人血管炎診斷試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人血管炎診斷試劑盒及其制備方法，屬于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。人血管炎診斷試劑盒，包括：（1）待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品；（2）包被有識(shí)別標(biāo)識(shí)物特異抗原系統(tǒng)的固相板；（3）聯(lián)接有辣根過氧化酶的標(biāo)識(shí)物的抗體；（4）洗滌液；（5）辣根過氧化酶底物的溶液；（6）終止液。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：方法靈敏，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，反應(yīng)快速，無同位素污染；所組成的試劑盒性能穩(wěn)定，操作簡便，適于臨床推廣應(yīng)用。
【專利說明】人血管炎診斷試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人血管炎診斷試劑盒及其制備方法，屬于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]系統(tǒng)性血管炎(systemic vasculitis)是一組以血管壞死和炎癥為主要病理改變的疾病，臨床表現(xiàn)因受累血管的類型、大小、部位及病理特點(diǎn)不同而表現(xiàn)各異。常見的血管炎有魏格納氏肉芽腫、顯微鏡下血管炎、肺出血-腎炎綜合征和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎等。其常累及全身多個(gè)系統(tǒng)，既可以引起多系統(tǒng)多臟器功能障礙，但也可局限于某一臟器。臨床上主要表現(xiàn)為不明原因的腹瀉，以及發(fā)燒，腹痛，直腸出血等。隨著病情的發(fā)展，有些病人還出現(xiàn)不同程度的腸道外癥狀，如肝臟方面的疾患，關(guān)節(jié)炎，皮膚和眼睛方面的癥狀。由于其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，病情偏重，早期診治困難，致殘率、病死率高，預(yù)后差，因此，該疾病的早期診斷、治療非常重要。
[0003]特征性的抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(ant1-neutrophilcytoplasmic antibody, ANCA)是一種以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞質(zhì)成分為靶抗原的自身抗體，包括了大量的自身抗體，其中抗蛋白酶3(PR3)抗體和抗髓過氧化物酶(MPO)抗體具有明確的臨床診斷意義，是最重要的ANCA抗體。研究已經(jīng)證實(shí)抗PR3和抗MPO抗體參與了血管炎的發(fā)病機(jī)制，兩種抗體可以激活人中性粒細(xì)胞并致脫顆粒反應(yīng)，使中性粒細(xì)胞釋放大量有害的蛋白水解酶和氧自由基，從而導(dǎo)致小血管壁的損害，造成血管炎的發(fā)生。
[0004]目前臨床檢測系統(tǒng)性血管炎時(shí)，采用ELISA法測定抗PR3抗體和抗MPO抗體，并采用間接免疫熒光法(HF法)檢測ANCA。IIF法測ANCA時(shí)多采用乙醇固定中性粒細(xì)胞的抗原片進(jìn)行，容易受到樣本中抗核抗體(ANA)的影響，ANA會(huì)在乙醇固定片上出現(xiàn)難與ANCA區(qū)別的熒光顆粒，當(dāng)患者的ANA呈強(qiáng)陽性時(shí)尤其明顯，會(huì)產(chǎn)生干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種人血管炎診斷試劑盒，該試劑盒能夠排除ANA干擾，并且實(shí)現(xiàn)抗PR3抗體和抗MPO抗體的定量檢測。
[0006]本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供上述試劑盒的制備方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]人血管炎診斷試劑盒，組成包括:
[0009]( I)待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品；
[0010](2)包被有識(shí)別標(biāo)識(shí)物特異抗原系統(tǒng)的固相板；
[0011](3)聯(lián)接有辣根過氧化酶的標(biāo)識(shí)物的抗體；
[0012](4)洗滌液；
[0013](5)辣根過氧化酶底物的溶液；
[0014](6)終止液。[0015]所述(I)待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品為抗人PR3和MPO抗原免疫球蛋白G。
[0016]所述(2)包被有識(shí)別標(biāo)識(shí)物特異抗原系統(tǒng)的固相板包括:包被人粒細(xì)胞的固相板、包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板；
[0017]所述(3)聯(lián)接有辣根過氧化酶的標(biāo)識(shí)物的抗體為抗非人類免疫球蛋白G抗體。
[0018]所述(4)洗滌液為磷酸鹽緩沖液。
[0019]所述的(5)辣根過氧化酶底物的溶液包含A液和B液，其中A液為過氧化氫溶液，B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液，或者A液為四甲基聯(lián)苯胺，B液為醋酸鈉/枸櫞酸緩沖液。
[0020]所述(6 )終止液為2M硫酸。
[0021 ] 所述(I)待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為:由高效價(jià)抗人PR3和MPO的血清中制備免疫球蛋白G抗血清，提純IgG，經(jīng)QAE化學(xué)試劑處理血清并分離血清，將高效價(jià)的抗PR3和MPO的免疫球蛋白G血清混合制備，滅活補(bǔ)體，再加穩(wěn)定劑處理，對所獲樣品用電泳法做純度檢測，計(jì)算純度。
[0022]所述的包被人粒細(xì)胞的固相板的制備方法為:包括進(jìn)行粒細(xì)胞提取，計(jì)算細(xì)胞純度和活性檢測，細(xì)胞包被步驟，其細(xì)胞包被的方法為用I X Hank平衡鹽溶液(HBSS)稀釋粒細(xì)胞，使其至終濃度約為lOO-lOOOOOOcells/mL，然后將懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ L，靜置于室溫，去上清，室溫干燥，后用冷甲醇固定并干燥，用封蓋膜將固定細(xì)胞的微孔板封蓋，放置20°C保存?zhèn)溆?；所述包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板的制備方法是:以0.05M磷酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，包被抗原的濃度為0.04-1.0微克/ml，包被溶液在微孔板的孔中4°C，24小時(shí)，用去離子水洗滌兩次，2%牛血清白蛋白室溫封閉1.5小時(shí)后，在溫度為20-28°C及濕度小于或等于30%的條件下干燥12小時(shí)，然后裝袋封口，儲(chǔ)存于4°C待用。
[0023]一種人血管炎診斷試劑盒的制備方法，試劑盒包括:
[0024]( I)待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品；
[0025]( 2 )包被有標(biāo)識(shí)物特異抗原系統(tǒng)的固相板:包括包被人粒細(xì)胞的固相板、包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板；
[0026](3)聯(lián)接有辣根過氧化酶的標(biāo)識(shí)物的抗體；
[0027](4)洗滌液；
[0028]( 5 )辣根過氧化酶底物的溶液；
[0029](6)終止液；
[0030]所述的待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為:由高效價(jià)抗人PR3和MPO的血清中制備免疫球蛋白G抗血清，提純IgG，經(jīng)QAE化學(xué)試劑處理血清并分離血清，將高效價(jià)的抗PR3和MPO的免疫球蛋白G血清混合制備，滅活補(bǔ)體，再加穩(wěn)定劑處理，然后對所獲樣品用電泳法做純度檢測，計(jì)算純度。
[0031]所述的包被人粒細(xì)胞的固相板的制備方法為:包括進(jìn)行粒細(xì)胞提取，計(jì)算細(xì)胞純度和活性檢測，細(xì)胞包被步驟，其細(xì)胞包被的方法為用I X Hank平衡鹽溶液(HBSS)稀釋粒細(xì)胞，使其至終濃度約為100-1000000cellS/mL，然后將懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ L，靜置于室溫，去上清，室溫干燥，后用冷甲醇固定并干燥，用封蓋膜將固定細(xì)胞的微孔板封蓋，放置20°C保存?zhèn)溆茫凰霭豢谷薖R3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板的制備方法是:以0.05M磷酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，包被抗原的濃度為0.04-1.0微克/ml，包被溶液在微孔板的孔中4°C，24小時(shí)，用去離子水洗滌兩次，2%牛血清白蛋白室溫封閉1.5小時(shí)后，在溫度為20-28°C及濕度小于或等于30%的條件下干燥12小時(shí)，然后裝袋封口，儲(chǔ)存于4°C待用；
[0032]所述的辣根過氧化酶連接抗體的采用碘酸鈉法制備；
[0033]所述的辣根過氧化酶底物的溶液包含A液和B液，其中A液為過氧化氫溶液，B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液或者A液為四甲基聯(lián)苯胺；B液為醋酸鈉/枸櫞酸緩沖液；
[0034]所述的終止液為硫酸，洗滌液為磷酸鹽緩沖液。
[0035]本發(fā)明提供了一種檢測對血管炎特異的血清標(biāo)識(shí)物的免疫分析測定方法和依據(jù)該方法制備的檢驗(yàn)試劑盒，(I)測定內(nèi)容的獨(dú)特性和專有性:目前在中國所要檢測的全部標(biāo)識(shí)物都屬創(chuàng)新產(chǎn)品，而針對標(biāo)識(shí)物所開發(fā)的血管炎體外診斷試劑也是目前中國體外診斷試劑市場中在血管炎方面唯一的產(chǎn)品。(2)測定試劑盒的靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，測定結(jié)果可靠性強(qiáng)?？梢栽谘宸磻?yīng)很低時(shí)或者在疾病發(fā)生發(fā)展的早期階段測到待測物。與其他一些非特異炎癥測試方法不同，本測試方法能夠可靠地檢測血管炎特有的血清標(biāo)識(shí)物。
(3)測定試劑盒的臨床應(yīng)用價(jià)值:對血管炎標(biāo)識(shí)物的檢測技術(shù)包含了對標(biāo)識(shí)物的檢測以及在測定過程中結(jié)合免疫熒光技術(shù)可以鑒別靶抗原的類型。這些檢測結(jié)果可協(xié)助醫(yī)生對血管炎的診斷，同時(shí)這些結(jié)果對治療預(yù)后和治療監(jiān)控也提供了重要的參考價(jià)值。
[0036]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:本發(fā)明試劑盒采用微孔板為固相載體，通過免疫反應(yīng)將血管炎特異的血清標(biāo)識(shí)物與固定到微孔板上的特異抗原系統(tǒng)結(jié)合，然后與特異識(shí)別標(biāo)識(shí)物的免疫球蛋白-辣根過氧化物酶結(jié)合，在所聯(lián)酶對底物的酶促反應(yīng)下使底物呈現(xiàn)顏色改變來定量測定血管炎特異的的血清標(biāo)識(shí)物。本發(fā)明采用甲醇固定粒細(xì)胞檢測板，排除了患者血液樣本中ANA的干擾，同時(shí),本試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)定量測定抗PR3抗體和抗MPO抗體。本測定方法靈敏，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，反應(yīng)快速，無同位素污染；所組成的試劑盒性能穩(wěn)定，操作簡便，適于臨床推廣應(yīng)用。
[0037]以下結(jié)合說明書附圖和【具體實(shí)施方式】詳細(xì)說明本發(fā)明，并不以此限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0039]圖2為檢測檢測99例血管炎病人血清的OD值分布【具體實(shí)施方式】
[0040]實(shí)施例1:人血管炎診斷試劑盒
[0041]一.試劑盒組成:
[0042](I)待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品:抗人PR3和MPO抗原免疫球蛋白G。
[0043]( 2 )包被有識(shí)別標(biāo)識(shí)物特異抗原系統(tǒng)的固相板:包括包被人粒細(xì)胞的固相板、包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板；
[0044](3)聯(lián)接有辣根過氧化酶的標(biāo)識(shí)物的抗體:聯(lián)接有辣根過氧化酶的羊抗人IgG抗體(羊抗人IgG抗體,美國ImmunoReagents Inc)
[0045](4)洗滌液:磷酸鹽緩沖液；[0046](5)辣根過氧化酶底物的溶液:包含A液和B液，其中A液為過氧化氫溶液，B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液，或者A液為四甲基聯(lián)苯胺，B液為醋酸鈉/枸櫞酸緩沖液；
[0047](6)終止液:硫酸。
[0048]二.試劑制法:
[0049]( I)待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0050]用通過免疫熒光抗人PR3和MPO抗體靶抗原特異的檢測系統(tǒng)確證的具有高效價(jià)抗人PR3和MPO的血清中制備免疫球蛋白G抗血清。
[0051]取QAE-S印hadexA25或A50經(jīng)酸處理并在0.05mol/LpH7.5的磷酸鹽緩沖液中平衡，將水分抽干，稱濕重Ig加于IOml血清中，在室溫30min后，離心或過濾除去離子交換齊U。上清液再如此處理一次，即獲得較純的IgG。經(jīng)QAE化學(xué)試劑處理血清并分離后，將高效價(jià)的抗PR3和MPO的免疫球蛋白G血清混合制備，置于56°C水溫箱30min，滅活補(bǔ)體，再加ProClin300做穩(wěn)定劑處理，然后對所獲樣品用電泳法做純度檢測，通過電泳凝膠上IgG條帶位置與mark條帶對比,分析確定其分子量大小,計(jì)算其制備的純度。
[0052]附圖1為對包被粒細(xì)胞的固相板做的陽性血清的標(biāo)準(zhǔn)曲線。本方法對陽性標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后，用專業(yè)數(shù)據(jù)處理軟件得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其R值可以達(dá)到0.999，線性關(guān)系良好。待檢病人血清經(jīng)本方法檢測獲取吸光度值以后，通過本標(biāo)曲擬合公式或矩陣圖換算，可以得到病人血清內(nèi)含有待檢抗體的含量。
[0053](2)包被有標(biāo)識(shí)物特異抗原系統(tǒng)的固相微孔板的制備
[0054]A.提取粒細(xì)胞:從健康供血者抽取新鮮的外周血到加有抗凝劑的抽血管中備用；將采集的全血用不含內(nèi)毒素、鈣、鎂離子的HBSS按比例稀釋；稀釋后的全血加入含F(xiàn)icoll-paque plus溶液層的上面，離心后，取出外周血單核細(xì)胞，并在HBSS緩沖液輕輕重懸，備用；迅速將細(xì)胞與葡聚糖輕輕混合，沉降并收集中性粒細(xì)胞。再用HBBS混，20°C離心。按全血量一定比例加入細(xì)胞溶解液，用細(xì)胞裂解液體積的HBSS緩沖液終止溶解反應(yīng)，4°C離心。棄去上清，得到需要的粒細(xì)胞；棄去上清，用細(xì)胞洗滌液將細(xì)胞沉淀重懸，洗滌，4°C離心；將得到的細(xì)胞用HBSS重懸備用。
[0055]粒細(xì)胞提取率及純度檢測:用移液器取細(xì)胞懸液，滴于載玻片上并干燥；用有機(jī)試劑固定；染色液在載玻片上做細(xì)胞染色觀察其形態(tài)；用水沖洗，晾干并顯微鏡下觀察；顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞種類并計(jì)算粒細(xì)胞純度；細(xì)胞活性檢測:取少量細(xì)胞懸液加入臺(tái)盼藍(lán)，在顯微鏡下檢測細(xì)胞存活情況并計(jì)算粒細(xì)胞的細(xì)胞濃度。
[0056]B.包被人粒細(xì)胞的固相板的制備方法:用I X Hank平衡鹽溶液(HBSS)稀釋步驟A得到的粒細(xì)胞，使其至終濃度約為lOOOOOOcells/mL，然后將懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ L，靜置于室溫，去上清，室溫干燥，后用冷甲醇固定并干燥，用封蓋膜將固定細(xì)胞的微孔板封蓋，放置20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0057]C.包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板的制備方法是:以0.05M磷酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，包被抗原的濃度為1.0微克/ml，包被溶液在微孔板的孔中4°C，24小時(shí)，用去離子水洗滌兩次，2%牛血清白蛋白室溫封閉1.5小時(shí)后，在溫度為20-28°C及濕度小于或等于30%的條件下干燥12小時(shí)，然后裝袋封口，儲(chǔ)存于4°C待用。
[0058](3)制備辣根過氧化酶連接的標(biāo)識(shí)物抗體:[0059]辣根過氧化酶連接抗體的制備方法為碘酸鈉法。稱辣根過氧化酶溶于雙蒸餾水中，加入新鮮配制的0.1M NaIO4溶液。室溫避光。對醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，加入碳酸鹽緩沖液，然后加入含有抗體(羊抗人IgG抗體,美國ImmunoReagents Inc)的碳酸鹽緩沖液，室溫反應(yīng)2小時(shí)。再加入新鮮配制的NaBH,混勻，在4°C下反應(yīng)。對PBS透析4°C過夜。隨后在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨。之后3000rpm離心0.5小時(shí)，棄上清，將沉淀物溶于PBS.然后對PBS透析4°C 4小時(shí)，IOOOOrpm離心30分鐘。制得酶的結(jié)合物，加入丙三醇，-20°C保存。酶連接的抗體的稀釋倍數(shù)為1:70000。稀釋液為磷酸鹽緩沖液。配置完成后混勻，放置30分鐘后用肉眼觀察無結(jié)晶或沉淀析出。
[0060](4)洗滌液的配制
[0061]洗滌液為磷酸鹽緩沖液，成分為135mM NaCl, 2.7mM KCl, 1.5mM KH2PO4, 8mMK2HP04(ρΗ7.2)
[0062](5)辣根過氧化酶底物的溶液:Α液為過氧化氫溶液，B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液；購自 ThermoFisher 公司
[0063](6 )終止液:2Μ硫酸。
[0064]實(shí)施例2:人血管炎診斷試劑盒
[0065]一.試劑盒組成:
[0066](I)待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品:抗人PR3和MPO抗原免疫球蛋白G。
[0067]( 2 )包被有識(shí)別標(biāo)識(shí)物特異抗原系統(tǒng)的固相板:包括包被人粒細(xì)胞的固相板、包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板；
[0068](3)聯(lián)接有辣根過氧化酶的標(biāo)識(shí)物的抗體:聯(lián)接有辣根過氧化酶的羊抗人IgG抗體(羊抗人IgG抗體,美國ImmunoReagents Inc)
[0069](4)洗滌液:磷酸鹽緩沖液；
[0070](5)辣根過氧化酶底物的溶液:包含A液和B液，A液為四甲基聯(lián)苯胺，B液為醋酸鈉/枸櫞酸緩沖液；
[0071 ] (6)終止液:2Μ硫酸。
[0072]二.試劑制法:
[0073]( I)待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0074]用通過免疫熒光抗人PR3和MPO抗體靶抗原特異的檢測系統(tǒng)確證的具有高效價(jià)抗人PR3和MPO的血清中制備免疫球蛋白G抗血清。
[0075]取QAE-S印hadexA25或A50經(jīng)酸處理并在0.05mol/LpH8.6的磷酸鹽緩沖液中平衡，將水分抽干，稱濕重Ig加于IOml血清中，在室溫30min后，離心或過濾除去離子交換齊U。上清液再如此處理一次，即獲得較純的IgG。經(jīng)QAE化學(xué)試劑處理血清并分離后，將高效價(jià)的抗PR3和MPO的免疫球蛋白G血清混合制備，置于56°C水溫箱30min，滅活補(bǔ)體，再加ProClin300做穩(wěn)定劑處理，然后對所獲樣品用電泳法做純度檢測，通過電泳凝膠上IgG條帶位置與mark條帶對比,分析確定其分子量大小,計(jì)算其制備的純度。
[0076](2)包被有標(biāo)識(shí)物特異抗原系統(tǒng)的固相微孔板的制備
[0077]A.提取粒細(xì)胞:從健康供血者抽取新鮮的外周血到加有抗凝劑的抽血管中備用；將采集的全血用不含內(nèi)毒素、鈣、鎂離子的HBSS按比例稀釋；稀釋后的全血加入含F(xiàn)icoll-paque plus溶液層的上面，離心后，取出外周血單核細(xì)胞，并在HBSS緩沖液輕輕重懸，備用；迅速將細(xì)胞與葡聚糖輕輕混合，沉降并收集中性粒細(xì)胞。再用HBBS混，20°C離心。按全血量一定比例加入細(xì)胞溶解液，用細(xì)胞裂解液體積的HBSS緩沖液終止溶解反應(yīng)，4°C離心。棄去上清，得到需要的粒細(xì)胞；棄去上清，用細(xì)胞洗滌液將細(xì)胞沉淀重懸，洗滌，4°C離心；將得到的細(xì)胞用HBSS重懸備用。
[0078]粒細(xì)胞提取率及純度檢測:用移液器取細(xì)胞懸液，滴于載玻片上并干燥；用有機(jī)試劑固定；染色液在載玻片上做細(xì)胞染色觀察其形態(tài)；用水沖洗，晾干并顯微鏡下觀察；顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞種類并計(jì)算粒細(xì)胞純度；細(xì)胞活性檢測:取少量細(xì)胞懸液加入臺(tái)盼藍(lán)，在顯微鏡下檢測細(xì)胞存活情況并計(jì)算粒細(xì)胞的細(xì)胞濃度。
[0079]B.包被人粒細(xì)胞的固相板的制備方法:用I X Hank平衡鹽溶液(HBSS)稀釋步驟A得到的粒細(xì)胞，使其至終濃度約為lOOOOOOcells/mL，然后將懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ L，靜置于室溫，去上清，室溫干燥，后用冷甲醇固定并干燥，用封蓋膜將固定細(xì)胞的微孔板封蓋，放置20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0080]C.包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板的制備方法是:以0.05M磷酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，包被抗原的濃度為0.04微克/ml，包被溶液在微孔板的孔中4°C，24小時(shí)，用去離子水洗滌兩次，2%牛血清白蛋白室溫封閉1.5小時(shí)后，在溫度為20-28°C及濕度小于或等于30%的條件下干燥12小時(shí)，然后裝袋封口，儲(chǔ)存于4°C待用。
[0081](3)制備辣根過氧化酶連接的標(biāo)識(shí)物抗體:
[0082]辣根過氧化酶連接抗體的制備方法為碘酸鈉法。稱辣根過氧化酶溶于雙蒸餾水中，加入新鮮配制的0.1M NaIO4溶液。室溫避光。對醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，加入碳酸鹽緩沖液，然后加入含有抗體(羊抗人IgG抗體,美國ImmunoReagents Inc)的碳酸鹽緩沖液，室溫反應(yīng)2小時(shí)。再加入新鮮配制的NaBH,混勻，在4°C下反應(yīng)。對PBS透析4°C過夜。隨后在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨。之后3000rpm離心0.5小時(shí)，棄上清，將沉淀物溶于PBS.然后對PBS透析4°C 4小時(shí)，IOOOOrpm離心30分鐘。制得酶的結(jié)合物，加入丙三醇，-20°C保存。酶連接的抗體的稀釋倍數(shù)為1:70000。稀釋液為磷酸鹽緩沖液。配置完成后混勻，放置30分鐘后用肉眼觀察無結(jié)晶或沉淀析出。
[0083](4)洗滌液的配制
[0084]洗滌液為磷酸鹽緩沖液，成分為135mM NaCl, 2.7mM KCl, 1.5mM KH2PO4, 8mMK2HP04(ρΗ7.2)
[0085](5)辣根過氧化酶底物的溶液:Α液為過氧化氫溶液，B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液；購自 ThermoFisher 公司
[0086](6 )終止液:2Μ硫酸。
[0087]實(shí)施例3:臨床檢測試驗(yàn)
[0088]一.實(shí)驗(yàn)材料
[0089]1.實(shí)施例1的試劑盒
[0090]2.99例血管炎患者血清樣本
[0091]二.檢測方法:
[0092]1.采用常規(guī)醫(yī)用技術(shù)收集全血標(biāo)本，置血30分鐘后吸取血清待用。待測血清如在24小時(shí)內(nèi)使用，可于2-8°C條件保存，若需長期存放，應(yīng)保存于_20°C以下，并避免反復(fù)凍融。
[0093]2.向包被有標(biāo)識(shí)物特異抗原系統(tǒng)的固相板的微孔中加入待檢血清樣品，靜置使其抗原抗體反應(yīng)結(jié)合。
[0094](I)用PBST將待測血清按比例稀釋，每孔加入IOOuL,室溫振蕩孵育；
[0095](2)洗滌:去掉孔內(nèi)溶液，加入PBST，靜置，去掉PBST，并重復(fù)2次；
[0096](3)酶標(biāo)二抗:用酶稀釋液將聯(lián)接有辣根過氧化酶的標(biāo)識(shí)物的抗體稀釋(1:500-
[0097]1:2，000，000)，每孔 IOOuL,室溫振蕩孵育。
[0098](4)洗滌:同步驟(2)。
[0099](5)顯色:加辣根過氧化酶底物的溶液,室溫振蕩顯色30min,在酶的作用下,酶底物轉(zhuǎn)換成顯色物質(zhì)。這樣，通過對所轉(zhuǎn)換的顏色的測定而得到樣品中待測標(biāo)識(shí)物的量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中各已知標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與顯色的比，可以通過公式來計(jì)算待測標(biāo)識(shí)物的濃度值。
[0100](6)終止反應(yīng):每孔加入終止液,然后測0D450。
[0101](7)隨后根據(jù)臨床資料所定的正常值來確定該病人血中的標(biāo)識(shí)物濃度是否是在正常范圍還是在異常范圍。
[0102]試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品可以同步得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，待檢血清所得OD值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得病人血清中抗PR3和MPO抗體的含量，其抗體含量超過Cut off值的病人血清，再根據(jù)臨床癥狀，即可確診病人體內(nèi)產(chǎn)生高濃度的抗PR3和MPO抗體，提示其患血管炎。
[0103]附圖2為通過本實(shí)驗(yàn)方法，檢測臨床收集的確診病例血清，其吸光度值的散點(diǎn)分布，由圖2可知，本方法對病人體內(nèi)抗體檢測可以做到明顯的區(qū)分度，即可以明顯區(qū)別有無病癥及病癥程度(通過所檢抗體含量予以判定)，給予臨床醫(yī)生確實(shí)可信的參考數(shù)據(jù)。
[0104]本發(fā)明用免疫熒光的方法對血清進(jìn)行篩查判定ANCA，能有效排除ANA的影響。
[0105]對于本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.人血管炎診斷試劑盒，其特征是包括: (1)待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品； (2)包被有識(shí)別標(biāo)識(shí)物特異抗原系統(tǒng)的固相板； (3)聯(lián)接有辣根過氧化酶的標(biāo)識(shí)物的抗體； (4)洗滌液； (5)辣根過氧化酶底物的溶液； (6)終止液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血管炎診斷試劑盒，其特征是:所述(I)待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品為抗人PR3和MPO抗原免疫球蛋白G。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血管炎診斷試劑盒，其特征是:所述(2)包被有識(shí)別標(biāo)識(shí)物特異抗原系統(tǒng)的固相板為包被人粒細(xì)胞的固相板、包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血管炎診斷試劑盒，其特征是:所述(3)聯(lián)接有辣根過氧化酶的標(biāo)識(shí)物的抗體為抗非人類免疫球蛋白G抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的人血管炎診斷試劑盒，其特征是:所述(4)洗滌液為磷酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血管炎診斷試劑盒，其特征是:所述的(5)辣根過氧化酶底物的溶液包含A液和B液，其中A液為過氧化氫溶液，B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液，或者A液為四甲基聯(lián)苯胺，B液為醋酸鈉/枸櫞酸緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血管炎診斷試劑盒，其特征是:所述(6)終止液為2M硫酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人血管炎診斷試劑盒，其特征是:所述(I)待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為:由高效價(jià)抗人PR3和MPO的血清中制備免疫球蛋白G抗血清，提純IgG，經(jīng)QAE化學(xué)試劑處理血清并分離血清，將高效價(jià)的抗PR3和MPO的免疫球蛋白G血清混合制備，滅活補(bǔ)體，再加穩(wěn)定劑處理，對所獲樣品用電泳法做純度檢測，計(jì)算純度。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人血管炎診斷試劑盒，其特征是:所述的包被人粒細(xì)胞的固相板的制備方法為:包括進(jìn)行粒細(xì)胞提取，計(jì)算細(xì)胞純度和活性檢測，細(xì)胞包被步驟，其細(xì)胞包被的方法為用I X Hank平衡鹽溶液(HBSS)稀釋粒細(xì)胞，使其至終濃度約為100-1000000cells/mL，然后將懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ L，靜置于室溫，去上清，室溫干燥，后用冷甲醇固定并干燥，用封蓋膜將固定細(xì)胞的微孔板封蓋，放置20°C保存?zhèn)溆?；所述包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板的制備方法是:以0.05M磷酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，包被抗原的濃度為0.04-1.0微克/ml，包被溶液在微孔板的孔中4°C，24小時(shí)，用去離子水洗滌兩次，2%牛血清白蛋白室溫封閉1.5小時(shí)后，在溫度為20-28°C及濕度小于或等于30%的條件下干燥12小時(shí)，然后裝袋封口，儲(chǔ)存于4°C待用。
10.一種人血管炎診斷試劑盒的制備方法，其特征在于: 所述的試劑盒包括: (1)待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品； (2)包被有標(biāo)識(shí)物特異抗原系統(tǒng)的固相板:包括包被人粒細(xì)胞的固相板、包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板；(3)聯(lián)接有辣根過氧化酶的標(biāo)識(shí)物的抗體； (4)洗滌液； (5)辣根過氧化酶底物的溶液； (6)終止液; 所述的待檢測血清標(biāo)識(shí)物的標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為:由高效價(jià)抗人PR3和MPO的血清中制備免疫球蛋白G抗血清，提純IgG，經(jīng)QAE化學(xué)試劑處理血清并分離血清，將高效價(jià)的抗PR3和MPO的免疫球蛋白G血清混合制備，滅活補(bǔ)體，再加穩(wěn)定劑處理，然后對所獲樣品用電泳法做純度檢測，計(jì)算純度； 所述的包被人粒細(xì)胞的固相板的制備方法為:包括進(jìn)行粒細(xì)胞提取，計(jì)算細(xì)胞純度和活性檢測，細(xì)胞包被步驟，其細(xì)胞包被的方法為用I X Hank平衡鹽溶液(HBSS)稀釋粒細(xì)胞，使其至終濃度約為lOO-lOOOOOOcells/mL，然后將懸液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ L，靜置于室溫，去上清，室溫干燥，后用冷甲醇固定并干燥，用封蓋膜將固定細(xì)胞的微孔板封蓋，放置20°C保存?zhèn)溆?；所述包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板的制備方法是:以0.05M磷酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，包被抗原的濃度為0.04-1.0微克/ml，包被溶液在微孔板的孔中4°C，24小時(shí)，用去離子水洗滌兩次，2%牛血清白蛋白室溫封閉1.5小時(shí)后，在溫度為20-28°C及濕度小于或等于30%的條件下干燥12小時(shí)，然后裝袋封口，儲(chǔ)存于4°C待用； 所述的辣根過氧化酶連接抗體的采用碘酸鈉法制備； 所述的辣根過氧化酶底物的溶液包含A液和B液，其中A液為過氧化氫溶液，B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液或者A液為四甲基聯(lián)苯胺；B液為醋酸鈉/枸櫞酸緩沖液； 所述的終止液為2M硫酸， 洗滌液為磷酸鹽緩沖液。
【文檔編號(hào)】G01N33/535GK103713121SQ201310737092
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】楊武, 寧義剛 申請人:天津瑞華生物科技有限公司