一種igf家族蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種IGF家族蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片，該芯片包括：玻片，采用活性氨基丙基硅烷包被；多個(gè)微陣列，經(jīng)芯片點(diǎn)陣將所述微陣列固定在所述玻片上；墊片，將各個(gè)微陣列分隔成不同的雜交區(qū)；其中，每個(gè)所述微陣列上含有對(duì)應(yīng)于一種胰島素樣生長(zhǎng)因子家族蛋白的一種特異性抗體；還包括以下反應(yīng)試劑：用生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體混合液；封閉液，采用5％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物；采用熒光染料HyLight555（激發(fā)波長(zhǎng)550nm，發(fā)射波長(zhǎng)566nm）標(biāo)記的鏈霉親和素。本發(fā)明所述的IGF家族蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片能完成目前ELISA、免疫印跡法等傳統(tǒng)方法不能完成的多項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)、高通量、高靈敏度的檢測(cè)，非常適合于針對(duì)IGF-1信號(hào)通路眾多目標(biāo)蛋白多聯(lián)同時(shí)檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種IGF家族蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片，特別是涉及一種針對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)家族蛋白的聯(lián)合檢測(cè)芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)信號(hào)系統(tǒng)通過(guò)與細(xì)胞膜上的特異受體之間的相互作用在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面扮演著重要的生理作用。IGF信號(hào)系統(tǒng)由以下三部分組成:配體(IGF-1、IGF-2和胰島素)、受體(IGF-1R、IGF-2R、胰島素受體(IR)、IGF-1R/IR雜合受體(HR)等)和六種IGF高親和性結(jié)合蛋白(IGFBP1-6)。其中，IGF-1和IGF-2在胎兒發(fā)育和出生后生活中通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌機(jī)制發(fā)揮重要的作用。IGF的有絲分裂，分化和抗凋亡特性是主要由IGF-1R來(lái)介導(dǎo)的。當(dāng)IGF-1或IGF-2與受體結(jié)合時(shí)，IGF-1R可通過(guò)MEK/ERK或PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)分別促進(jìn)細(xì)胞增殖或抑制細(xì)胞凋亡，因而增加致癌風(fēng)險(xiǎn)。在IGF家族的蛋白中，IGF-1、IGF-1R和IGF-2與癌癥形成是正相關(guān)的。與之相反，IGFBP是重要的代謝調(diào)控因子，這類(lèi)蛋白通過(guò)與IGF的高親和性結(jié)合來(lái)抑制IGF的活性。在細(xì)胞表面，各種IGFBP競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合IGF，以阻遏IGF與IGF-1R的相互作用。
[0003]IGF信號(hào)系統(tǒng)在理論界和醫(yī)藥公司都深受關(guān)注。研究表明，IGF系統(tǒng)的失調(diào)被認(rèn)為是包括糖尿病、心血管基部以及多種癌癥的關(guān)鍵因素。臨床研究的結(jié)果使人們關(guān)注IGF系統(tǒng)的復(fù)雜性。其中一個(gè)主要的復(fù)雜方面是:這些配體不是僅僅能高親和性地結(jié)合到它們系統(tǒng)自身的受體上，例如，IGF-1結(jié)合到IGF-1R上，它們還可以與其他受體以不同的親和性進(jìn)行交互，例如，IGF-2可結(jié)合IGF-1R、IR和HR。血清IGF水平是由更高親和性的IGFBP來(lái)調(diào)控的。不同的IGFBP與IGF-1和IGF-2之間的相對(duì)親和性是不同的。除了與IGF結(jié)合的功能之外，IGFBP還進(jìn)行其他不依賴于IGF的功能。
[0004]許多以IGF-1R作為靶向目標(biāo)的藥物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床前期都有明顯的效果，但真正能用于臨床藥用的卻鳳毛麟角。其中的主要問(wèn)題在于目前的實(shí)驗(yàn)方法只是針對(duì)單一的IGF蛋白進(jìn)行試驗(yàn)，而缺乏對(duì)多種IGF家族蛋白所組成的系統(tǒng)的綜合研究。為了獲得藥物功效的完整了解，未來(lái)以IGF為標(biāo)靶的抗癌藥物開(kāi)發(fā)非常需要充分考慮IGF系統(tǒng)的所有復(fù)雜性.為了深入了解IGF信號(hào)通路的復(fù)雜性，需要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)IGF家族蛋白。但是，目前的實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)芯片并不能滿足這一需求。
[0005]對(duì)于細(xì)胞因子和信號(hào)蛋白的定性檢測(cè)和定量檢測(cè)，目前常用的是的檢測(cè)方法主要包括:酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫印跡法(western blot)、流式細(xì)胞儀(Flow-Cytometry)等。酶聯(lián)免疫吸附法具有靈敏度高、特異性較好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但一次試驗(yàn)只能檢測(cè)單一指標(biāo)，通量低、成本高。放射免疫分析雖然靈敏度高，是容易造成放射性污染。免疫印跡法能測(cè)定分子的大小，且無(wú)非特異的反應(yīng)，但操作繁瑣，靈敏度低，且只能檢測(cè)單一指標(biāo)。流式細(xì)胞儀能在細(xì)胞水平上檢測(cè)細(xì)胞因子的水平，但卻存在低靈敏、低通量、高成本等缺點(diǎn)。上述方法能用于檢測(cè)單個(gè)蛋白表達(dá)水平，但卻不適合IGF多蛋白系統(tǒng) 的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的操作繁瑣、檢測(cè)指標(biāo)單一、靈敏度低等不足，本發(fā)明的目的在于提供一種新型的針對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)信號(hào)通路的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片，以實(shí)現(xiàn)IGF家族蛋白的高通量、高靈敏度、高特異性和低成本檢測(cè)，具有廉價(jià)、便利、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、標(biāo)本用量少、能在普通實(shí)驗(yàn)室推廣和規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明所述的IGF家族蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片包括:玻片，采用活性氨基丙基硅烷包被；多個(gè)微陣列，經(jīng)芯片點(diǎn)陣將所述微陣列固定在所述玻片上；墊片，將各個(gè)微陣列分隔成不同的雜交區(qū)；其中，每個(gè)所述微陣列上含有對(duì)應(yīng)于一種胰島素樣生長(zhǎng)因子家族蛋白的一種特異性抗體；還包括以下反應(yīng)試劑:用生物素標(biāo)記的抗體混合液；封閉液，采用5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物，包含若干種所述的胰島素樣生長(zhǎng)因子家族蛋白混合物，以及不同濃度的用封閉液稀釋的標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物；采用熒光染料HyLight 555(激發(fā)波長(zhǎng)550nm,發(fā)射波長(zhǎng)566nm)標(biāo)記的鏈霉未和素。
[0008]根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的進(jìn)一步特征，每個(gè)所述玻片上固定有16個(gè)獨(dú)立的微陣列，每個(gè)微陣列具有4個(gè)重復(fù)點(diǎn)樣的抗體點(diǎn)。
[0009]根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的進(jìn)一步特征，所述玻片上還包括固定有生物素標(biāo)記的抗牛I gG抗體的陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)。
[0010]根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的進(jìn)一步特征，所述特異性抗體包括針對(duì)如下胰島素樣生長(zhǎng)因子家族蛋白的抗體:IGF-ι、IGF-1R、IGF-2、IGF-2R、IGFBP-U IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-6 和胰島素。
[0011]根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的進(jìn)一步特征，所述玻片在芯片點(diǎn)陣時(shí)，控制溫度為70-75F，濕度為40-45%，并在點(diǎn)陣后室溫靜置過(guò)夜。
[0012]根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的進(jìn)一步特征，所述玻片在芯片點(diǎn)陣后，通過(guò)以下步驟進(jìn)行處理:用含5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液封閉，各個(gè)獨(dú)立的微陣列分別用細(xì)胞培養(yǎng)上清、人類(lèi)血清、組織裂解液或者不同濃度的封閉液稀釋的標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物孵育過(guò)夜，洗滌去除不結(jié)合的蛋白，然后在各個(gè)微陣列中加入生物素標(biāo)記的相應(yīng)的抗體，孵育，洗滌，用熒光染料HyLight 555 (激發(fā)波長(zhǎng)550nm，發(fā)射波長(zhǎng)566nm)標(biāo)記的鏈霉親和素室溫孵育，洗滌，干燥。
[0013]根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的進(jìn)一步特征，所述玻片在完成實(shí)驗(yàn)操作后通過(guò)以下步驟來(lái)計(jì)算待測(cè)樣品中各種胰島素樣生長(zhǎng)因子家族蛋白的濃度:用激光掃描儀在Cy3波長(zhǎng)下掃描成像；用數(shù)據(jù)提取軟件找到各個(gè)微陣列點(diǎn)并輸出數(shù)碼讀數(shù)；用配套芯片處理軟件自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)樣品中各個(gè)蛋白的濃度.根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的進(jìn)一步特征，所述玻片的實(shí)驗(yàn)操作通過(guò)以下步驟進(jìn)行:用含5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液封閉，各個(gè)獨(dú)立的微陣列分別用待測(cè)樣品或者不同濃度的用封閉液稀釋的標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物孵育過(guò)夜，洗滌去除不結(jié)合的蛋白，然后在各個(gè)微陣列中加入生物素標(biāo)記的抗體混合液，孵育，洗滌，再用熒光染料HyLight 555 (激發(fā)波長(zhǎng)550nm,發(fā)射波長(zhǎng)566nm)標(biāo)記的鏈霉未和素室溫孵育，洗漆，干燥。
[0014]根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的進(jìn)一步特征，所述完成實(shí)驗(yàn)操作的玻片通過(guò)以下步驟來(lái)計(jì)算待測(cè)樣品中各種胰島素樣生長(zhǎng)因子家族蛋白的濃度:用激光掃描儀掃描成像；用數(shù)據(jù)提取軟件找到各個(gè)微陣列點(diǎn)并輸出數(shù)碼讀數(shù)；用配套芯片處理軟件自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)樣品中各個(gè)蛋白的濃度。
[0015]所述的待測(cè)樣品選自:細(xì)胞培養(yǎng)上清、人類(lèi)血清、組織裂解液。
[0016]本發(fā)明所述的IGF家族蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片是經(jīng)過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)的抗體芯片，能完成目前ELISA、免疫印跡法等傳統(tǒng)方法不能完成的多項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)、高通量、高靈敏度的檢測(cè)，非常適合于針對(duì)IGF-1信號(hào)通路眾多目標(biāo)蛋白多聯(lián)同時(shí)檢測(cè)，有利于更好的說(shuō)明IGF-1家族成員在生物體內(nèi)的相互關(guān)系和作用，為生物制藥公司更有效的藥物篩選提供重要的實(shí)驗(yàn)工具。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1顯示IGF家族蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的特異性。熒光染料標(biāo)記的鏈霉親和素孵育后，用Genepix 4000B掃描得到每個(gè)芯片的特異信號(hào)。信號(hào)強(qiáng)度通過(guò)Genepix軟件解析，并顯示芯片的特異性。
[0018]圖2顯示IGF家族蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)抗原在各自的濃度范圍內(nèi)以3倍梯度稀釋?zhuān)⑴c芯片孵育。使用IGF-1R專(zhuān)用的分析軟件分析數(shù)據(jù)和建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2 > 0.97)。
[0019]圖3A和圖3B分別顯示IGF-2R (A)和IGFBP-2 (B)在癌癥組織(T)及其癌旁組織(P)樣本中差異表達(dá)。制備來(lái)自25例病人的肝癌組織及其癌旁組織裂解液，并與IGF信號(hào)抗體芯片孵育，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。IGF-2R和IGFBP-2在肝癌組織及其癌旁組織中的平均濃度具有顯著差異性，P〈0.05 (T檢驗(yàn))。
[0020]圖3C顯示了 IGF家族蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的代表性數(shù)據(jù)。
[0021]圖4 A顯示使用Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)IGFBP-2的表達(dá)的代表性數(shù)據(jù)；圖4B顯示使用回歸分析檢測(cè)抗體芯片和Western blot的相關(guān)性；圖4C顯示抗體芯片和ELISA的相關(guān)性。
[0022]圖5顯示IGF-2R (A)和IGFBP-2 (B)在癌癥組織(T)及其癌旁組織(P)樣本中的正態(tài)分布。來(lái)自25例病人的肝癌組織及其癌旁組織裂解液被制備，并與IGF信號(hào)抗體芯片孵育，然后統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0024]實(shí)施例一:本發(fā)明所述的IGF家族蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片的構(gòu)建
為了開(kāi)發(fā)本發(fā)明所述的IGF家族蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片，首先從供應(yīng)商篩選現(xiàn)有抗體產(chǎn)品或通過(guò)自行開(kāi)發(fā)合適的抗體對(duì)。然后將這些抗體對(duì)用于創(chuàng)建一個(gè)芯片以同時(shí)檢測(cè)IGF家族的10種蛋白質(zhì)。
[0025]材料
所有抗體購(gòu)買(mǎi)于R&D Systems公司(美國(guó)明尼蘇達(dá)州Minneapolis)或者由RayBiotech公司(美國(guó)佐治亞州Norcross)制備。IGF家族蛋白來(lái)自R&D公司或由RayBiotech公司制
【權(quán)利要求】
1.一種IGF家族蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片，所述檢測(cè)芯片包括: 玻片，采用活性氨基丙基硅烷包被； 多個(gè)微陣列，經(jīng)芯片點(diǎn)陣將所述微陣列固定在所述玻片上； 墊片，將各個(gè)微陣列分隔成不同的雜交區(qū)； 其中，每個(gè)所述微陣列上含有對(duì)應(yīng)于一種胰島素樣生長(zhǎng)因子家族蛋白的一種特異性抗體； 還包括以下反應(yīng)試劑: 檢測(cè)抗體混合液，所述抗體采用生物素標(biāo)記； 封閉液，采用5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液； 標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物，包含若干種所述的胰島素樣生長(zhǎng)因子家族蛋白混合物以及用封閉液稀釋的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物； 采用熒光染料HyLight 555 (激發(fā)波長(zhǎng)550nm，發(fā)射波長(zhǎng)566nm)標(biāo)記的鏈霉親和素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片，其特征在于:每個(gè)所述玻片上固定有至少16個(gè)獨(dú)立的微陣列，每個(gè)微陣列具有4個(gè)重復(fù)點(diǎn)樣的抗體點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片，其特征在于:所述玻片上還包括固定有生物素標(biāo)記的抗牛IgG抗體的陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片，其特征在于:所述特異性抗體包括針對(duì)如下胰島素樣生長(zhǎng)因子家族蛋白的抗體:IGF-1、IGF-1R、IGF-2、IGF-2R、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-6 和胰島素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片，其特征在于:所述玻片在芯片點(diǎn)陣時(shí)，控制溫度為70-75F，濕度為40-45%，并在點(diǎn)陣后室溫靜置過(guò)夜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片，其特征在于，所述玻片的實(shí)驗(yàn)操作通過(guò)以下步驟進(jìn)行:用含5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液封閉，各個(gè)獨(dú)立的微陣列分別用待測(cè)樣品或者不同濃度的用封閉液稀釋的標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物孵育過(guò)夜，洗滌去除不結(jié)合的蛋白，然后在各個(gè)微陣列中加入生物素標(biāo)記的抗體混合液，孵育，洗滌，再用熒光染料HyLight555 (激發(fā)波長(zhǎng)550nm,發(fā)射波長(zhǎng)566nm)標(biāo)記的鏈霉未和素室溫孵育，洗漆，干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片，其特征在于，所述完成實(shí)驗(yàn)操作的玻片通過(guò)以下步驟來(lái)計(jì)算待測(cè)樣品中各種胰島素樣生長(zhǎng)因子家族蛋白的濃度:用激光掃描儀掃描成像；用數(shù)據(jù)提取軟件找到各個(gè)微陣列點(diǎn)并輸出數(shù)碼讀數(shù)；用配套芯片處理軟件自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)樣品中各個(gè)蛋白的濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的蛋白聯(lián)合檢測(cè)芯片，其特征在于，所述的待測(cè)樣品選自:細(xì)胞培養(yǎng)上清、人類(lèi)血清、組織裂解液。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103698529SQ201210366988
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月28日
【發(fā)明者】黃若磐, 毛應(yīng)清, 陳蘊(yùn)如 申請(qǐng)人:廣州瑞博奧生物科技有限公司