專利名稱：快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測干細(xì)胞的試劑盒，尤其涉及一種快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干 細(xì)胞的試劑盒。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞(stem cells)是人體及其各種組織細(xì)胞的初始來源,其最顯著的生物學(xué)特 征是既有自我更新和不斷增殖的能力，又有多向分化的潛能。胚胎干細(xì)胞(ES)來源于受精 卵發(fā)育分化的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖脊一種多能細(xì)胞系，它具有與早期胚胎細(xì)胞相似的 形態(tài)特征和很強(qiáng)的分化能力，可以無限增殖并分化成為全身200多種細(xì)胞類型，從而可以 進(jìn)一步形成機(jī)體的任何組織或器官。
有關(guān)ES細(xì)胞和治療性克隆的研究一直存在激烈的倫理學(xué)爭論，近年來國外學(xué) 者通過體細(xì)胞體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS細(xì)胞)系。日本京都大學(xué)物質(zhì)-細(xì)胞統(tǒng)合系統(tǒng)據(jù)點(diǎn)iPS細(xì)胞研究中心長山中伸 彌與英國發(fā)育生物學(xué)家約翰· ·戈登因在細(xì)胞核重新編程研究領(lǐng)域的杰出貢獻(xiàn)，因此獲得 2012年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。山中伸彌是誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(iPS cell)創(chuàng)始人之一。 2007年，他的研究團(tuán)隊(duì)通過對小鼠的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)人體表皮細(xì)胞使之具有胚胎干細(xì)胞活 動(dòng)特征的方法。此方法誘導(dǎo)出的干細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)樾呐K和神經(jīng)細(xì)胞，為研究治療目前多種心 血管絕癥提供了巨大助力。這一研究成果在全世界被廣泛應(yīng)用，因?yàn)槠涿獬耸褂萌梭w胚 胎提取干細(xì)胞的倫理道德制約。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的研究成果在干細(xì)胞研究領(lǐng) 域中無疑是具有里程碑意義的突破，多種體細(xì)胞經(jīng)過體外的培養(yǎng)和誘導(dǎo)均可轉(zhuǎn)變成為具有 多向分化潛能的干細(xì)胞，并且證明了幾種已知的轉(zhuǎn)錄因子可以使已分化的體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為未 分化的狀態(tài)，從而闡明了細(xì)胞的巨大可塑性。由于iPS細(xì)胞研究不再使用人類早期胚胎，故 卵母細(xì)胞來源的難題得到了合理的解決，倫理學(xué)的爭論將隨之平息，自體iPS細(xì)胞來源的 細(xì)胞移植給患者自身也將使免疫排斥反應(yīng)的難題迎刃而解。
研究證實(shí)采用體外導(dǎo)入0ct4、Sox2、c_Myc和Klf4等4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可將小鼠體細(xì) 胞直接重構(gòu)成為ES細(xì)胞樣的多潛能細(xì)胞，因此，這類細(xì)胞被命名為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞 (iPS細(xì)胞)。同樣，轉(zhuǎn)染上述因子或0ct4、Sox2、Nanog、LIN28等4個(gè)因子也能夠使人類體 細(xì)胞重構(gòu)為iPS細(xì)胞，后者與人類ES細(xì)胞的基本特征相似。
干細(xì)胞的鑒定尤其是成體干細(xì)胞鑒定是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一個(gè)難題，目前，對很 多種成體干細(xì)胞并沒有一個(gè)一致的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。但在誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的鑒 定方面，采用標(biāo)志物0ct4、Sox2、Nanog和LIN28來鑒定人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞，用標(biāo)志物 0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4來鑒定小鼠誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)基本上在本領(lǐng)域得到了公認(rèn)。然 而，目前對這些生物標(biāo)志物的檢測是分開進(jìn)行的，這不僅耗費(fèi)時(shí)間，而且各標(biāo)志物之間的定 量關(guān)系不能準(zhǔn)確地得到反映。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種可在一次試驗(yàn)中同時(shí)檢測全部多潛能干 細(xì)標(biāo)志物，從而實(shí)現(xiàn)快速鑒定多潛能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的試劑盒。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種快速檢測誘導(dǎo)性多潛能 干細(xì)胞的試劑盒，包括用于快速檢測誘導(dǎo)性人或鼠多潛能干細(xì)胞的檢測板、示蹤液、陽性 對照、陰性對照、樣品稀釋液、洗滌液和顯色液。
一種快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，包括用于快速檢測誘導(dǎo)性人或鼠 多潛能干細(xì)胞的檢測板、生物標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)液、反應(yīng)液、親和素探測液、樣品稀釋液、洗滌液和 顯色液。
所述的檢測板是固定了 0ct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何兩種及以上的人生物標(biāo) 志物抗原的固相；所述的固相為酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽、生物芯片的基片、免疫印跡膜、磁珠；所 述抗原為所述生物標(biāo)志物的整個(gè)蛋白或僅含相關(guān)蛋白的部分氨基酸序列多肽。
所述含有0ct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何兩種及以上的人生物標(biāo)志物的抗原組 合被包被在酶標(biāo)盤的同一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)。
所述含有0ct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何兩種及以上人生物標(biāo)志物的抗原被分 別包被在同一個(gè)酶標(biāo)盤或分開的酶標(biāo)盤的不同的反應(yīng)槽內(nèi)。
所述檢測板是固定了任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物標(biāo) 志物的特異抗體的固相；所述固相為酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽、蛋白芯片用玻片或塑膠片、免疫印跡 膜、磁珠；所述的特異抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
所述含有任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物標(biāo)志物的特異 抗體的組合被包被在酶標(biāo)盤的同一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)，所述包被酶標(biāo)盤包括使用直接或間接的方 法將所述的特異抗體包被在酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽內(nèi)。
所述含有任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物標(biāo)志物的特異 抗體被分別包被在同一個(gè)酶標(biāo)盤或分開酶標(biāo)盤的不同的反應(yīng)槽內(nèi)；所述包被酶標(biāo)盤包括使 用直接或間接的方法將所述的特異抗體包被在酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽內(nèi)。
所述檢測板固定了 0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何兩種及以上的小鼠生物標(biāo)志物 抗原的固相；所述的固相為酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽、生物芯片的基片、免疫印跡膜、磁珠；所述抗 原是所述生物標(biāo)志物的整個(gè)蛋白或僅含相關(guān)蛋白的部分氨基酸序列多肽。
含有0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何兩種及以上的小鼠生物標(biāo)志物抗原的組合被 包被在酶標(biāo)盤的同一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)。
含有0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何兩種及以上的小鼠生物標(biāo)志物抗原被分別包 被在同一個(gè)酶標(biāo)盤或分開的酶標(biāo)盤的不同的反應(yīng)槽內(nèi)。
所述檢測板是固定了含有任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、c_Myc、Klf4小鼠 生物標(biāo)志物的特異抗體的固相；所述的固相為酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽、蛋白芯片的基片、免疫印跡 膜、磁珠；所述的特異抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
含有任何兩種及以上識別0ct4、Sox2.c-Myc.Klf4小鼠生物標(biāo)志物的特異抗體的 組合被包被在酶標(biāo)盤的同一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)；所述預(yù)包被酶標(biāo)盤包括使用直接或間接的方法將 所述的特異抗體包被在酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽內(nèi)。
含有任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、c-Myc, Klf4小鼠生物標(biāo)志物的特異抗體 被分別包被在同一個(gè)酶標(biāo)盤或分開酶標(biāo)盤的不同的反應(yīng)槽內(nèi)；所述的預(yù)包被酶標(biāo)盤包括使用直接或間接的方法將所述的特異抗體包被在酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽內(nèi)。
本發(fā)明的有益效果是可在一次試驗(yàn)中同時(shí)檢測多個(gè)或誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞標(biāo)志 物，從而實(shí)現(xiàn)快速鑒定多潛能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。本發(fā)明由于能在同試驗(yàn)中同時(shí)檢測多個(gè) 誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞標(biāo)志物，使得所測得的各標(biāo)志物的表達(dá)量及其比例關(guān)系更具可比性， 因此能更準(zhǔn)確地用于鑒別或鑒定多潛能干細(xì)胞。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明
本發(fā)明的快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，包括用于快速檢測誘導(dǎo)性人 或鼠多潛能干細(xì)胞的檢測板、示蹤液、陽性對照、陰性對照、樣品稀釋液、洗滌液和顯色液。
本發(fā)明的快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，包括用于快速檢測誘導(dǎo)性人 或鼠多潛能干細(xì)胞的檢測板、生物標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)液、反應(yīng)液、親和素探測液、樣品稀釋液、洗滌 液和顯色液。
所述的檢測板是固定了 0ct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何兩種及以上的人生物標(biāo) 志物抗原的固相；所述的固相為酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽、生物芯片的基片、免疫印跡膜、磁珠；所 述抗原為所述生物標(biāo)志物的整個(gè)蛋白或僅含相關(guān)蛋白的部分氨基酸序列多肽。
所述含有0ct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何兩種及以上的人生物標(biāo)志物的抗原組 合被包被在酶標(biāo)盤的同一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)。
所述含有0ct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何兩種及以上人生物標(biāo)志物的抗原被分 別包被在同一個(gè)酶標(biāo)盤或分開的酶標(biāo)盤的不同的反應(yīng)槽內(nèi)。
所述檢測板是固定了任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物標(biāo) 志物的特異抗體的固相；所述固相為酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽、蛋白芯片的基片、免疫印跡膜、磁珠; 所述的特異抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
所述含有任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物標(biāo)志物的特異 抗體的組合被包被在酶標(biāo)盤的同一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)，所述包被酶標(biāo)盤包括使用直接或間接的方 法將所述的特異抗體包被在酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽內(nèi)。
所述含有任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物標(biāo)志物的特異 抗體被分別包被在同一個(gè)酶標(biāo)盤或分開酶標(biāo)盤的不同的反應(yīng)槽內(nèi)；所述包被酶標(biāo)盤包括使 用直接或間接的方法將所述的特異抗體包被在酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽內(nèi)。
所述檢測板固定了 0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何兩種及以上的小鼠生物標(biāo)志物 抗原的固相；所述的固相為酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽、生物芯片的基片、免疫印跡膜、磁珠；所述抗 原是所述生物標(biāo)志物的整個(gè)蛋白或僅含相關(guān)蛋白的部分氨基酸序列多肽。
含有0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何兩種及以上的小鼠生物標(biāo)志物抗原的組合被 包被在酶標(biāo)盤的同一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)。
含有0ct4、Sox2、c-Myc, Klf4中任何兩種及以上的小鼠生物標(biāo)志物抗原被分別包 被在同一個(gè)酶標(biāo)盤或分開的酶標(biāo)盤的不同的反應(yīng)槽內(nèi)。
所述檢測板是固定了含有任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、c_Myc、Klf4小鼠 生物標(biāo)志物的特異抗體的固相；所述的固相為酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽、蛋白芯片的基片、免疫印跡 膜、磁珠；所述的特異抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
含有任何兩種及以上識別0ct4、Sox2.c-Myc.Klf4小鼠生物標(biāo)志物的特異抗體的組合被包被在酶標(biāo)盤的同一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)；所述預(yù)包被酶標(biāo)盤包括使用直接或間接的方法將所述的特異抗體包被在酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽內(nèi)。
含有任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、c-Myc, Klf4小鼠生物標(biāo)志物的特異抗體被分別包被在同一個(gè)酶標(biāo)盤或分開酶標(biāo)盤的不同的反應(yīng)槽內(nèi)；所述的預(yù)包被酶標(biāo)盤包括使用直接或間接的方法將所述的特異抗體包被在酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽內(nèi)。
所述生物芯片的基片為玻片、塑膠片、矽片和膜等，免疫印跡膜為硝酸纖維素膜或PVC膜。
為了避免歧義，本發(fā)明就涉及的誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)標(biāo)志物0ct4、 Sox2、Nanog、LIN28、c-Myc, Klf4 作如下定義
本發(fā)明所述的誘導(dǎo)性多潛能人干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)標(biāo)志物人0ct4基因代碼為 ΝΜ_002701· 4，全名Octamer-binding transcription factor 4,別稱 P0U5F1, 0CT3, 0TF3.
本發(fā)明所述的誘導(dǎo)性多潛能人干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)標(biāo)志物人Sox2基因代碼為 NM_003106. 3,全名Homo sapiens SRY(sex determining region Y) _box2 (S0X2)，別稱 AN0P3，MC0PS3。
本發(fā)明所述的誘導(dǎo)性多潛能人干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)標(biāo)志物人Nanog基因代碼為 NM_024865. 2,全名Nanog homeobox,別稱NAN0G, nanOg。
本發(fā)明所述的誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)標(biāo)志物人LIN28基因代碼為 NM_024674. 4,含有業(yè)內(nèi)公知?jiǎng)e稱CSDDl, LIN-28, ZCCHCl, Lin_28A.
本發(fā)明所述的誘導(dǎo)性多潛能鼠干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)標(biāo)志物鼠0ct4基因代碼為 NM_001252452 全名Mus musculus POU domain, class 5，transcription factor I, Mus octamer-binding transcription factor 4,別稱P0U5F1, OCT3, 0TF3.
本發(fā)明所述的誘導(dǎo)性多潛能鼠干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)標(biāo)志物鼠Sox2基因代碼為 ΝΜ_011443· 3，Mus musculus SRY-box containing gene 2,含有業(yè)內(nèi)公知?jiǎng)e稱 lcc,Sox-2, ysb0
本發(fā)明所述的誘導(dǎo)性多潛能鼠干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)標(biāo)志物鼠c-Myc，基因代碼為NM_001177352.1,全名Mus musculus myelocytomatosis oncogene,別稱AU016757; bHLHe39;Myc2;Niard;Nird.
本發(fā)明所述的誘導(dǎo)性多潛能鼠干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)標(biāo)志物鼠Klf4，基因代碼為ΝΜ_010637· 3，全名Mus musculus Kruppel-1ike factor 4 含有業(yè)內(nèi)公知?jiǎng)e稱:EZF;Gklf;Zie.
本發(fā)明所述的誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的快速檢測試劑盒，可以通過下述措施例來實(shí)現(xiàn)，所述的措施例只是為更好理解，而不是限制本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和內(nèi)涵。
所述的生物標(biāo)志物相關(guān)蛋白的抗 原制備
本發(fā)明的誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)的快速檢測試劑盒，所述的各生物標(biāo)志物的抗原可以按公知的基因重組方法或天然組織提取方法來獲得。所述的各生物標(biāo)志物相關(guān)蛋白抗原在用作免疫前得先純化，然后與弗氏完全佐劑(第一次免疫)或與弗氏不完全佐劑(后續(xù)免疫)一起乳化后用于免疫接種。
本發(fā)明所述生物標(biāo)志物相關(guān)抗原也可以是按所述生物標(biāo)志物的氨基酸序列人工 合成的多肽(petites)片段。
本發(fā)明所述生物標(biāo)志物相關(guān)抗原可以是含有所述生物標(biāo)志物的氨基酸序列的整 個(gè)蛋白或僅含有所述相關(guān)蛋白的部分氨基酸序列多肽。
本發(fā)明所述生物標(biāo)志物相關(guān)抗原也可以是含有所述生物標(biāo)志物的氨基酸序列中 引入個(gè)別氨基酸變異或缺失的序列。
上述生物標(biāo)志物相關(guān)抗原也可以進(jìn)一步與載體蛋白(比如BSA，KLH)相偶聯(lián)，以提 高免疫原性。
本發(fā)明所述生物標(biāo)志物相關(guān)抗原還可以是基于DNA的疫苗，它可以在免疫動(dòng)物體 內(nèi)按基因表達(dá)程序產(chǎn)生含有所述生物標(biāo)志物相關(guān)氨基酸序列的部分或完整的蛋白。
1.本發(fā)明的生物標(biāo)志物相關(guān)抗體的制備
本發(fā)明所述的各生物標(biāo)志物相關(guān)的抗體可以按公知的多克隆抗體制備方法或單 克隆抗體制備方法來獲得。
2.誘導(dǎo)性多潛能人干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)快速檢測試劑盒的制備例
I)所述的檢測試劑盒含有，但不局限于檢測板、示蹤液、陽性對照、陰性對照、樣 品稀釋液、洗滌液、顯色液。
2)檢測板制備
用PBS緩沖液將兔抗鼠的抗體稀釋至濃度O. lug/ml-30ug/ml,再添加IOOul該抗 體稀釋液到96-孔酶標(biāo)板的孔內(nèi)，在室溫下孵育1-4小時(shí)或低溫(4-8° C)下孵育10-24小 時(shí)；用PBS+0. 1%吐溫20的洗液沖洗酶標(biāo)板孔3-5次；然后，在酶標(biāo)板的孔內(nèi)添加200ul 的2% BSA-PBS封閉液，室溫下孵育1-4小時(shí)，再用PBS+0. 1%吐溫20的洗液沖洗酶標(biāo)板 孔3-5次；
用PBS緩沖液配制濃度為O. lug/ml-10ug/ml的下述4個(gè)人生物標(biāo)志物特異的鼠 抗體溶液，按酶標(biāo)板布局表(表I)所示，在酶標(biāo)板上1-12列的孔內(nèi)分別添加100微升下 述生物標(biāo)志物特異的抗體溶液0ct4(列1，5，9)、Sox2(列2，6，10)、Nanog (列3，7, 11), LIN28(列 4，8，12);
在室溫下孵育O. 5-4小時(shí)(或低溫(4-8。C)孵育10-24小時(shí))，用PBS+0. 1%吐 溫20洗液沖洗酶標(biāo)板孔3-5次；然后，45° C下干燥，將該盤抽真空密封于鋁袋內(nèi)，儲存 在低溫干燥冰箱備用。
3)陽性對照液制備
陽性對照是用純化的并經(jīng)準(zhǔn)確定量的各生物標(biāo)志物按實(shí)驗(yàn)要求的檢出濃度制備 (各生物標(biāo)志物陽性對照濃度不盡相同)，將陽性對照用各生物標(biāo)志物溶解于含1% BSA的 PBS溶液里配成適當(dāng)?shù)臐舛?，低溫儲存?zhèn)溆谩?br> 4)陰性對照液
定量用陰性對照液是含I % BSA的PBS溶液；低溫儲存?zhèn)溆谩?br> 定性用將陰性細(xì)胞溶解液稀釋于含I % BSA的PBS溶液里配成等同于定性檢測 時(shí)細(xì)胞溶解液的稀釋度，比如1/10，低溫儲存?zhèn)溆谩?br> 5)樣品稀釋液
樣品稀釋液是含I % BSA的PBS溶液；制備將I克BSA蛋白溶解于100毫升PBS緩沖液，低溫儲存?zhèn)溆谩?br> 6)示蹤劑
示蹤劑是標(biāo)記分子與純化的生物標(biāo)志物共價(jià)偶聯(lián)物。所述的標(biāo)記分子可以是常用 的過氧化氫酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、熒光分子、量子點(diǎn)等。如HRP-0ct4示蹤劑可以按 公知的方法制備。比如通過EDC介導(dǎo)羧基與胺基反應(yīng)來獲得。例將EDC、HRP、0ct4蛋白按 摩爾數(shù)20 4 :1溶解于PBS緩沖液，并在室溫反應(yīng)2小時(shí)，然后通過透析去除游離的EDC ;也 可進(jìn)一步通過HPLC純化獲得高純度HRP-0ct4偶聯(lián)物。將示蹤劑溶解于含I % BSA的PBS 溶液里配成O. 001-0. 1%濃度備用。
7)洗滌液
含O. 1% 吐溫 20 (Tween20)的 PBS 溶液·
8)顯色液
過氧化氫酶用顯色底物溶液將TMB (3，3 ’，5，5 ’ -四甲基聯(lián)苯胺)以O(shè). 2mg/ml的 濃度溶于10mM(pH4)檸檬酸緩沖液，再加O. 03%過氧化氫(H202)，避光低溫儲存?zhèn)溆?。適 于測定波長370nm或450nm(用等量IM硫酸終止后)。
堿性磷酸酶用顯色底物溶液將pNPP (對硝基苯磷酸鹽)以IOmmol / L的濃度 溶于含lmmol / L MgCl2的O.1mol / L 二乙醇胺緩沖液(pH 9. 8)，避光低溫儲存?zhèn)溆谩?適于測定波長405nm。
3.誘導(dǎo)性多潛能人干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)相關(guān)的多生物標(biāo)志物篩查用檢測試劑盒的 檢測方法例
I)待測樣品制備使用MERCK公司的ProteoExtract全蛋白質(zhì)組抽提試劑盒(產(chǎn) 品目錄號539779)提取待測動(dòng)物細(xì)胞的總蛋白?；静襟E如下將待測細(xì)胞洗滌后放 入-20° C以下冰箱冷凍10分鐘以上，然后取出并加入冰鎮(zhèn)的細(xì)胞懸浮液，置于冰上解凍， 用移液槍頭反復(fù)吸噴15分鐘使細(xì)胞溶解，將其移到室溫，加入提取劑及晃動(dòng)提取5分鐘，加 入核酸內(nèi)切酶BenzonaseR再用移液槍頭反復(fù)吸噴20次，室溫?fù)u動(dòng)提取30分鐘，高速離心 30分鐘，取上清便得待測細(xì)胞總蛋白提取液一待測樣品。
2)按表I上方所示，在檢測板(預(yù)包被的酶標(biāo)板)的列1-12的孔內(nèi)分別添加 50ul 下述示蹤劑HRP-0ct4(列 I, 5，9)，HRP_Sox2 (列 2，6，10)，HRP-Nanog (列 3，7，11)， HRP-LIN28(列 4，8，12);
3)按表I所示，再分別在A和B行的孔內(nèi)添加50ul陽性對照液，陰性對照液； 在C，D，E，F(xiàn)，G和H行的孔內(nèi)添加50ul待測試樣1-18;在室溫下孵育O. 5-4小時(shí)或4-8。C 孵育10-24小時(shí);
酶標(biāo)板布局表1:
權(quán)利要求
1.一種快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，包括用于快速檢測誘導(dǎo)性人或鼠多潛能干細(xì)胞的檢測板、示蹤液、陽性對照、陰性對照、樣品稀釋液、洗滌液和顯色液。
2.一種快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，包括用于快速檢測誘導(dǎo)性人或鼠多潛能干細(xì)胞的檢測板、生物標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)液、反應(yīng)液、探測液、樣品稀釋液、洗滌液和顯色液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于， 所述的檢測板是固定了 0ct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何兩種及以上的人生物標(biāo)志物抗原的固相；所述的固相為酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽、生物芯片的基片、免疫印跡膜、磁珠；所述抗原為所述生物標(biāo)志物的整個(gè)蛋白或僅含相關(guān)蛋白的部分氨基酸序列的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述含有0ct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何兩種及以上的人生物標(biāo)志物的抗原被合并地包被在酶標(biāo)盤的同一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)，或被分別地包被在同一個(gè)酶標(biāo)盤或分開的酶標(biāo)盤的不同的反應(yīng)槽內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于， 所述檢測板是固定了任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物標(biāo)志物的特異抗體的固相；所述固相為酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽、蛋白芯片的基片、免疫印跡膜、磁珠；所述的特異抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述含有任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物標(biāo)志物的特異抗體被合并地包被在酶標(biāo)盤的同一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)，或被分別地包被在同一個(gè)酶標(biāo)盤或分開的酶標(biāo)盤的不同的反應(yīng)槽內(nèi)，所述包被酶標(biāo)盤包括使用直接或間接的方法將所述的特異抗體包被在酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于， 所述檢測板固定了 0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何兩種及以上的小鼠生物標(biāo)志物抗原的固相；所述的固相為酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽、生物芯片的基片、免疫印跡膜、磁珠；所述抗原是所述生物標(biāo)志物的整個(gè)蛋白或僅含相關(guān)蛋白的部分氨基酸序列多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，含有 0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何兩種及以上的小鼠生物標(biāo)志物抗原被合并地包被在酶標(biāo)盤的同一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)，或被分別地包被在同一個(gè)酶標(biāo)盤或分開的酶標(biāo)盤的不同的反應(yīng)槽內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于， 所述檢測板是固定了含有任何兩種及以上能識別0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4小鼠生物標(biāo)志物的特異抗體的固相；所述的固相為酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽、蛋白芯片的基片、免疫印跡膜、磁珠; 所述的特異抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，含有任何兩種及以上識別0ct4、Sox2、c-Myc, Klf4小鼠生物標(biāo)志物的特異抗體被合并地包被在酶標(biāo)盤的同一個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)，或被分別地包被在同一個(gè)酶標(biāo)盤或分開的酶標(biāo)盤的不同的反應(yīng)槽內(nèi)；所述預(yù)包被酶標(biāo)盤包括使用直接或間接的方法將所述的特異抗體包被在酶標(biāo)盤的反應(yīng)槽內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的試劑盒，包括用于快速檢測誘導(dǎo)性人或鼠多潛能干細(xì)胞的檢測板、示蹤液、陽性對照、陰性對照、樣品稀釋液、洗滌液和顯色液，或生物標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)液、反應(yīng)液、探測液?？稍谝淮卧囼?yàn)中同時(shí)檢測Oct4、Sox2、Nanog和LIN28，或Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4多潛能干細(xì)標(biāo)志物,從而實(shí)現(xiàn)快速鑒定多潛能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。本發(fā)明由于能在同試驗(yàn)中同時(shí)檢測多個(gè)誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞標(biāo)志物，使得所測得的各標(biāo)志物的表達(dá)量及其比例關(guān)系更具可比性,因此能更準(zhǔn)確地用于鑒別或鑒定多潛能干細(xì)胞。
文檔編號G01N33/543GK102998441SQ201210471939
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者鄒潮 申請人:哈德遜(天津)生物技術(shù)有限責(zé)任公司