專利名稱：一種利用uplc快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用UPLC技術(shù)快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，屬于液相色譜分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
茄尼醇是一種無環(huán)四倍半萜醇，1956年首先從烤煙中提取并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。茄尼醇是一種天然化合物，廣泛存在于哺乳動物、高等植物和微生物體內(nèi)，尤其以煙草中含量最高。茄尼醇在生物化學(xué)中具有重要作用，具有非常強(qiáng)的吸收自由基的性能，本身可起到抗菌、消炎、止血抗?jié)冏饔煤洼^強(qiáng)的抗癌活性，因此是藥物合成的重要原料和泛醌類藥物 (如輔酶Q10、維生素K2和抗癌增效劑等)不可替代的關(guān)鍵中間體，具有極重要的醫(yī)藥開發(fā)價(jià)值。同時(shí)，茄尼醇作為煙草類脂組分中含量最高的組分，關(guān)于其對煙草品質(zhì)和安全性影響的研究很早就引起了人們廣泛的關(guān)注。煙草中的茄尼醇在煙草燃燒過程中，一部分直接轉(zhuǎn)移到主流煙氣中，一部分熱解產(chǎn)生多種香氣成分，有利于煙香味的改善，但另一方面，也會裂解產(chǎn)生多環(huán)芳烴(如致癌物PAHs)等有害物質(zhì)，對煙草制品的安全性具有很大影響。
目前，關(guān)于茄尼醇提取和純化的研究比較成熟，多已形成專利。近年來，涉及茄尼醇的專利申請件有201010523040. 6號《一種超聲酶法輔助提取茄尼醇的方法》、 200910234074. 0號《一種高純度茄尼醇的制備方法》、200810058493. 9號《一種利用茄尼醇粗膏精制高純度茄尼醇的方法》、200710034942. 1號《從廢次煙草中同時(shí)提取高純天然煙堿和茄尼醇的方法》、200510104279. 9號《從霉碎煙末中提取茄尼醇的預(yù)處理方法》、 200410022233. 8號《一種茄尼醇的精制方法》、93106316. 7號《用霉煙或碎煙末提取茄尼醇的工藝方法》等。
茄尼醇是長鏈半萜烯醇化合物，采用有機(jī)合成的手段制備非常困難，目前只能主要依靠從煙草中提取獲得。因此，建立一種高效、精確的快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，對于煙葉中茄尼醇的提取純化和煙葉安全性研究具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。煙葉中的茄尼醇提取方法主要是溶劑萃取，常用的萃取方式有索氏提取、熱回流萃取、機(jī)械震蕩萃取、超聲波萃取、超臨界流體萃取和微波萃取等。煙葉中的茄尼醇測定方法主要有薄層掃描法、氣相色譜法、液相色譜法和庫侖滴定法等，其中薄層掃描法常用作定性研究為主，氣相色譜法一般需要先對樣品進(jìn)行衍生化處理，步驟繁瑣，庫侖滴定法一般和薄層分離組合使用，步驟也較繁瑣。液相色譜法是測定茄尼醇含量應(yīng)用較多的一種方法，但多使用乙腈、甲醇、乙醇等兩種以上的洗脫劑作為流動相，其與萃取液(丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑)組成的差異，會對色譜峰形造成影響，影響定量的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明采用分析速度更快、流動相用量更省的超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)對茄尼醇進(jìn)行分析，將常規(guī)液相色譜分析需要約20min才能完成的分析時(shí)間縮短為5min，大大節(jié)約了分析時(shí)間和有機(jī)試劑用量；同時(shí)，方法對色譜的流動相組成等分析條件進(jìn)行了優(yōu)化，將煙草樣品用甲醇溶液萃取過濾后，同樣使用甲醇作為流動相，直接進(jìn)行超高效液相色譜分離測定，在與標(biāo)樣進(jìn)行比對保留時(shí)間定性的同時(shí)，采用比較標(biāo)樣和樣品的質(zhì)譜圖的方式對分析方法共流出的干擾峰進(jìn)行了檢測和排除，建立了煙葉中茄尼醇含量的UPLC分析技術(shù)。實(shí)踐證明，該方法操作簡便、快速準(zhǔn)確、靈敏度高，重現(xiàn)性好。目前尚無煙葉茄尼醇含量檢測方法的技術(shù)專利申請。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種快速測定煙葉中茄尼醇含量的UPLC分析方法，該方法的提取方法簡單，檢測操作簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，能準(zhǔn)確、 快速地測定煙葉樣品中茄尼醇的含量。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，將煙葉研磨成粉末，稱取50mg，將其置于50mL離心管中，加入25mL甲醇溶液，將離心管置于超聲波振動器中超聲萃取lOmin，取2mL萃取液，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾得到的清液，用超高效液相色譜進(jìn)行分析，測定煙葉中茄尼醇含量。
本發(fā)明所述的一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，超高效液相色譜的分析條件為ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜-二極管陣列檢測器，配Empower 2色譜工作站，色譜柱型號BEH C18，l. 7μπι，2. ImmX 50mm，色譜柱流動相為100%甲醇等度洗脫，流速為0. 4mL/min,柱溫30°C，進(jìn)樣量2 μ L，檢測波長為207nm，運(yùn)行時(shí)間5min。
本發(fā)明所述的一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，超高效液相色譜可串聯(lián)有三重四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜。
本發(fā)明所述的一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，三重四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析條件為大氣壓化學(xué)電離源，正離子模式檢測，電暈電流4 μ A，電暈針溫度 5000C，采樣錐孔電壓30V，提取錐孔電壓4V，源溫120°C，錐孔氣流速50L/Hr，脫溶劑氣流速 800L/Hr，采用MS模式，全掃描質(zhì)荷比范圍為100-1000，掃描時(shí)間5min。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，達(dá)到的有益效果
(1)建立了一個(gè)分析方法，此方法具有準(zhǔn)確性、靈敏度高及重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可以快速檢測煙葉中茄尼醇的含量。
對茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜分析，對峰面積(Y)與濃度(X，μ g/mL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y = 2. 11X104X+4. 12X103，r2 = 0.99924。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法在 0. 765 76. 5μ g/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。以信噪比計(jì)算知茄尼醇的檢測限為 7. 65ng/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)際煙草樣品中茄尼醇的含量，說明本方法的靈敏度高；
稱取50. OOOOmg相同初烤煙葉的煙末樣品10份，分成兩組，每組5份。其中一組按照本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)條件平行測定5次，計(jì)算方法的重復(fù)性；另外一組樣品分別加入0. 68mg 的茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)樣加入量、加標(biāo)前后樣品的測定量計(jì)算回收率。結(jié)果表明茄尼醇的精密度測定1^0%為2.62%，回收率為91. 1%，說明本發(fā)明的方法準(zhǔn)確性較高，重復(fù)性較好。
(2)本發(fā)明前處理方法簡單，對樣品萃取和分析的流動相采用同一種溶劑，不會對色譜峰造成影響，定量更準(zhǔn)確。
(3)本發(fā)明分析方法采用了分析速度更快、流動相用量更省的超高效液相色譜技術(shù)，優(yōu)化了流動相組成等分析條件，將常規(guī)液相色譜分析需要約15-20min才能完成的分析時(shí)間縮短為5min，大大節(jié)約了分析時(shí)間和有機(jī)試劑用量。
(4)本發(fā)明方法對分析目標(biāo)采用了超高效液相色譜和三重四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行準(zhǔn)確OhTOF-MQ定性和定量，排除了共流出雜質(zhì)的干擾。
質(zhì)譜比較定性法采用定性能力強(qiáng)的三重四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜Oi-TOF)對茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行了分析。在大氣壓化學(xué)電離源(APCI)、正離子模式下，使用TOF-MS對茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行分析，并比較了與二者對應(yīng)的扣除各自基線背景的質(zhì)譜圖。由圖可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品質(zhì)譜圖的特征離子峰一致，都是以m/z為613. 57的離子峰為基峰， 另外還存在豐度較低的m/z為631. 58的離子峰。
采用MassLynx 4. 1軟件對其分子式進(jìn)行推測，得到m/z為613. 57的離子峰的分子式為C45H73，是茄尼醇(C45H74O)失去一個(gè)H2O分子的加氫離子峰([M-H2CHH]+離子)，m/z 為631. 58的分子式為C45H75O,即茄尼醇分子的加氫離子([M+H]+離子)?？梢娫贏PCI正離子分析模式下，茄尼醇上的羥基并不穩(wěn)定，大部分極易失水脫去，形成脫水加氫離子峰，只有一小部分形成加氫離子峰。由實(shí)施例中的圖(2)可以確定本發(fā)明的色譜分離條件可以使樣品中的茄尼醇完全從基質(zhì)中分離出來，未受到共流出雜質(zhì)的干擾，本色譜條件分離效果良好。
說明書附圖


圖1 茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品(a)與煙樣提取樣品(b)的UPLC色譜圖對比圖。
圖2 茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品(a)與煙樣提取樣品(b)的質(zhì)譜圖對比圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明通過以下具體實(shí)例作進(jìn)一步描述，但并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1
不同類型煙草樣品中茄尼醇含量的快速測定
一、測定儀器和實(shí)施條件
1. 1色譜儀器及條件:ACQUITYUPLC H-CLASS超高效液相色譜_ 二極管陣列檢測器 (PDA)，配 Empower 2 色譜工作站，UPLC-XEVO Q-T0F，美國 Waters 公司，配 MassLynx 4. 1 質(zhì)譜軟件，色譜柱型號BEH C18(l. 7ym,2. ImmX 50mm)，美國Waters公司制造，色譜柱流動相為100%甲醇等度洗脫，流速為0. 4mL/min,柱溫30°C，進(jìn)樣量2 μ L，檢測波長為207nm， 運(yùn)行時(shí)間5min。
1. 2質(zhì)譜條件大氣壓化學(xué)電離源(APCI)，正離子模式檢測，電暈電流4 μ A，電暈針溫度500°C，采樣錐孔電壓30V，提取錐孔電壓4V，源溫120°C，錐孔氣流速50L/Hr，脫溶劑氣流速800L/Hr，采用MS模式，全掃描質(zhì)荷比(m/z)范圍為100-1000，掃描時(shí)間5min。
1.3輔助類儀器AB104-S型電子天平，感量O.OOOlg，瑞士 Merrier Toledo公司； T701DH型超聲波振蕩器，德國Elma公司；KS多用調(diào)速搖床振蕩器，北京科偉科技儀器有限公司；Milli-Q Element型超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；0. 22 μ m尼龍針式濾頭。
1.4試劑和樣品乙腈、甲醇、異丙醇為色譜純，美國默克公司；丙酮、無水乙醇等為分析純；茄尼醇對照品，純度為90%，廣州百靈威科技有限公司生產(chǎn)；煙葉樣品采集于貴州省某產(chǎn)區(qū)。
二、煙葉中茄尼醇含量的分析方法
2. 1樣品制備
將不同類型的初烤煙葉(共7份)、晾曬煙(共3份)和香料煙(共1份)的煙葉各自研磨成粉末，各稱取50. OOOOmg，將其分別置于50mL離心管中，各加入25mL甲醇溶液， 將離心管置于超聲波振動器中超聲萃取lOmin，取2mL萃取液，經(jīng)0. 22μπι濾膜過濾，以清液進(jìn)樣分析。
2. 2茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
準(zhǔn)確稱取5-10mg茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容至濃度為150. 00 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋配制成濃度為0. 765，1. 53，3. 825，7. 65，15. 30，30. 60，76. 50 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。對茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜分析，對峰面積(Y)與濃度(X，μ g/mL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y = 2. 11X104X+4. 12X103，r2 = 0.99924。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法在0. 765 76. 5 μ g/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，以信噪比為3計(jì)算知茄尼醇的檢測限為 7. 65ng/mL。
2. 3煙葉中茄尼醇的定性分析
2. 3. 1色譜保留值定性
色譜保留值定性法在相同的色譜條件下，當(dāng)流速為0. 4mL/min，煙葉中分離譜圖中組分的色譜保留時(shí)間和對應(yīng)的茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，均為2. 49min，且色譜柱壓較低，利于組分分離，說明煙葉中對應(yīng)時(shí)間的組分為茄尼醇，見附圖1。
2. 3. 2質(zhì)譜比較定性
質(zhì)譜比較定性法采用定性能力強(qiáng)的三重四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜Oi-TOF)對茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行了分析。在大氣壓化學(xué)電離源(APCI)、正離子模式下，使用TOF-MS對茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行分析，并比較了與二者對應(yīng)的扣除各自基線背景的質(zhì)譜圖。
茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品(a)與煙樣提取樣品(b)的質(zhì)譜圖對比，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品質(zhì)譜圖的特征離子峰一致，都是以m/z為613. 57的離子峰為基峰，另外還存在豐度較低的m/z為 631. 58的離子峰。
2. 4煙葉中茄尼醇的定量測定
在前述定性分析的基礎(chǔ)上，精確稱取煙葉樣品，提取、制備樣品溶液，按1. 1色譜條件，采用超高效液相色譜外標(biāo)法定量，以茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)品為相應(yīng)外標(biāo)物。三種不同類型煙葉樣品中茄尼醇含量的檢測結(jié)果見表1。
表1三種不同類型煙葉樣品中茄尼醇含量的測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，其特征在于將煙葉研磨成粉末，稱取50mg，將其置于50mL離心管中，加入25mL甲醇溶液，將離心管置于超聲波振動器中超聲萃取lOmin，取2mL萃取液，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾得到的清液，用超高效液相色譜進(jìn)行分析，測定煙葉中茄尼醇含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，其特征在于超高效液相色譜的分析條件為ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜-二極管陣列檢測器，配Empower 2色譜工作站，色譜柱型號BEH C18，1. 7 μ m，2. ImmX 50mm,色譜柱流動相為100%甲醇等度洗脫，流速為0.4mL/ min，柱溫30°C，進(jìn)樣量2yL，檢測波長為 207nm，運(yùn)行時(shí)間5min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，其特征在于超高效液相色譜可串聯(lián)有三重四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，其特征在于三重四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析條件為大氣壓化學(xué)電離源，正離子模式檢測，電暈電流4μ A，電暈針溫度500°C，采樣錐孔電壓30V，提取錐孔電壓4V，源溫120°C，錐孔氣流速50L/Hr，脫溶劑氣流速800L/Hr，采用MS模式，全掃描質(zhì)荷比范圍為100-1000，掃描時(shí)間 5min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用UPLC快速測定煙葉中茄尼醇含量的方法，將煙葉研磨成粉末，稱取50mg，將其置于50mL離心管中，加入25mL甲醇溶液，將離心管置于超聲波振動器中超聲萃取10min，取2mL萃取液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾得到的清液，用超高效液相色譜進(jìn)行分析，測定煙葉中茄尼醇含量，本發(fā)明具有提取方法簡單，檢測操作簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，能快速、準(zhǔn)確地測定煙葉樣品中茄尼醇的含量。
文檔編號G01N30/06GK102520079SQ201110367750
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者向章敏, 周淑平, 張婕, 汪云松, 耿召良, 蔡凱, 許冬青 申請人:貴州省煙草科學(xué)研究所