專利名稱：一種定向發(fā)射熒光成像檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光成像檢測裝置，尤其是涉及一種棱鏡型表面等離子體耦合定向發(fā)射熒光成像檢測裝置。
背景技術(shù)：
由于熒光分析技術(shù)在免疫分析、基因表達、藥物篩選、生物傳感、細胞成像等生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益增加，因此新型熒光技術(shù)及儀器的研究具有重大的意義和廣闊的發(fā)展前景。表面等離子體耦合定向發(fā)射熒光法(Surface Plasmon Coupled Directional Emission, SP⑶Ε)是近來所提出的新型熒光分析方法，其原理為在光滑的納米金屬表面 200nm范圍內(nèi)，激發(fā)態(tài)的熒光團與納米金屬表面自由電子產(chǎn)生的表面等離子體子耦合作用后，以熒光發(fā)射波長對應(yīng)的SPCDE角(即esrcDE)進入棱鏡基體輻射。作為一種新型熒光技術(shù)，SPCDE除具有提高熒光強度、量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性等金屬表面熒光所具備的優(yōu)點外，還展現(xiàn)出高度的角度定向發(fā)射、熒光發(fā)射P偏振、波長可分辨性以及有效的背景信號抑制等獨特的優(yōu)點。
根據(jù)激發(fā)方式的不同，SP⑶E可分為Kretschmarm模式(KR模式，如圖1所示)與反Kretschmarm模式(RK模式，如圖2所示)。在KR模式中，激發(fā)光源1通過棱鏡2以表面等離子體共振角θ SPK入射到金屬膜3表面，引發(fā)表面等離子體，產(chǎn)生瞬逝場，從而激發(fā)瞬逝場深度內(nèi)(約金屬表面幾百納米左右)的熒光團樣品膜4，激發(fā)態(tài)的熒光團與金屬表面的等離子體發(fā)生近場作用后，以一定的角度定向輻射。而在RK模式中，激發(fā)光源1直接照射到熒光團樣品膜4，激發(fā)表面的熒光團。近表面的激發(fā)態(tài)熒光分子和金屬3表面的等離子體發(fā)生近場作用，從而通過棱鏡2定向輻射。其中，以物鏡替換棱鏡，也可實現(xiàn)上述兩種模式的SP⑶E檢測。近來，有相關(guān)文獻報道物鏡型SP⑶E成像技術(shù)研究。該類工作是在商品化或自制的全內(nèi)反射顯微鏡裝置上，通過蒸鍍或溉射金屬層的載玻片實現(xiàn)。上述基于物鏡型的SPCDE成像系統(tǒng)，主要有以下不足之處1、裝置價格昂貴或結(jié)構(gòu)復(fù)雜。商品化的全內(nèi)反射顯微鏡價格極其昂貴，在自制的裝置中，需要使用高數(shù)值孔徑的物鏡或者是代替物鏡的拋物面狀元件，其中，高數(shù)值孔徑的物鏡價格不菲，而代替物鏡的拋物面狀元件采用注塑法制備，模具設(shè)計與加工困難且精密度要求高，并且不同發(fā)射波長的染料對應(yīng)不同形狀結(jié)構(gòu)的模具，制備及操作上相當復(fù)雜。2、基于物鏡型的成像系統(tǒng)，通過物鏡收集發(fā)射信號，所得到的光斑面積小，只能對待檢測樣品的較小區(qū)域成像，無法對感興趣區(qū)域?qū)崿F(xiàn)快速定位。3、物鏡型成像系統(tǒng)基本采用KR模式，由于瞬逝場激發(fā)作用的參與增強了激發(fā)熒光團的能量，強激發(fā)容易造成熒光團漂白或樣品的損傷。此外，采用KR模式時，只有以表面等離子體共振角入射的激發(fā)光才能引發(fā)表面等離子體產(chǎn)生瞬逝場，因此需調(diào)整入射光的角度；同時，激發(fā)光及其反射光與發(fā)射光的角度差較小，需要采用高性能的濾光片去除激發(fā)光或其反射光的干擾。因此基于物鏡型的SPCDE成像裝置在普通實驗室中較難以實現(xiàn)和推廣，限制了該成像技術(shù)的推廣與應(yīng)用。
中國專利CN101949847A公開一種無透鏡熒光成像檢測裝置，由左右激發(fā)光源、加熱板、微芯片、濾光片、CCD芯片和其外圍驅(qū)動電路組成。無透鏡熒光成像檢測裝置充分利用CCD芯片象素小、集成度高的特點，通過減少CCD芯片與反應(yīng)物質(zhì)的距離，建立了微芯片中檢測單元與CCD芯片各象素的對應(yīng)關(guān)系，不經(jīng)透鏡即可直接成像，大大減少了檢測裝置的體積和復(fù)雜程度。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在克服上述現(xiàn)有的檢測裝置的不足，提供一種結(jié)構(gòu)簡單、成本低廉、操作簡便、常規(guī)實驗室容易實現(xiàn)的定向發(fā)射熒光成像檢測裝置。
本發(fā)明設(shè)有激光擴束系統(tǒng)、樣品系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)；
所述激光擴束系統(tǒng)設(shè)有激光光源、顯微物鏡、針孔、平凸透鏡、衰減器和矩形光欄; 所述激光光源發(fā)出的激發(fā)光依次經(jīng)顯微物鏡、針孔和平凸透鏡擴束準直后，成為平行光束， 所述平行光束依次通過衰減器和矩形光欄，得到矩形光斑；
所述樣品系統(tǒng)設(shè)有旋轉(zhuǎn)臺、樣品架、棱鏡和光學(xué)石英基底，所述棱鏡置于樣品架上并固定在旋轉(zhuǎn)臺中心，所述光學(xué)石英基底表面設(shè)有納米級金屬薄膜，所述納米級金屬薄膜表面設(shè)有熒光傳感膜；所述光學(xué)石英基底與棱鏡之間涂有光學(xué)常數(shù)與兩者匹配的溶液；
所述檢測系統(tǒng)設(shè)有CCD旋轉(zhuǎn)臂、CCD接收器和濾光片，所述CCD旋轉(zhuǎn)臂固定在旋轉(zhuǎn)臺臺面，CCD旋轉(zhuǎn)臂可隨旋轉(zhuǎn)臺臺面360度自由旋轉(zhuǎn)，CCD旋轉(zhuǎn)臂連接在旋轉(zhuǎn)臺臺面，用于采集圖像的CCD接收器和濾光片設(shè)在CCD旋轉(zhuǎn)臂上。
所述激光光源可采用固定激光器，所述固體激光器可采用波長為405nm、473nm、 532nm、593. 5nm、808nm、980nm、1064nm或1342nm等的固體激光器，所述固體激光器的功率可為 50 500mw/cm2。
所述針孔的直徑可為0. 015 0. 025mm。
所述矩形光欄可由菲林圖案組成，所述矩形光欄的大小可為(5 15)mmX (5 15)mm。
所述熒光傳感膜可采用羅丹明B熒光傳感膜(IihB-PVA膜)等。
所述棱鏡可采用等腰直角三角棱鏡。
所述光學(xué)常數(shù)與兩者匹配的溶液可采用甘油等。
所述C⑶旋轉(zhuǎn)臂可通過螺絲等緊固部件固定在旋轉(zhuǎn)臺臺面上。
所述空間濾波器含有05 40) X倍物鏡。
所述CCD接收器可固定在CCD旋轉(zhuǎn)臂末端，而旋轉(zhuǎn)臂與旋轉(zhuǎn)臺臺面連接部分為中空部分。因此，樣品架通過此中空部位時，處于旋轉(zhuǎn)臺的正中心，且可獨立固定于光學(xué)平臺上，不隨旋轉(zhuǎn)臺一起轉(zhuǎn)動。
本發(fā)明所述樣品包括等腰直角三角棱鏡、樣品膜，其中樣品膜包括納米級的金屬薄膜和熒光傳感膜。棱鏡固定在樣品架上，納米級金屬薄膜附于光學(xué)石英基底，光學(xué)石英基底附于棱鏡上面，中間涂有折射率油層；熒光傳感膜附于納米級金屬薄膜表面。
激發(fā)光源經(jīng)空間濾波器擴束和平凸透鏡準直后，成為光強分布均勻的平行光束， 經(jīng)過矩形光欄后，光斑由圓形變成矩形。其中，采用菲林圖案作為矩形光欄，可根據(jù)實際需要，改變矩形窗口大小，制作簡便且成本低廉。矩形光斑直接照射在棱鏡表面的樣品膜上， 在棱鏡另一側(cè)產(chǎn)生定向發(fā)射。通過旋轉(zhuǎn)臺調(diào)整CCD檢測器的檢測角度，采集不同角度下的熒光發(fā)射信號，并以圖像格式存儲。將采集到的圖像通過軟件處理，獲取各個角度下對應(yīng)的熒光信號強度，實現(xiàn)數(shù)據(jù)分析。
與現(xiàn)有的表面等離子體耦合定向發(fā)射熒光成像的檢測裝置對比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點可對待測樣品的較大區(qū)域?qū)崿F(xiàn)同時的成像檢測，有效避免由于樣品局部不均勻等造成的影響，同時也可在同等條件下獲取樣品不同區(qū)域的相關(guān)信息，對待測樣品感興趣區(qū)域?qū)崿F(xiàn)快速定位；采用棱鏡作為耦合元件，代替價格昂貴的高數(shù)值孔徑物鏡或制作復(fù)雜的拋物面元件，不僅容易加工，價格便宜，而且可適用于不同發(fā)射波長染料的檢測。另外，本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，易于在普通實驗室中實現(xiàn)和推廣。


圖1為現(xiàn)有的表面等離子體耦合定向發(fā)射熒光的Kretschmarm(KR)模式示意圖。
圖2為現(xiàn)有的表面等離子體耦合定向發(fā)射熒光的Kretschmarm(RK)模式示意圖。
圖3為本發(fā)明實施例的結(jié)構(gòu)組成示意圖。
圖4為本發(fā)明實施例CCD旋轉(zhuǎn)臂的結(jié)構(gòu)組成示意圖。
圖5為本發(fā)明實施例在不同偏振發(fā)射條件下所采集的熒光成像數(shù)據(jù)。在圖5中， 實驗條件為以熒光染料微陣列為檢測樣品，在最強熒光發(fā)射角度，即檢測角度為58°時； 圖像21為在未加偏振器所采集到的熒光成像數(shù)據(jù)，圖像22為完全水平偏振所采集到的熒光成像數(shù)據(jù)，圖像23為完全垂直偏振所采集到的熒光成像數(shù)據(jù)。
圖6為在激發(fā)波長為532nm，發(fā)射波長為580nm狀態(tài)下的熒光強度角分布極坐標圖。在圖6中，極坐標為熒光檢測角度(° )，縱坐標為相對熒光強度Fluorescence Intensity ；圖中Exc.表示激發(fā)波長(532nm)；檢測角度θ F為58°。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明。
如圖3所示，本發(fā)明實施例設(shè)有激光擴束系統(tǒng)、樣品系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。
所述激光擴束系統(tǒng)設(shè)有激光光源5、顯微物鏡6、針孔7、平凸透鏡8、衰減器9和矩形光欄10 ；所述激光光源5發(fā)出的激發(fā)光依次經(jīng)顯微物鏡6、針孔7和平凸透鏡8擴束準直后，成為平行光束，所述平行光束依次通過衰減器9和矩形光欄10，得到矩形光斑。
所述樣品系統(tǒng)設(shè)有旋轉(zhuǎn)臺11、樣品架、棱鏡12和光學(xué)石英基底，所述棱鏡12置于樣品架上并固定在旋轉(zhuǎn)臺11中心，所述光學(xué)石英基底表面設(shè)有納米級金屬薄膜13，所述納米級金屬薄膜13表面設(shè)有熒光傳感膜14 ；所述光學(xué)石英基底與棱鏡12之間涂有光學(xué)常數(shù)與兩者匹配的溶液(如甘油)。
所述檢測系統(tǒng)設(shè)有CXD旋轉(zhuǎn)臂15、(XD接收器16和濾光片17，所述CXD旋轉(zhuǎn)臂15 固定在旋轉(zhuǎn)臺11臺面，CCD旋轉(zhuǎn)臂15可隨旋轉(zhuǎn)臺11臺面360度自由旋轉(zhuǎn)，CCD旋轉(zhuǎn)臂15 連接在旋轉(zhuǎn)臺11臺面，用于采集圖像的CCD接收器16和濾光片17設(shè)在CCD旋轉(zhuǎn)臂15上。
所述激光光源可采用固定激光器，所述固體激光器可采用波長為405nm、473nm、 532nm、593. 5nm、808nm、980nm、1064nm或1342nm等的固體激光器，所述固體激光器的功率可為50 500mW/cm2。所述針孔的直徑可為0. 015 0. 025mm。所述矩形光欄可由菲林圖案組成，所述矩形光欄的大小可為(5 15)mmX (5 15)mm。所述棱鏡可采用等腰直角三角棱鏡。所述CCD旋轉(zhuǎn)臂可通過螺絲等緊固部件固定在旋轉(zhuǎn)臺臺面上。所述空間濾波器含有(25 40) X倍物鏡。所述CCD接收器可固定在CCD旋轉(zhuǎn)臂末端，而旋轉(zhuǎn)臂與旋轉(zhuǎn)臺臺面連接部分為中空部分。因此，樣品架通過此中空部位時，處于旋轉(zhuǎn)臺的正中心，且可獨立固定于光學(xué)平臺上，不隨旋轉(zhuǎn)臺一起轉(zhuǎn)動。
參見圖4，CXD旋轉(zhuǎn)臂15通過4個緊固螺絲18固定在旋轉(zhuǎn)臺11臺面。CXD旋轉(zhuǎn)臂15與旋轉(zhuǎn)臺11連接部位的正中心19為中空部位，樣品架通過此中空部位，處于旋轉(zhuǎn)臺 11的正中心，且可獨立固定于光學(xué)平臺上，當CCD旋轉(zhuǎn)臂15隨旋轉(zhuǎn)臺11轉(zhuǎn)動時，樣品架始終保持不動。C⑶接收器16的固定溝槽20可方便調(diào)整CXD接收器16的位置。
本實施例以羅丹明B熒光傳感膜(IihB-PVA膜)為檢測對象。
所述納米級金屬薄膜可采用真空濺射法制備，具體方法如下在潔凈的石英基底表面濺射厚度為2nm的鉻膜作為粘附層，再濺射厚度為50nm金膜，即得納米級光滑金屬薄膜。
所述熒光傳感膜可采用旋涂法制備，具體方法如下在納米級光滑金屬薄膜表面旋轉(zhuǎn)鍍膜上含有羅丹明B的PVA膜，結(jié)合光漂白方法，制備所需的熒光傳感膜。
固體激光器5波長可采用532nm，功率約為250mW/cm2 (波長的選擇由檢測的熒光染料的激發(fā)波長決定)，其發(fā)出的激光經(jīng)40X倍顯微物鏡6和孔徑為Φ0. 025mm的針孔7 組成的空間濾波器擴束和平凸透鏡8準直后，成為光強分布均勻的平行光束。調(diào)整衰減器 9，對平行光束進行衰減，直至得到合適的光強(避免造成熒光的光漂白，同時保證在C⑶上獲取清晰的成像)。菲林圖案形成的矩形光欄10大小為7mmX 7mm，將擴束準直后的平行光束由圓形光斑變成矩形光斑。
在SPCDE成像中，光斑直接照射在熒光傳感膜14，此時光斑的面積大小由矩形光欄決定。調(diào)整樣品架，使矩形光斑垂直照射熒光傳感膜14表面，從而激發(fā)染料分子。激發(fā)態(tài)的染料分子與納米金屬薄膜13表面產(chǎn)生的等離子體作用后，在等腰直角三角棱鏡12另一側(cè)產(chǎn)生定向發(fā)射，通過濾光片17后，輻射到CXD接收器16。
固定CXD接收器16的位置后，調(diào)整CXD接收器的成像透鏡直至CXD接收器16上呈現(xiàn)清晰的圖像。通過轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)臺11，改變CXD旋轉(zhuǎn)臂15的角度，從而實現(xiàn)CXD接收器16 采集不同檢測角度下的SPCDE成像信息，以圖像格式存儲。采集到的圖像用Image J處理， 獲取各個圖像的信號強度并加以分析。
以本發(fā)明所述基于棱鏡型表面等離子體耦合定向發(fā)射熒光成像裝置進行羅丹明B 熒光傳感膜14的成像檢測，考察其信號角度分布。分析不同檢測角度下所獲取的熒光成像信息，結(jié)果顯示，在檢測角度為58°時，熒光發(fā)射信號最強，具有顯著的信號角度分布。此外，用熒光染料微陣列樣品進行熒光偏振性檢測，在最強熒光發(fā)射角度，即檢測角度為58° 時檢測，對比在不同偏振發(fā)射條件下所采集到的熒光成像信息，結(jié)果證實SPCDE中的熒光發(fā)射信號是垂直偏振的，即P偏振。因此，該裝置滿足SPCDE的實驗要求，可用于表面等離子體耦合定向發(fā)射熒光的成像檢測。圖5為檢測角度為58°時，在不同偏振發(fā)射下所采集到的熒光成像信息。其中圖像21為在未加偏振器所采集到的熒光成像數(shù)據(jù)，圖像22為完全水平偏振所采集到的熒光成像數(shù)據(jù)，圖像23為完全垂直偏振所采集到的熒光成像數(shù)據(jù)。
圖6為在激發(fā)波長為532nm，發(fā)射波長為580nm狀態(tài)下的熒光強度角分布極坐標圖，最強的熒光發(fā)射信號所對應(yīng)的檢測角度。
權(quán)利要求
1.一種定向發(fā)射熒光成像檢測裝置，其特征在于設(shè)有激光擴束系統(tǒng)、樣品系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)；所述激光擴束系統(tǒng)設(shè)有激光光源、顯微物鏡、針孔、平凸透鏡、衰減器和矩形光欄；所述激光光源發(fā)出的激發(fā)光依次經(jīng)顯微物鏡、針孔和平凸透鏡擴束準直后，成為平行光束，所述平行光束依次通過衰減器和矩形光欄，得到矩形光斑；所述樣品系統(tǒng)設(shè)有旋轉(zhuǎn)臺、樣品架、棱鏡和光學(xué)石英基底，所述棱鏡置于樣品架上并固定在旋轉(zhuǎn)臺中心，所述光學(xué)石英基底表面設(shè)有納米級金屬薄膜，所述納米級金屬薄膜表面設(shè)有熒光傳感膜；所述光學(xué)石英基底與棱鏡之間涂有光學(xué)常數(shù)與兩者匹配的溶液；所述檢測系統(tǒng)設(shè)有CCD旋轉(zhuǎn)臂、CCD接收器和濾光片，所述CCD旋轉(zhuǎn)臂固定在旋轉(zhuǎn)臺臺面，CCD旋轉(zhuǎn)臂可隨旋轉(zhuǎn)臺臺面360度自由旋轉(zhuǎn)，CCD旋轉(zhuǎn)臂連接在旋轉(zhuǎn)臺臺面，用于采集圖像的CCD接收器和濾光片設(shè)在CCD旋轉(zhuǎn)臂上。
2.如權(quán)利要求1所述的一種定向發(fā)射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述激光光源采用固定激光器。
3.如權(quán)利要求2所述的一種定向發(fā)射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述固體激光器采用波長為 405nm、473nm、532nm、593. 5nm、808nm、980nm、1064nm 或 1342nm 的固體激光器， 所述固體激光器的功率可為50 500mW/cm2。
4.如權(quán)利要求1所述的一種定向發(fā)射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述針孔的直徑為 0.015 0. 025mm。
5.如權(quán)利要求1所述的一種定向發(fā)射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述矩形光欄由菲林圖案組成，所述矩形光欄的大小為(5 15)mmX (5 15)mm。
6.如權(quán)利要求1所述的一種定向發(fā)射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述熒光傳感膜采用羅丹明B熒光傳感膜。
7.如權(quán)利要求1所述的一種定向發(fā)射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述棱鏡采用等腰直角三角棱鏡。
8.如權(quán)利要求1所述的一種定向發(fā)射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述光學(xué)常數(shù)與兩者匹配的溶液采用甘油。
9.如權(quán)利要求1所述的一種定向發(fā)射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述CCD旋轉(zhuǎn)臂通過螺絲等緊固部件固定在旋轉(zhuǎn)臺臺面上。
10.如權(quán)利要求1所述的一種定向發(fā)射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述CCD接收器固定在CCD旋轉(zhuǎn)臂末端，而旋轉(zhuǎn)臂與旋轉(zhuǎn)臺臺面連接部分為中空部分。
全文摘要
一種定向發(fā)射熒光成像檢測裝置，涉及一種熒光成像檢測裝置。設(shè)有激光擴束、樣品和檢測系統(tǒng)；激光擴束系統(tǒng)設(shè)有激光光源、顯微物鏡、針孔、平凸透鏡、衰減器和矩形光欄；激光光源發(fā)出的激發(fā)光依次經(jīng)顯微物鏡、針孔和平凸透鏡擴束準直后成為平行光束，平行光束依次經(jīng)衰減器和光欄得光斑；樣品系統(tǒng)設(shè)旋轉(zhuǎn)臺、樣品架、棱鏡和光學(xué)石英基底，棱鏡置于樣品架上并固定在旋轉(zhuǎn)臺中心，石英基底表面設(shè)有納米級金屬薄膜，薄膜表面設(shè)有熒光傳感膜；石英基底與棱鏡之間涂有溶液；檢測系統(tǒng)設(shè)有CCD旋轉(zhuǎn)臂、CCD接收器和濾光片，CCD旋轉(zhuǎn)臂固定在旋轉(zhuǎn)臺臺面，CCD旋轉(zhuǎn)臂連接在旋轉(zhuǎn)臺臺面，用于采集圖像的CCD接收器和濾光片設(shè)在CCD旋轉(zhuǎn)臂上。
文檔編號G01N21/64GK102539404SQ20121000225
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者劉倩, 曹爍暉, 李耀群, 蔡偉鵬 申請人:廈門大學(xué)