其整合有作為人類抗體的恒定區(qū)(C 區(qū))的重鏈恒定區(qū)(CH)和輕鏈恒定區(qū)(CL)的編碼基因，并通過將人類抗體的CH和CL的 每個編碼基因插入到用于動物細胞的表達載體中來構建。作為人類抗體C區(qū)，CYl和CY4可用于人類抗體H鏈，C κ可用于人類抗體L鏈。 作為編碼抗體C區(qū)的基因，可以使用由外顯子和內含子構成的染色體DNA，并且可選地，也 可以使用cDNA。作為用于動物細胞的表達載體，可以使用任何載體，只要它能夠整合并表達 編碼抗體C區(qū)的基因即可。載體的實例包括pAGE107[Cytotechnology，3，133(1990)]、pAGE103[J. Biochem, 101,1307(1987)]、pHSG274 [Gene, 27，223 (1984) ]、pKCR[Proc. Natl.，Acad. Sci.，78， 1527 (1981)]和 pSGl β d2_4 [Cytotechnology，4，173 (1990)]。在載體中使用的用于在動 物中表達的啟動子和增強子的實例包括SV40的早期啟動子和增強子[J. Biochem，101， 1307 (1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR啟動子和增強子[Biochem. Biophys. Res. Comun.，149，960 (1987)]以及免疫球蛋白H鏈的啟動子[Cell，41，479 (1985)]和增強子 [Cell,33,717(1983)]ο對于用于表達的載體來說，可以使用其中抗體H鏈基因和L鏈基因存在于分開的 載體上的類型，或其中基因存在于同一個載體上的類型(串聯(lián)類型)。可以通過將上面提到的表達載體導入適合的宿主細胞來獲得穩(wěn)定生產抗體的轉 化株。用于將表達載體導入宿主細胞的方法包括電穿孔方法[JP-A(Kokai)H02-257891， Cytotechnology, 3,133 (1990) ]0對于用于導入表達載體的宿主細胞來說，可以使用 任何細胞，只要它們是能夠表達抗體的宿主細胞即可。實例包括小鼠SP2/0-iVg細胞 (ATCCCRL1581)、小鼠P!3X63-Ag8. 653細胞(ATCC CRL1580)、其中缺陷了二氫葉酸還原酶基 因(在后文中稱為 DHFR 基因)的 CHO 細胞[Proc. Natl. Acad. Sci.，77,4216 (1980)]，以及 大鼠 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 細胞(ATCC CRL1662，在后文中稱為 YB2/0 細胞)。[5]篩選具有所需性質的抗體的步驟在上述步驟中獲得的抗體可以使用蛋白A柱從轉化株的培養(yǎng)上清液純化(《抗體》 (第八章)(Antibodies，Chapter 8))。此外，其他用于普通蛋白的純化方法例如凝膠過濾、 離子交換層析和超濾，可以分開或組合使用。純化的重組抗體H鏈或L鏈或完整抗體分子 的分子量，通過聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE) [Nature, 227,680 (1970) ] ,Western印跡(《抗體》(第 12 章)(Antibodies, Chapter 8))等測定。該培養(yǎng)上清液中的抗體與流感病毒核蛋白結合的能力，使用流感病毒核蛋白包被 的96孔板通過ELISA方法測量。通過ELISA進行的測量可以如下進行。具體來說，將在 PBS中稀釋的流感病毒核蛋白(10yg/mL)以每孔50 μ L的量分發(fā)到96孔板中，將其在4°C 下留置過夜進行吸附。將孔用PBS清洗以除去非特異性結合，每孔400 μ L的量分發(fā)含有 3% BSA、0. 05%吐溫-20的PBS，并使其在室溫下反應2小時進行阻斷。也制備了沒有吸附 抗原的阻斷的孔作為陰性對照孔。然后，將孔用含有0. 吐溫-20的PBS(PBS-T)清洗，以 每孔50 μ L的量分發(fā)上面提到的細胞的培養(yǎng)上清液，并使其在室溫下反應2小時。將 孔用PBS-T清洗，以每孔50 μ L的量分發(fā)稀釋1000倍的堿性磷酸酶(ALP)標記的抗人類免 疫球蛋白抗體，并使其在室溫下反應2小時。將孔用PBS-T清洗，以每孔50 μ L的量分發(fā)溶 解在用于ALP底物的緩沖液[lOOmmol/L氯化鈉，5mmol/L氯化鎂，IOOmmol/L Tris緩沖液 (PH9.5)]中的lmg/mL對硝基苯基磷酸酯(ALP底物)，并在室溫下反應20分鐘后，在微孔 板讀板器上測量405nm處的吸光度。此外，為了檢查本發(fā)明的單克隆抗體與抗原結合的特異性，當向孔加入含有抗體 的細胞培養(yǎng)上清液時，將可溶性流感病毒核蛋白與培養(yǎng)上清液預溫育。將該混合溶液加 到孔中，以檢查抗體與吸附在孔上的重組核蛋白的結合是否被可溶性重組核蛋白競爭性抑 制。本發(fā)明中的人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體的具體實例，包括其中重鏈可 變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NOs :8到13任一個的氨基酸序列、并且輕鏈可變區(qū)的氨基 酸序列包含SEQ ID NOs :22到27任一個的氨基酸序列的人類抗A型流感病毒核蛋白單克 隆抗體。優(yōu)選實施方案是例如這樣的人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體，其包含的重 鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)由選自具有下列SEQ ID NO的氨基酸序列的組合的氨基酸序列的組 合構成-重鏈可變區(qū)的氨基酸序列和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別為SEQID NO 8和 22,SEQ ID NO 9 和 23,SEQ ID NO 10 和 24,SEQID NO 11 和 25,SEQ ID NO 12 和 26 以及 SEQ ID NO 13 和 27。本發(fā)明的人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的優(yōu)選實施方案的實例是包括 含有SEQ ID NO 14的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO 的氨基酸序列的輕鏈 可變區(qū)的人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體。如上所述，當在本發(fā)明中使用兩種抗流感病毒核蛋白抗體時，非人類抗流感病毒 核蛋白抗體可以與人類抗流感病毒核蛋白抗體一起使用。非人類動物的實例包括小鼠、大 鼠、兔等。非人類抗流感病毒核蛋白抗體可以是單克隆或多克隆抗體，并且它優(yōu)選是單克隆 抗體。非人類抗流感病毒核蛋白單克隆抗體可以通過例如上面提到的已知單克隆抗體生產 方法來生產。非人類抗流感病毒核蛋白單克隆抗體的實例包括小鼠抗A型流感病毒核蛋白 單克隆抗體、小鼠抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體、大鼠抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗 體、大鼠抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體、兔抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體和兔抗B 型流感病毒核蛋白單克隆抗體。在本發(fā)明中，不僅可以使用通過上面提到的已知單克隆抗 體生產方法生產的單克隆抗體，而且可以使用商業(yè)化產品作為非人類抗流感病毒核蛋白單 克隆抗體。可商購產品的具體實例包括M322211和M2110169(其由Fitzgerald制造)和
30ATCC HB-65，它們是可商購的小鼠抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體，以及M2110171(由 Fitzgerald制造)和41027 (由Capricorn制造)，它們是可商購的小鼠抗B型流感病毒核 蛋白單克隆抗體。所有在本文中引用的現有技術文獻在本說明書中引為參考。在本文下面，將參考實施例對本發(fā)明進行具體描述，但本發(fā)明不應該解釋為僅限 于這些實施例。
實施例[實施例1]用于檢測或定量流感病毒的裝置-堿性磷酸酶標記的抗體的制備堿性磷酸酶標記的抗體使用堿性磷酸酶標記試劑盒(由DojindoLaboratories 制造)以及在下面描述的實施例4中獲得的兩種類型的人類抗流感病毒核蛋白單克隆抗 體[23G285(A型)和23G327 (B型)]和兩種類型的小鼠抗流感病毒核蛋白單克隆抗體 [M2110169(A 型由 Fitzgerald 制造)和 M2110171(B 型；由 Fitzgerald 制造)]來制備。-用于使用堿性磷酸酶標記的抗體檢測或定量A型流感病毒的裝置將小鼠抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體M2110169和M322211 (由Fitzgerald 制造)以及人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體23G268的PBS溶液各自滴到切成 5cmx0. 5cm的濾紙(由Millipore制造)的區(qū)域上，單克隆抗體被固定，并將其用作檢測區(qū)。 從濾紙的下側(樣品供應區(qū))，將下列溶液以所述次序展開使用含有NonidetP-40的用于 反應的溶液稀釋的A型流感病毒溶液(H3N2 :A/Panama/2007/99)；堿性磷酸酶標記的小鼠 抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體M2110169或堿性磷酸酶標記的人類A型流感病毒核蛋 白單克隆抗體23G285的Tris溶液；以及BCIP/NBT(氯化硝基四氮唑藍)溶液(由Sigma 制造)。結果顯示在圖2-a中。具體來說，在使用人類抗流感病毒核蛋白抗體的固相抗體 (固定化在檢測區(qū)中的抗體)和標記抗體(用于標記的抗體)的組合中，在檢測區(qū)中觀察到 了顯著的藍斑。由此顯示，人類抗A型流感病毒核蛋白抗體可用于通過免疫層析檢測A型 流感病毒，并且人類抗A型流感病毒核蛋白抗體可用于A型流感病毒的高靈敏性檢測。此外，使用包含固定化并固定有人類抗A型流感病毒核蛋白抗體23G268的檢測 區(qū)和位于濾紙下側的樣品供應區(qū)的裝置(圖2-b)，檢查了本發(fā)明裝置的性能。將在含有 Nonidet P-40的用于反應的溶液中稀釋的A型流感病毒溶液(H3N2 :A/Panama/2007/99)、 在含有NonidetP-40的用于反應的溶液中稀釋的A型流感病毒溶液(Hmi =A/ Beijing/262/95)和在含有Nonidet P_40的用于反應的溶液中稀釋的B型流感病毒溶液 (B/Victoria/504/00)作為樣品各自從樣品供應區(qū)提供。然后，將其中堿性磷酸酶與人類抗 A型流感病毒核蛋白抗體23G285結合的堿性磷酸酶標記的抗體的Tris溶液，在每個裝置的 樣品供應區(qū)中展開，并將BCIP/NBT(氯化硝基四氮唑藍)溶液從展開溶液供應區(qū)進一步展 開。結果，如圖2-b中所示，只有在使用A型流感病毒溶液(H3N2 :A/Panama/2007/99)和A 型流感病毒溶液(Hmi :A/Beijing/262/95)的情況下，才能在檢測區(qū)中檢測到藍斑。因此， 這表明通過使用人類抗A型流感病毒核蛋白抗體23G268和人類抗A型流感病毒核蛋白抗 體23G285，可以特異性檢測A型流感病毒。
-用于使用堿性磷酸酶標記的抗體檢測或定量B型流感病毒的裝置將小鼠抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體M2110171(由Fitzgerald制造)和 41027(由Capricorn制造)的PBS溶液各自滴到切成5cmx0. 5cm的濾紙(由Millipore 制造)的區(qū)域上，單克隆抗體被固定，并將其用作檢測區(qū)。從濾紙的下側(樣品供應 區(qū))，將使用含有NonidetP-40的用于反應的溶液稀釋的A型流感病毒溶液(Hmi =A/ Beijing/262/95)和使用含有Nonidet P_40的用于反應的溶液稀釋的B型流感病毒溶液 (B/Victoria/504/00)作為樣品各自提供。然后，將其中堿性磷酸酶與人類抗B型流感病毒 核蛋白抗體23G327結合的堿性磷酸酶標記的抗體的Tris溶液，提供到每個裝置的樣品供 應區(qū)。然后將BCIP/NBT (氯化硝基四氮唑藍)溶液從展開溶液供應區(qū)展開。結果顯示在圖 3中。只有在使用B型流感病毒溶液(B/Victoria/504/00)的情況下才能在檢測區(qū)中觀察 到藍斑。此外，當人類抗B型流感病毒核蛋白抗體23G327被用作固定化在檢測區(qū)中 的抗體，并且其中堿性磷酸酶與小鼠抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體M2110171(由 Fitzgerald制造)結合的堿性磷酸酶標記的抗體被用作標記抗體時，也只有在使用B型流 感病毒溶液(B/Victoria/504/00)的情況下才能在檢測區(qū)中觀察到藍斑。當小鼠抗B型流感病毒核蛋白抗體41027(由Capricorn制造)被用作固定 化在檢測區(qū)中的抗體，并且其中堿性磷酸酶與小鼠抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體 M2110171 (由Fitzgerald制造)結合的堿性磷酸酶標記的抗體被用作標記抗體時，同樣只 有在使用B型流感病毒溶液(B/Victoria/504/00)的情況下才能在檢測區(qū)中觀察到藍斑。從上述結果顯示，人類抗B型流感病毒核蛋白抗體可用于通過免疫層析檢測B型 流感病毒。[實施例2]金膠體標記的抗體的制備使用在下面描述的實施例4中獲得的兩種類型的人類抗A型流感病毒核蛋白單 克隆抗體[23G272和23G447]以及一種類型的小鼠抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體 [M322211 (由Fitzgerald制造)]作為標記的抗體，制備了金膠體標記的抗體。具體來說， 將這些抗體的PBS溶液各自用Tris緩沖液替換，以制備這些抗體的Tris溶液，然后將其與 40nm金膠體(由BBhternational制造)混合并反應15分鐘。在反應后和用含有BSA 的Tris溶液阻斷后，通過離心除去未結合的單克隆抗體，并將得到的物質用作金膠體標記 的抗體。A型流感病毒的檢測使用金膠體標記的抗體檢測或定量A型流感病毒的裝置將抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體[23G312、23G494和M2110169(由 Fitzgerald制造)]作為固相抗體固定在切成5cmx0. 5cm的濾紙(由Millipore制造)區(qū) 域上，并將其用作檢測區(qū)。具體來說，將這些抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體的PBS溶 液各自滴加并固定，以制備檢測區(qū)。從濾紙的下側(樣品供應區(qū))展開0. ImL溶液，其中 混合有等量的使用含有Nonidet P-40的反應用溶液稀釋的A型流感病毒溶液(Hmi =A/ Beijing/262/95)和上面制備的金膠體標記抗體的Tris溶液。結果，使用所有抗體組合(固 相抗體和標記抗體的組合)時在檢測區(qū)中觀察到了明顯的紅色斑點。當對允許目測觀察斑點的時間進行比較時，在使用人類抗體作為固相抗體和標記抗體的組合中，與使用小鼠抗 體作為固相抗體和標記抗體的組合相比，所有組合的時間快大約兩倍。此外，為了檢查檢測靈敏度，將以各種不同濃度制備的A型流感病毒溶液(Hmi A/Beijing/262/95和H3N2 :A/Panama/2007/99)和金膠體標記的抗體，使用例如在表1和 表2中顯示的固相抗體和標記抗體組合展開，并目測觀察斑點的顏色。[表 1]
權利要求
1.一種用于檢測或定量樣品中的流感病毒的裝置，所述裝置包含檢測區(qū)、樣品供應區(qū) 和樣品遷移區(qū)，所述檢測區(qū)中人類抗流感病毒核蛋白抗體固定化在支持物上。
2.一種用于檢測或定量樣品中的流感病毒的裝置，所述裝置包含檢測區(qū)、樣品供應區(qū) 和樣品遷移區(qū)，所述檢測區(qū)中抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)固定化在支持物上，其中從 樣品供應區(qū)提供標記抗體，所述標記抗體中標記物與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體2)結 合，并且其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體。
3.一種用于檢測或定量樣品中的流感病毒的裝置，所述裝置包含檢測區(qū)、標記試劑區(qū)、 樣品供應區(qū)和樣品遷移區(qū)，所述檢測區(qū)中抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)固定化在支持物 上，所述標記試劑區(qū)中標記物與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體幻結合的標記抗體以允許遷 移的方式保持在支持物上，其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗 體。
4.權利要求2或3的裝置，其還包含至少一個選自展開溶液供應區(qū)、過量液體吸收區(qū)和 樣品供應驗證區(qū)的區(qū)域。
5.權利要求1到4任一項的裝置，其中人類抗流感病毒核蛋白抗體是人類抗A型流感 病毒核蛋白抗體。
6.權利要求5的裝置，其中人類抗A型流感病毒核蛋白抗體是人類抗A型流感病毒核 蛋白單克隆抗體，所述人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體與A型流感病毒核蛋白特異 性反應但是不與B型流感病毒核蛋白反應。
7.權利要求6的裝置，其中人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨 基酸序列包含SEQ ID NO :8到13任一個的氨基酸序列，人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆 抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO :22到27任一個的氨基酸序列。
8.權利要求1到4任一項的裝置，其中人類抗流感病毒核蛋白抗體是人類抗B型流感 病毒核蛋白抗體。
9.權利要求8的裝置，其中人類抗B型流感病毒核蛋白抗體是人類抗B型流感病毒核 蛋白單克隆抗體，所述人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體與B型流感病毒核蛋白特異 性反應但是不與A型流感病毒核蛋白反應。
10.權利要求9的裝置，其中人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨 基酸序列包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的輕鏈 可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列。
11.一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含固相，所述固相中人類抗流感病毒 核蛋白抗體固定在載體上。
12.一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含固相和試劑，所述固相中抗流感病 毒核蛋白抗體(抗體1)固定在載體上，所述試劑含有抗流感病毒核蛋白抗體(抗體2)，并 且其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體。
13.一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含固相和試劑，所述固相中抗流感病 毒核蛋白抗體(抗體1)固定在載體上，所述試劑含有標記抗體，所述標記抗體中標記物與 抗流感病毒核蛋白抗體(抗體幻結合，并且其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流 感病毒核蛋白抗體。
14.一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含固相和試劑，所述固相中人類抗流感病毒核蛋白抗體固定在載體上，所述試劑含有標記的抗原類似物，所述標記的抗原類似 物中標記物與流感病毒核蛋白抗原類似物結合。
15.一種用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含固相和試劑，所述固相中流感病毒 核蛋白抗原類似物固定在載體上，所述試劑含有標記抗體，所述標記抗體中標記物與人類 抗流感病毒核蛋白抗體結合。
16.權利要求11到15任一項的試劑盒，其中人類抗流感病毒核蛋白抗體是人類抗A型 流感病毒核蛋白抗體。
17.權利要求16的試劑盒，其中人類抗A型流感病毒核蛋白抗體是人類抗A型流感病 毒核蛋白單克隆抗體，所述人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體與A型流感病毒核蛋白 特異性反應但是不與B型流感病毒核蛋白反應。
18.權利要求17的試劑盒，其中人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體的重鏈可變區(qū) 的氨基酸序列包含SEQ ID NO :8到13任一個的氨基酸序列，人類抗A型流感病毒核蛋白單 克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO :22到27任一個的氨基酸序列。
19.權利要求11到15任一項的試劑盒，其中人類抗流感病毒核蛋白抗體是人類抗B型 流感病毒核蛋白抗體。
20.權利要求19的試劑盒，其中人類抗B型流感病毒核蛋白抗體是人類抗B型流感病 毒核蛋白單克隆抗體，所述人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體與B型流感病毒核蛋白 特異性反應但是不與A型流感病毒核蛋白反應。
21.權利要求20的試劑盒，其中人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的重鏈可變區(qū) 的氨基酸序列包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列。
22.一種用于檢測或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步驟(1)將樣品與固定在載體上的人類抗流感病毒核蛋白抗體反應；以及(2)測量在步驟(1)中產生的物理變化。
23.一種用于檢測或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步驟(1)將樣品與固定在載體上的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)反應，以在載體上形成 抗體1/流感病毒核蛋白復合物；(2)將步驟(1)中在載體上形成的復合物與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體幻反應；以及(3)測量在步驟O)中產生的物理變化；其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體。
24.權利要求22或23的方法，其中物理變化是濁度變化或質量變化。
25.一種用于檢測或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步驟(1)將樣品與固定在載體上的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)反應，以在載體上形成 抗體1/流感病毒核蛋白復合物；(2)將步驟(1)中在載體上形成的復合物與標記抗體(標記的抗體幻反應以在載體上 形成抗體1/流感病毒核蛋白/標記的抗體2復合物，所述標記抗體(標記的抗體幻中，標 記物與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體2、結合；(3)在步驟(2)后清洗載體以除去未與載體結合的物質；以及(4)測量步驟C3)后載體上的抗體1/流感病毒核蛋白/標記的抗體2復合物中的標記物；其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體。
26.一種用于檢測或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步驟(1)將樣品與標記抗體(標記的抗體幻反應，以形成標記的抗體2/流感病毒核蛋白復 合物，所述標記抗體(標記的抗體幻中標記物與抗流感病毒核蛋白抗體(抗體2)結合；(2)將步驟(1)中形成的復合物與固定在載體上的抗流感病毒核蛋白抗體(抗體1)反 應，以在載體上形成抗體1/流感病毒核蛋白/標記的抗體2復合物；(3)在步驟(2)后清洗載體以除去未與載體結合的物質；以及(4)測量步驟C3)后載體上的抗體1/流感病毒核蛋白/標記的抗體2復合物中的標記物；其中抗體1和抗體2中的至少一種是人類抗流感病毒核蛋白抗體。
27.一種用于檢測或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步驟(1)在同時存在標記的抗原類似物的情況下將樣品與固定在載體上的人類抗流感病毒 核蛋白抗體反應，以在載體上形成人類抗流感病毒核蛋白抗體/流感病毒核蛋白復合物和 人類抗流感病毒核蛋白抗體/標記的抗原類似物復合物，所述標記的抗原類似物中標記物 與流感病毒核蛋白抗原類似物結合；(2)在步驟(1)后清洗載體以除去未與載體結合的物質；以及(3)在步驟( 后測量載體上的復合物中的標記物。
28.一種用于檢測或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步驟(1)在同時存在標記抗體的情況下，將樣品與固定在載體上的流感病毒核蛋白抗原類 似物反應，以在載體上形成流感病毒核蛋白抗原類似物/標記抗體復合物，所述標記抗體 中標記物與人類抗流感病毒核蛋白抗體結合；(2)在步驟(1)后清洗載體以除去未與載體結合的物質；以及(3)在步驟( 后測量載體上的復合物中的標記物。
29.權利要求22到觀任一項的方法，其中人類抗流感病毒核蛋白抗體是人類抗A型流 感病毒核蛋白抗體。
30.權利要求四的方法，其中人類抗A型流感病毒核蛋白抗體是人類抗A型流感病毒 核蛋白單克隆抗體，所述人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體與A型流感病毒核蛋白特 異性反應但是不與B型流感病毒核蛋白反應。
31.權利要求30的方法，其中人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的 氨基酸序列包含SEQ ID NO :8到13任一個的氨基酸序列，人類抗A型流感病毒核蛋白單克 隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO :22到27任一個的氨基酸序列。
32.權利要求22到觀任一項的方法，其中人類抗流感病毒核蛋白抗體是人類抗B型流 感病毒核蛋白抗體。
33.權利要求32的方法，其中人類抗B型流感病毒核蛋白抗體是人類抗B型流感病毒 核蛋白單克隆抗體，所述人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體與B型流感病毒核蛋白特 異性反應但是不與A型流感病毒核蛋白反應。
34.權利要求33的方法，其中人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體的輕 鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列。
35.一種人類抗A型流感病毒核蛋白單克隆抗體，其與A型流感病毒核蛋白特異性反應 但是不與B型流感病毒核蛋白反應，其中重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID N0:8到13 任一個的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO :22到27任一個的氨基酸 序列。
36.一種人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體，其與B型流感病毒核蛋白特異性反應 但是不與A型流感病毒核蛋白反應。
37.一種人類抗B型流感病毒核蛋白單克隆抗體，其與B型流感病毒核蛋白特異性反應 但是不與A型流感病毒核蛋白反應，其中重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID N0:14的氨 基酸序列，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含SEQ ID NO :28的氨基酸序列。
全文摘要
一種用于檢測或定量樣品中的流感病毒的裝置，其包含帶有固定化在支持物上的人類抗流感病毒核蛋白抗體的檢測區(qū)、樣品供應區(qū)和樣品遷移區(qū)；以及用于檢測或定量流感病毒的試劑盒，其包含帶有固定在載體上的人類抗流感病毒核蛋白抗體的固相。
文檔編號G01N33/543GK102112878SQ200980130489
公開日2011年6月29日 申請日期2009年6月5日 優(yōu)先權日2008年6月6日
發(fā)明者守田和樹, 小澤龍彥, 小野仁, 岸裕幸, 村口篤, 池本守, 鵜澤耕治 申請人:SC World株式會社, 協(xié)和梅迪克斯株式會社, 國立大學法人富山大學