專(zhuān)利名稱(chēng)：篩查結(jié)直腸癌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種篩查結(jié)直腸癌的試劑盒。
背景技術(shù)：
結(jié)直腸癌近年在全球發(fā)病率直線(xiàn)上升，近些年來(lái)每年超過(guò)百萬(wàn)人死于結(jié)直腸癌。 由于結(jié)直腸癌的發(fā)生與生活習(xí)慣，特別是飲食習(xí)慣密切相關(guān)，因此近年隨著我國(guó)人民生活水平的逐漸提高，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和致死率在我國(guó)飛速增長(zhǎng)。研究表明，結(jié)直腸癌的早期診斷尤為關(guān)鍵，早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的五年存活率高達(dá)90%，而目前結(jié)直腸癌早期發(fā)現(xiàn)率不足40%，一旦轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌患者存活率不足10%。目前診斷結(jié)直腸癌的“金標(biāo)準(zhǔn)”是結(jié)腸鏡，目前公認(rèn)，年齡大于50歲的人均應(yīng)該接受腸鏡篩查。美國(guó)以及歐洲等權(quán)威部門(mén)指出，對(duì)于具有家族性高發(fā)病史或由于個(gè)人習(xí)慣患病風(fēng)險(xiǎn)高的人來(lái)說(shuō)腸鏡篩查尤為重要。但是，目前我國(guó)還不具備在體檢中廣泛進(jìn)行腸鏡檢測(cè)的條件，受試者的痛苦也不言而喻。目前在我國(guó)體檢中廣泛推行結(jié)腸鏡檢測(cè)不現(xiàn)實(shí)。因此，篩選血漿中結(jié)直腸癌早期診斷分子標(biāo)記成為現(xiàn)今研究熱點(diǎn)之一。人們已經(jīng)確定了大量存在于結(jié)腸組織、糞便或血清中的生物標(biāo)記物，如癌胚抗原 (CEA)等，來(lái)用于結(jié)腸癌的早期診斷和預(yù)測(cè)，但是目前大多數(shù)推薦的篩查方法的靈敏度和特異性都在50%以下。最近，還相繼報(bào)道了一些組織中、糞便中和血清中的結(jié)直腸癌分子標(biāo)記，但其效果也遠(yuǎn)低于結(jié)腸鏡。例如，如果用糞便DNA特異的甲基化位點(diǎn)作為標(biāo)記，當(dāng)特異度達(dá)到90%時(shí)，靈敏度只有50%。而且這種檢測(cè)肯定不如血液標(biāo)記物的檢測(cè)方便，因此目前更多的醫(yī)務(wù)工作者希望開(kāi)發(fā)血液中結(jié)直腸癌診斷的標(biāo)志物。有研究報(bào)道，血清結(jié)腸癌特異抗原CCSA-3和CCSA-4可能成為結(jié)直腸癌診斷的標(biāo)志物，其檢測(cè)效果還需證實(shí)。每年大約報(bào)道有上千種腫瘤分子標(biāo)記物，但是最后應(yīng)用于臨床的分子標(biāo)志物幾乎沒(méi)有，它們存在的缺陷集中在樣本量較少(< 30)，沒(méi)有在不同種族或獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中被確實(shí)等。更關(guān)鍵的是， 在樣本收集、預(yù)處理和目標(biāo)分子抽提過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一讓這些分子標(biāo)志物很難被推廣。綜上，由于腸鏡費(fèi)用較高、痛苦較大和操作要求高等原因降低了病人愿意做該項(xiàng)檢查的程度，致使很多病人拖到晚期成了不治之癥。因此急切需要開(kāi)發(fā)出一種可應(yīng)用于結(jié)直腸癌早期篩查的簡(jiǎn)單可靠、無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的大通量檢查方法。具有生物活性的溶血磷脂分子在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用日益引起科學(xué)家的關(guān)注。這其中一些溶血磷脂分子，比如LPC、鞘氨醇磷酸膽堿 (sphingosylphosphorylcholine, SPC)、溶血磷月旨酸(lysophosphatidic acid, LPA)、鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-l-phosphate，SlP)和鞘磷脂(sphingomyelin，SM)可以調(diào)節(jié)諸如細(xì)胞增殖、遷移、形態(tài)發(fā)生和吸附在內(nèi)的多種活動(dòng)。因此這些溶血磷脂分子可以參與血管生成、傷口愈合、免疫、動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和成瘤等過(guò)程的調(diào)節(jié)。這些脂類(lèi)分子的代謝與上述生理病理進(jìn)程息息相關(guān)，其中SPC和SM均可以轉(zhuǎn)化為S1P，而LPC通過(guò)ATX催化可以生成 LPA, SlP和LPA作為功能活性脂類(lèi)分子對(duì)腫瘤的調(diào)節(jié)功能十分顯著。隨著生物活性脂類(lèi)分子與腫瘤相關(guān)性認(rèn)識(shí)的深入和脂類(lèi)分子檢測(cè)手段的進(jìn)步，一些生物活性脂類(lèi)分子被認(rèn)為可能作為腫瘤早期診斷的生物標(biāo)記物?；谥?lèi)分子，特別是生物活性脂類(lèi)分子的重要生理和病理意義，國(guó)際上新近提出了脂類(lèi)組學(xué)和功能脂類(lèi)組學(xué)的概念。除現(xiàn)有的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)之外，脂類(lèi)組學(xué)的研究和發(fā)展必將在腫瘤的早期診斷和治療中發(fā)揮重要的作用。此夕卜，腫瘤發(fā)生早期生物活性脂類(lèi)分子代謝的異?？梢詮娜说捏w液(血清/血漿)中直接檢測(cè)到。與之相比，傳統(tǒng)的組織樣本檢測(cè)不僅創(chuàng)傷大，而且對(duì)腫瘤難以做到早期診斷。與基因和蛋白標(biāo)記物相比，作為代謝標(biāo)記物，生物活性脂類(lèi)分子的檢測(cè)更方便、快捷，適于臨床推廣。因此，建立靈敏、準(zhǔn)確和高效的生物活性脂類(lèi)分析方法，篩選針對(duì)不同腫瘤特異的生物活性脂類(lèi)分子標(biāo)記物，對(duì)腫瘤早期診斷具有重要的意義。不同于蛋白質(zhì)和多肽，開(kāi)發(fā)針對(duì)于簡(jiǎn)單的溶血磷脂分子，如LPA和LPC的抗體非常困難。因此簡(jiǎn)單的ELISA檢測(cè)方法對(duì)于這些溶血磷脂分子來(lái)說(shuō)很難適用。一些傳統(tǒng)的脂類(lèi)分析方法曾被成功的應(yīng)用于溶血磷脂的分析檢測(cè)，如thin-layer chromatography (TLC)， phosphorous determination，禾口 gas chromatography (GC)等。{B是，這些方^去中有白勺分析過(guò)程復(fù)雜，工作量大，有的則靈敏度差，不能高效地分析體液中含量低的溶血磷脂，而且沒(méi)有任何一種方法能夠簡(jiǎn)單的用于分離和分析溶血磷脂的亞型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩查或輔助篩查結(jié)直腸癌的試劑盒。本發(fā)明提供的篩查或輔助篩查結(jié)直腸癌的試劑盒，包括用于檢測(cè)磷脂含量的裝置和由所述磷脂含量建立的比對(duì)卡；所述磷脂為SPC、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、 20:0LPC、22:6LPC和 22:0LPC。所述由磷脂含量建立的比對(duì)卡為如下1)或2):1)為比對(duì)卡A和比對(duì)卡B中的任意一種；2)比對(duì)卡A和比對(duì)卡B;所述比對(duì)卡A由直線(xiàn)1、橫坐標(biāo)1和縱坐標(biāo)1組成；所述直線(xiàn)1 為 0.023X 飽和 LPC 總量+5.96X18:2LPC% +17. 06XSPC 總量= 9. 66 ；所述橫坐標(biāo)1 為 0. 023X 飽和 LPC 總量 +5. 96X18:2LPC% ；所述縱坐標(biāo)1為SPC總量(含量)；上述直線(xiàn)1為縱坐標(biāo)1關(guān)于橫坐標(biāo)1的一次函數(shù)；所述比對(duì)卡B由直線(xiàn)2、橫坐標(biāo)2和縱坐標(biāo)2組成；所述直線(xiàn)2 為 11. 41X18:2LPC% +7. 43X 18: ILPC% +0. 024X 飽和 LPC 總量= 14. 58 ；所述橫坐標(biāo)2 為 11.406X18:2LPC%+7.43X18:1LPC% ；
所述縱坐標(biāo)2為飽和LPC總量；上述直線(xiàn)2為縱坐標(biāo)2關(guān)于橫坐標(biāo)2的一次函數(shù)；所述18:2LPC%* 18:2LPC含量占不飽和LPC總量的百分比；所述18: ILPC含量占不飽和LPC總量的百分比。所述飽和LPC 總量為 14:0LPC、16:0LPC、18:0LPC、20:0LPC 禾口 22:0LPC 含量的總和；所述不飽和LPC總量為18:2LPC、18:1LPC、20:4LPC和22:6LPC含量的總和；上述各磷脂含量的單位均為micro Μ。所述用于檢測(cè)磷脂含量的裝置為液質(zhì)聯(lián)用儀。所述液質(zhì)聯(lián)用儀為 Applied Bio systems S ciex 3200Qtrap mass spectrometer, Applied Biosystems Sciex, Ontario, Canada, ^^llllifffi^^ ] ^ 比為90 10 0. 1的甲醇、水、氨水混合物；所述檢測(cè)采用的流動(dòng)相的流速為0. 2ml/min,檢測(cè)LPC、SPC、L-PAF和SM各亞類(lèi)時(shí)不需要柱子，檢測(cè)LPA、SlP的柱子型號(hào)為 C18HPLC column (TARGA C18 5 μ Μ, 2. Imm IDXlOmm TR-0121-C185，Higgins Analytical, Southborough, ΜΑ)。所述磷脂含量為離體血液中磷脂含量。所述試劑盒由所述用于檢測(cè)磷脂含量的裝置和所述由所述磷脂含量建立的比對(duì)卡組成。所述的試劑盒在制備檢測(cè)待測(cè)樣本結(jié)直腸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述待測(cè)樣本來(lái)源于人，具體來(lái)源于亞洲人，尤其優(yōu)選為中國(guó)人。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明在中國(guó)人群中(正常對(duì)照和腫瘤患者各120例)深入研究了一系列磷脂分子的含量(LPC，LPA, SPC, SIP, SM和溶血血小板因子L-PAF)，特別是含有膽堿基團(tuán)的脂類(lèi)分子(LPC、SMJP SPC)各種亞類(lèi)在血漿中的含量，深入探究這些脂類(lèi)在結(jié)直腸癌中的變化，進(jìn)而開(kāi)發(fā)有效的結(jié)直腸癌早期診斷分子標(biāo)記，建立了分子檢測(cè)模型，根據(jù)此模型檢測(cè)的靈敏度和特異度可達(dá)88 %和80 % (或者83 %和86 % )，利用這些脂類(lèi)分子對(duì)結(jié)直腸癌和正常對(duì)照的區(qū)分效果優(yōu)于近些年來(lái)很多研究結(jié)直腸癌早期診斷的標(biāo)志物。本發(fā)明的蹄選中，以 Electro-spray ionization mass spectrometry (ESI-MS，三重四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜儀)為基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)了定量檢測(cè)人血漿中溶血磷脂分子的技術(shù)。質(zhì)譜檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是(1)靈敏度高、重復(fù)性好；( 它不僅可以同時(shí)檢測(cè)大量不同種類(lèi)的脂類(lèi)分子，而且可以分辨同一種脂類(lèi)分子的不同亞型；(3)檢測(cè)血漿樣本具有取樣方便、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)，而且所需樣本量只有10-50μ1 ;(4)利用一臺(tái)自動(dòng)取樣器，這種檢測(cè)技術(shù)就可以變得非常自動(dòng)化。因此，這種檢測(cè)方法在臨床應(yīng)用上具有很大的潛力。應(yīng)用相關(guān)技術(shù)，2007年，美國(guó)印第安納大學(xué)徐燕教授實(shí)驗(yàn)室首先報(bào)道LPC可以作為美國(guó)人群的結(jié)直腸癌早期診斷標(biāo)志物。 但是對(duì)于癌癥早期診斷分子標(biāo)記而言，跨種族和人群的獨(dú)立檢測(cè)至關(guān)重要，多數(shù)分子標(biāo)記在種群中存在極大差異。本發(fā)明的研究結(jié)果表明一系列含有膽堿基團(tuán)的磷脂分子可以作為篩查結(jié)直腸癌的分子標(biāo)記。這些脂類(lèi)分子的代謝對(duì)于結(jié)直腸癌的進(jìn)程起到關(guān)鍵作用。每年有超過(guò)100，000 篇關(guān)于“cancer marker"的文章發(fā)表，但是這些分子標(biāo)志物最后被應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)的少之又少，不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果存在諸多差異，樣本收集方式差異、提取方式的差異以及復(fù)雜的檢測(cè)方法等都是這些標(biāo)志物難以被應(yīng)用的原因。而本發(fā)明的對(duì)這些含膽堿基團(tuán)的脂類(lèi)分子檢測(cè)過(guò)程，取樣、提取和檢測(cè)高度標(biāo)準(zhǔn)化，而且利用幾十微升血漿和簡(jiǎn)單的有機(jī)試劑就可以準(zhǔn)確定量這些脂類(lèi)分子在血漿中的含量，可以推行到例行體檢中，并將其作為結(jié)直腸癌早期診斷的篩查指標(biāo)，即指血化驗(yàn)就有可能為結(jié)直腸癌診斷提供初步依據(jù)。


圖1為飽和LPC、不飽和LPC、總LPC以及(16 0+18 0) SM含量在正常對(duì)照和結(jié)直腸腫瘤患者體內(nèi)的含量變化趨勢(shì)圖2為利用LPC區(qū)分中國(guó)人群中正常對(duì)照與結(jié)直腸癌患者模型圖3為利用LPC和SPC區(qū)分中國(guó)人群中正常對(duì)照與結(jié)直腸癌患者模型
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、篩查結(jié)直腸癌的試劑盒的構(gòu)建一、分子模型的建立1、血液收集、脂類(lèi)分子提取和檢測(cè)1)研究對(duì)象所有樣本收集于2007年5月-2010年5月，樣品來(lái)自全軍第二炮兵總醫(yī)院、北京醫(yī)院、北京大學(xué)第二附屬醫(yī)院。早晨取空腹病人血液進(jìn)行預(yù)處理。此項(xiàng)目經(jīng)過(guò)hstitutional Review Board審批，所有受試者簽署知情同意書(shū)。表1概括了研究對(duì)象的基本情況受試健康樣本和腫瘤樣本中男性比例分別為 68%和59% ；健康對(duì)照和腫瘤患者的年齡分別為55. 2士7. 5和55. 7士 11. 8，取樣年齡沒(méi)有
顯著性差異。表2概括了所取120例腫瘤樣本的基本情況53% (64/120)為結(jié)腸腫瘤，其余樣本大多為直腸腫瘤。超過(guò)75%的腫瘤為T(mén)3/T4期(93/120)，大約一半的腫瘤為NO (58/120， 48% )。從分化程度上看，絕大多數(shù)腫瘤為中高度分化(82/120,69% )。表1研究對(duì)象的基本情況表2癌癥患
者的基本情況
權(quán)利要求
1.一種篩查或輔助篩查結(jié)直腸癌的試劑盒，包括用于檢測(cè)磷脂含量的裝置和由所述磷脂含量建立的比對(duì)卡；所述磷脂為 SPC、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、20:0LPC、 22:6LPC和 22:OLPC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于 所述由磷脂含量建立的比對(duì)卡為如下1)或2)；1)為對(duì)比卡A和比對(duì)卡B中的任意一種；2)對(duì)比卡A和比對(duì)卡B；所述比對(duì)卡A由直線(xiàn)1、橫坐標(biāo)1和縱坐標(biāo)1組成；所述直線(xiàn) 1 為 0. 023X 飽和 LPC 總量 +5. 96X18:2LPC% +17. 06X SPC 總量=9. 66 ； 所述橫坐標(biāo)1為0. 023X飽和LPC總量+5. 96X18:2LPC% ； 所述縱坐標(biāo)1為SPC總量； 所述比對(duì)卡B由直線(xiàn)2、橫坐標(biāo)2和縱坐標(biāo)2組成；所述直線(xiàn) 2 為 11. 41X18:2LPC% +7. 43X18:1LPC% +0. 024X 飽和 LPC 總量=14. 58 ； 所述橫坐標(biāo) 2 為 11. 406X18:2LPC% +7. 43X18:1LPC% ； 所述縱坐標(biāo)2為飽和LPC總量；所述18:2LPC%* 18:2LPC含量占不飽和LPC總量的百分比； 所述18: ILPC含量占不飽和LPC總量的百分比。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述飽和 LPC 總量為 14:0LPC、16:0LPC、18:0LPC、20:0LPC 和 22: OLPC 含量的總和； 所述不飽和LPC總量為18:2LPC、18:1LPC、20:4LPC和22:6LPC含量的總和。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑盒，其特征在于 所述用于檢測(cè)磷脂含量的裝置為液質(zhì)聯(lián)用儀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)采用的流動(dòng)相為體積比為90 10 0.1的甲醇、水、氨水混合物； 所述磷脂含量為離體血液中磷脂含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒由所述用于檢測(cè)磷脂含量的裝置和所述由所述磷脂含量建立的比對(duì)卡組成。
7.權(quán)利要求1-6中所述的試劑盒在制備檢測(cè)待測(cè)樣本結(jié)直腸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述待測(cè)樣本來(lái)源于人，具體來(lái)源于亞洲人，尤其優(yōu)選為中國(guó)人。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種篩查結(jié)直腸癌的試劑盒。本發(fā)明提供的篩查結(jié)直腸癌的試劑盒，包括用于檢測(cè)磷脂含量的裝置和由磷脂含量建立的比對(duì)卡；所述磷脂為SPC、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、20:0LPC、22:6LPC和22:0LPC。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明開(kāi)發(fā)有效的結(jié)直腸癌早期診斷分子標(biāo)記，建立了分子檢測(cè)模型，根據(jù)此模型可以檢測(cè)靈敏度和特異度可達(dá)88％和80％，利用這些脂類(lèi)分子對(duì)結(jié)直腸癌和正常對(duì)照的區(qū)分效果優(yōu)于近些年來(lái)很多研究結(jié)直腸癌早期診斷的標(biāo)志物。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102565267SQ20121000302
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者叢羽生, 宋建穩(wěn), 張俊杰, 徐燕, 李頌, 桑建利 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)