抗體及其應用的制作方法

文檔序號：6234781閱讀：450來源：國知局

抗體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供單克隆抗體、阿爾茨海默病的治療和/或預防藥物的篩選方法、阿爾茨海默病個體的檢測方法、以及含有所述抗體的神經細胞保護劑、阿爾茨海默病的檢測用的試劑、藥品和阿爾茨海默病的治療和/或預防藥物。所述抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性比對淀粉樣前體蛋白的反應性高、且具有下述任意1個以上的特征：(i)對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白纖維的反應性高；(ii)對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性高；(iii)具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性。
【專利說明】抗體及其應用
[0001] 本申請是申請日為2008年10月29日、優(yōu)先權日:為2007年10月29日、中國專利申請?zhí)枮?00880113862. 8、發(fā)明名稱為"抗體及其應用"的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明涉及對淀粉樣前體蛋白的反應性低、且對淀粉樣蛋白球體具有高反應性的新型的抗體及其應用方法。

【背景技術】
[0003] 在阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、朊病毒病等隨著年齡增加而發(fā)病的多種神經變性疾病中，目前"異常結構蛋白"作為共同的發(fā)病機制而受到關注，并進行了對其分子本質的探索。關于阿爾茨海默病，報告了其病理學特征為下述2種纖維性聚集體在腦內的沉積：以β淀粉樣蛋白（Αβ )為主要成分的老年斑（參照Selkoe, D. J.，Annu. Rev. Neurosci.，12, 463-490 (1989);和 Glenner，G. G. and Wong, C. W.，Biochem. Biophys. Res. Commun.，120 (3)，885-890 (1984))和以經磷酸化的tau蛋白為主要成分的神經原纖維變化（配對螺旋樣纖維，PHF) (Ihara, Y. et al.，J. Biochem.，99, 1807-1810(1986);和 Grundke_Iqbal，I.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA. ,83,4913-4917(1986))。另外，近年來，在被認為是由很多、各種病因導致發(fā)病的阿爾茨海默病的研究中，逐漸認為到β淀粉樣蛋白的聚集是共同的發(fā)病途徑。β淀粉樣蛋白是從其前體物質（淀粉樣前體蛋白， Amyloid Precursor Protein，ΑΡΡ)中主要以 40 個殘基（Αβ 卜4(|)?42 個殘基（Ai^_42)的分子種（molecular species)的形式切出而生成的肽，雖然在健康人中通常以單體形式進行著生成、分解過程，但在阿爾茨海默病中，觀察到β淀粉樣蛋白聚集并最終成為過剩的沉積。其原因被認為是在切出過程或分解過程中脫離了控制。在本說明書中，有時將前者 (Α β 稱為" β 40淀粉樣蛋白"、" β 40淀粉樣蛋白單體"或者" β 40淀粉樣蛋白單體蛋白"，并將后者（Α β i_42)稱為" β 42淀粉樣蛋白"、" β 42淀粉樣蛋白單體"或者" β 42淀粉樣蛋白單體蛋白"。另外，43個殘基（Ai^_43)的分子種盡管微量但也被切出而生成，有時將其稱為" β 43淀粉樣蛋白"、" β 43淀粉樣蛋白單體"或者" β 43淀粉樣蛋白單體蛋白"。
[0004] 人們認為聚集的β淀粉樣蛋白對神經細胞具有神經毒作用，可引起突觸變性和隨之發(fā)生的神經細胞死亡，是導致阿爾茨海默病的進行性認知障礙的神經細胞脫落的機制。另外據報告，β淀粉樣蛋白在以水溶性的單體肽形式釋放到細胞外的狀態(tài)下不顯示神經細胞死亡活性（以下在本說明書中，有時將神經細胞死亡活性稱為"毒性"），而在自締合形成β淀粉樣蛋白纖維后開始獲得毒性（參照1^^61^〇，六.&11(1￥&111〇161'，13.六.，？1'〇(3.似1:1· Acad. Sci. USA. ,91,12243-12247(1994))。由于已知當將含有該β淀粉樣蛋白纖維的毒性 β淀粉樣蛋白含有液以高濃度添加到神經系統(tǒng)的培養(yǎng)細胞中時，會導致這些細胞死亡，因此一直以來認為在阿爾茨海默病中，該β淀粉樣蛋白纖維是誘發(fā)神經細胞死亡的真正原因。
[0005] 因此，認為通過添加含有該β淀粉樣蛋白纖維的毒性β淀粉樣蛋白來誘導神經系統(tǒng)細胞等的細胞死亡的實驗體系能夠反映阿爾茨海默病的神經細胞死亡，一直以來多被用于神經細胞死亡抑制劑的篩選等。但是近年來，逐漸報告了下述事實：（1)在含有β淀粉樣蛋白纖維的毒性β淀粉樣蛋白含有液中，誘導神經細胞死亡所需的濃度為數(shù)?ΟμΜ(參照 Yankner, B. A.，et. al.，Science, 250, 279-282 (1990))，該濃度高于阿爾茨海默病患者的腦內存在的β淀粉樣蛋白濃度的1000倍以上；(2)在阿爾茨海默病患者的腦內，β淀粉樣蛋白纖維的沉積量與記憶或認知功能等高級功能的障礙程度沒有必然聯(lián)系，即使存在大量的β淀粉樣蛋白纖維沉積，有時也不顯示任何臨床癥狀；(3)此外，腦內的淀粉樣蛋白β 的沉積部位與神經細胞脫落部位未必一致；(4)在過剩表達ΑΡΡ的小鼠的腦內，在β淀粉樣蛋白纖維的沉積以前或沒有沉積，也發(fā)生學習行為異常；(5)阿爾茨海默病患者腦內的可溶性β淀粉樣蛋白含量的增加比難溶性纖維沉積早10年以上等；這些事實啟示β淀粉樣蛋白的毒性的真正原因并不是β淀粉樣蛋白纖維。
[0006] 本發(fā)明人等之前提出了具有高毒性的自締合型β淀粉樣蛋白含有液及其制備方法（日本特開2001-247600號公報），該含有液以與阿爾茨海默病等的患者的機體內存在的自締合產生的β淀粉樣蛋白同等的濃度誘導神經系統(tǒng)細胞發(fā)生細胞死亡。此外，還發(fā)現(xiàn)了分離上述自締合型β淀粉樣蛋白含有液中所含的神經細胞毒性的真正原因的方法，從分析的結果可知，該真正原因是具有粒徑為約10?約20nm左右的粒狀形態(tài)的自締合型β淀粉樣蛋白，并將之命名為淀粉樣蛋白球體（amylospheroid)(參照Hoshi, Μ.，et. al.，Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A.，100,6370-6375(2003))。在本說明書中，按照該命名，將具有粒徑為約10?約20nm左右的粒狀形態(tài)的自締合型β淀粉樣蛋白稱為"淀粉樣蛋白球體"。
[0007] 由于淀粉樣蛋白球體以與阿爾茨海默病患者的腦內存在的β淀粉樣蛋白同等的濃度誘導神經細胞死亡，并且在淀粉樣蛋白球體導致神經死亡的過程中，引起另一個病理學標記物即tau蛋白的磷酸化等，并與因阿爾茨海默病發(fā)生的癥狀一致，因此認為該淀粉樣蛋白球體是腦內的β淀粉樣蛋白的毒性的真正原因。因此，如果得到（1)抑制淀粉樣蛋白球體形成的抗體，或者（2)抑制淀粉樣蛋白球體對神經系統(tǒng)細胞的毒性的抗體，則可以用作阿爾茨海默病的治療或者預防藥。另外，如果得到（3)對淀粉樣蛋白球體的反應性比對淀粉樣前體蛋白、β淀粉樣蛋白單體和β淀粉樣蛋白纖維等的反應性高的抗體，則可應用到用來診斷阿爾茨海默病的測定。
[0008] 以淀粉樣蛋白球體為抗原的抗體的制作方法可以是已知的方法。另外，已得到了兔多克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體（ASD2、ASD3)和小鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體（MASD1、MASD2、MASD3) (W02006/016644號）（有時將與淀粉樣蛋白球體反應的抗體稱為"抗淀粉樣蛋白球體抗體"）。但是，還沒有得到對淀粉樣前體蛋白的反應性低、且與淀粉樣蛋白球體發(fā)生特異性反應、并抑制所述蛋白對神經系統(tǒng)細胞的毒性的抗體。其中， W02006/016644號中記載的兔多克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體（ASD2、ASD3)和小鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體（MASD1、MASD2、MASD3)在本申請說明書中分別如下表示。
[0009] ASD2 - rpASD2
[0010] ASD3 -rpASD3
[0011] MASD1 -mASDl
[0012] MASD2 -mASD2
[0013] MASD3 -mASD3
[0014] 非專利文獻 1 :Selkoe, D. J.，Annu. Rev. Neurosci.，12, 463-490 (1989)
[0015] 非專利文獻 2 :Glenner, G. G. and Wong, C. W.，Biochem. Biophys. Res. Commun.，120(3)，885-890(1984)
[0016] 非專利文獻 3 :Ihara，Y. et al.，J.Biochem. ,99, 1807-1810(1986)
[0017] 非專利文獻4:G;rundke-Iqbal，I·etal·，P;roc·Natl·Acad·Sci· USA.，83, 4913-4917(1986)
[0018] 非專利文獻 5 :Lorenzo, A. and Yankner, B. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，91，12243-12247(1994)
[0019] 非專利文獻 6 :Yankner, B. A.，et. al.，Science, 250, 279-282 (1990)
[0020] 非專利文獻 7 ：Hoshi, Μ. , et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 100, 6370-6375 (2003)
[0021] 專利文獻1 :日本特開2001-247600號公報
[0022] 專利文獻 2 :W02006/016644 號

【發(fā)明內容】

[0023] 本發(fā)明的課題在于得到對淀粉樣蛋白球體的反應性比對淀粉樣前體蛋白的反應性高、對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白纖維或β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性高的抗體、或者對淀粉樣蛋白球體的反應性比對淀粉樣前體蛋白的反應性高、且具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性的抗體。此外，本發(fā)明的課題還在于提供使用上述抗體的阿爾茨海默病的治療和/或預防藥物的篩選方法，以及阿爾茨海默病個體的檢測方法。此外，本發(fā)明的課題還在于提供使用上述抗體的神經細胞保護劑、阿爾茨海默病的檢測用的試劑、以及阿爾茨海默病的治療和/或預防藥物等藥品。此外，本發(fā)明的課題還在于提供用于檢測上述抗體的固相載體。此外，本發(fā)明的課題還在于提供產生上述抗體的雜交瘤。
[0024] 本發(fā)明人等為了解決上述課題進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)下述抗體對淀粉樣前體蛋白的反應性低、對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白纖維或β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性高，并且還具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性：所述抗體為用淀粉樣蛋白球體對倉鼠進行皮下免疫，利用從該動物得到的脾細胞構建雜交瘤，由該雜交瘤產生的單克隆抗體。另外，還發(fā)現(xiàn)該抗體對人正常組織的交叉反應性低、而與阿爾茨海默病腦發(fā)生特異性反應。本發(fā)明是基于這些認識而完成的發(fā)明。
[0025] 即，根據本發(fā)明，提供以下的發(fā)明。
[0026] (1) 一種抗體，其對淀粉樣蛋白球體的反應性比對淀粉樣前體蛋白的反應性高，且具有以下的任意1個以上的特征。
[0027] ⑴對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白纖維的反應性高；
[0028] (ii)對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性高；
[0029] (iii)具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性。
[0030] (2)根據⑴所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以及相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和β淀粉樣蛋白纖維的反應性的體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性是對β淀粉樣蛋白纖維的反應性的3倍以上。
[0031] (3)根據⑴或⑵所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以及相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和β淀粉樣蛋白纖維的反應性的體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性是對β淀粉樣蛋白纖維的反應性的5倍以上。
[0032] (4)根據⑴?⑶中任一項所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以及相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性的體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性是對β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性的50倍以上。
[0033] (5)根據⑴?⑷中任一項所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以及相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性的體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性是對β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性的500倍以上。
[0034] (6)根據⑴?（5)中任一項所述的抗體，其中，所述抗體是以淀粉樣蛋白球體為抗原得到的。
[0035] (7)根據⑴?（6)中任一項所述的抗體，其中，所述抗體是單克隆抗體。
[0036] (8)根據（7)所述的抗體，其中，所述抗體對淀粉樣蛋白球體的解離常數(shù)為ΚΓ9以下。
[0037] (9)根據（1)?（8)中任一項所述的抗體，其中，所述抗體在不顯示對人正常組織的顯著的交叉反應性的情況下，與阿爾茨海默病腦發(fā)生特異性反應。
[0038] (10)根據⑴?（9)中任一項所述的抗體，其中，所述抗體對淀粉樣蛋白球體的立體結構特異性表位進行識別。
[0039] (11)根據⑴?（10)中任一項所述的抗體，其中，所述抗體為來自倉鼠的抗體。
[0040] (12)根據⑴?（11)中任一項所述的單克隆抗體，其中，所述抗體是由保藏編號為FERM ΒΡ-10871或FERM ΒΡ-10872的雜交瘤產生的。
[0041] (13) -種人源化抗體，其是通過對由保藏編號為FERM ΒΡ-10871或FERM BP-10872的雜交瘤產生的倉鼠單克隆抗體進行人源化而得到的。
[0042] (14) (13)所述的人源化抗體或其片段，其包含人源化重鏈和人源化輕鏈，
[0043] 所述人源化重鏈包含來源于由保藏編號為FERM BP-10872的雜交瘤產生的倉鼠單克隆抗體的3個重鏈互補決定區(qū)（CDRs)、和來源于人免疫球蛋白重鏈的重鏈可變區(qū)框架序列；
[0044] 所述人源化輕鏈包含來源于由保藏編號為FERM BP-10872的雜交瘤產生的倉鼠單克隆抗體的3個輕鏈互補決定區(qū)（CDRs)、和來源于人免疫球蛋白輕鏈的輕鏈可變區(qū)框架序列；
[0045] 并且，3個重鏈互補決定區(qū)（⑶Rs)分別具有下述氨基酸序列：
[0046] 重鏈 CDR1 :Asp Tyr Phe Met Ser (序列號 11);
[0047] 重鏈 CDR2 :Gly lie Glu lie Lys Ser Tyr Phe Tyr Ala Thr Tyr Tyr Phe Gly Ser Val Lys Gly(序列號 12);和
[0048] 重鏈 CDR3 :Asn Arg Glu Val Gly Gly Leu Asp Asn (序列號 13);
[0049] 3個輕鏈互補決定區(qū)（⑶Rs)分別具有下述氨基酸序列：
[0050] 輕鏈CDR1 :Thr Leu Arg Ser Gly lie Ser Val Gly Gly Lys Asn lie Tyr(序列號 14);
[0051] 輕鏈 CDR2 :Tyr Ser Ser Tyr Ser Asn Lys Gin Leu Gly Pro (序列號 15);和
[0052] 輕鏈 CDR3 :Ser lie His Glu Ser Asn Ala Tyr Val (序列號 16)。
[0053] (15) (13)所述的人源化抗體或其片段，其包含人源化重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；
[0054] 所述人源化重鏈可變區(qū)含有下述氨基酸序列（序列號17):
[0055] Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala St'r Gly Phe Thi. Phe SerAsp Tyr 20 25 30 Phe Met Ser Trp Arg Gin Λ--? Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Gly 丨le Glu lie Lys Sei. Tyr Phe Tyr AUi Tlir Tyr ^ 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg I)he Thr i le St'r Arg Asp Asp St'r Lys Asn Thr 65 70 75 80 Xaa Tyr Leu Gin Met Asn Sei'Leu Lys Thi. Glu Asp Thr Ala Viil Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Xjui Asn Arg Glu Vtil Gly (?ily Leu Asp Asn Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
[0056] 式中，第49位的Xaa為Gly或Ala、第81位的Xaa為Leu或Val ;以及第100位的 Xaa 為 Thr 或 Arg ;
[0057] 所述輕鏈可變區(qū)含有下述氨基酸序列（序列號18):
[0058] Gin Xiui \4il Leu Thr Gin Pr<) Xmi Ser Leu Ser Aki Ser Pr<) Gly Ala 1 5 10 15 Ser Ala Ser Leu Thi乂、ys Thr Leu Arg Ser Gly lie Ser Gly Gly 20 25 30 Lys Asn He Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gin Xtui 35 40 45 Leu Xtui Tyr Ser Ser Tyr Ser Asn Lys Gin Leu Giy Pro G 50 55 60 Pro SerArg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Xiui SerAUi Asn Aki Xmi lie 65 70 75 80 Leu Leu lie Ser Gly Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser lie His Glu SerAsn AUi Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100 105 110 Thr Val Leu Gly 115
[0059] 式中，第2位的Xaa為Ser或Ala，第8位的Xaa為Ser或Ala，第48位的Xaa為 Tyr或Phe，第49位的Xaa為Leu或Phe，第51位的Xaa為Lys、Phe或Arg，第74位的Xaa 為Ala或Thr，第79位的Xaa為Gly或Ala。
[0060] (16) (15)所述的人源化抗體或其片段，其具有序列號5記載的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和序列號7記載的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
[0061] (17) -種阿爾茨海默病的治療和/或預防藥物的篩選方法，其包括：使受檢物和 (1)?（16)中任一項所述的抗體與淀粉樣蛋白球體接觸，并以受檢物對淀粉樣蛋白球體的結合性為指標來選擇候補物質。
[0062] (18) -種阿爾茨海默病個體的檢測方法，其包括：使從懷疑具有阿爾茨海默病的個體獲得的生物試樣與（1)?（16)中任一項所述的抗體接觸，測定該樣品中有無與該抗體發(fā)生反應的物質。
[0063] (19) 一種神經細胞保護劑，其含有⑴?（16)中任一項所述的抗體。
[0064] (20) -種阿爾茨海默病的檢測用的試劑，其含有⑴?（16)中任一項所述的抗體。
[0065] (21) -種藥品，其含有⑴?（16)中任一項所述的抗體。
[0066] (22) -種阿爾茨海默病的治療和/或者預防藥物，其含有（1)?（16)中任一項所述的抗體。
[0067] (23)用于檢測⑴?（16)中任一項所述的抗體的固相載體，其特征在于，其是包覆淀粉樣蛋白球體而成的。
[0068] (24) -種產生（7)或⑶所述的抗體的雜交瘤。
[0069] (25)保藏編號為 FERM BP-10871 或 FERM BP-10872 的雜交瘤。
[0070] (26) -種核酸，其含有對（13)?（16)中任一項所述的人源化抗體的重鏈或輕鏈進行編碼的序列或其片段。
[0071] (27) -種用于表達（13)?（16)中任一項所述的人源化抗體或片段的表達載體，其含有對所述抗體或片段進行編碼的核苷酸序列。
[0072] 本發(fā)明的抗體由于對淀粉樣前體蛋白的反應性低、且對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白纖維或β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性高，并且具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性，因此可用作阿爾茨海默病的治療或者預防藥，另外，還可應用于阿爾茨海默病個體的檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0073]圖1為表示分析本發(fā)明的單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的反應性獲得的淀粉樣蛋白球體固相ELISA的結果的曲線圖。
[0074] 圖2為表示分析本發(fā)明的單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的反應性獲得的點印跡的結果的曲線圖。
[0075] 圖3為表示分析本發(fā)明的單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的表位獲得的結果的圖。
[0076] 圖4為表示本發(fā)明的單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性獲得的結果的曲線圖。
[0077] 圖5為分析市售抗體（6E10)的反應性獲得的Western印跡的結果的曲線圖。
[0078] 圖6為表示分析小鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體（mASDl、mASD2、mASD3)的反應性獲得的Western印跡的結果的曲線圖。
[0079] 圖7為表示本發(fā)明的倉鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的反應性獲得的 Western印跡的結果的曲線圖。
[0080] 圖8為表示代表性的小鼠單克隆抗體和倉鼠單克隆抗體對人正常組織組的反應性的圖。
[0081] 圖9為表示對纖維狀淀粉樣蛋白球體和ASH)的抗體特異性的電子顯微鏡照片。
[0082] 圖10為表示人源化抗體RHA/RLA(huASD2)的重鏈可變區(qū)的DNA序列、氨基酸序列和⑶R1、2、3的位置的圖。
[0083] 圖11為表示人源化抗體RHA/RLA(huASD2)的輕鏈可變區(qū)的DNA序列、氨基酸序列和⑶R1、2、3的位置的圖。
[0084] 圖12為表示人源化抗體RHB/RLB的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列和⑶Rl、2、3的位置的圖。
[0085] 圖13為表示人源化抗體RHB/RLB的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和⑶Rl、2、3的位置的圖。
[0086] 圖14為表示人源化抗體RHC/RLC的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和⑶R1、2、3的位置的圖。
[0087] 圖15為與通過本發(fā)明得到的三種人源化抗體的重鏈和輕鏈的氨基酸序列對比地示出了 CDR1、2、3的位置的圖。將RHA/RLA(huASD2)、RHB/RLB和RHC/RLC的重鏈分別表示為 ADS2RHA、ADS2RHB和ASD2RHC。其中，ASD2RHC由于與ADS2RHA是相同的序列，因此省略了。將 RHA/RLA (huASD2)、RHB/RLB 和 RHC/RLC 的輕鏈分別表示為 ADS2RLA、ADS2RLB 和 ASD2RLC。
[0088] 圖16為表示huASD2抗體抑制DF-ASPD對凋亡的誘導的抑制效果的圖。
[0089] 圖17為表示haASD2和huASD2抗體抑制DF-ASH)對細胞死亡的誘導的效果的圖。

【具體實施方式】
[0090] 本發(fā)明的抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性比對淀粉樣前體蛋白的反應性高、且具有下述任意1個以上的特征（下文有時將它們稱為"抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體"）。
[0091] (i)對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白纖維的反應性高；
[0092] (ii)對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性高；
[0093] (iii)具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性。
[0094] 本發(fā)明還涉及使用上述抗體的阿爾茨海默病的治療和/或預防藥物的篩選方法、阿爾茨海默病個體的檢測方法、阿爾茨海默病的治療和/或預防藥物等藥品、以及產生上述抗體的雜交瘤。以下對它們進行詳細說明，但下文對本發(fā)明的說明僅僅是本發(fā)明實施方式的一個例子（代表例），本發(fā)明的范圍并不限于這些內容。
[0095] (1)抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體
[0096] 本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的特征在于其對淀粉樣蛋白球體的反應性比對淀粉樣前體蛋白的反應性高，并表示為下述方式。
[0097] 根據第一方式，本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白纖維的反應性高。"對淀粉樣蛋白球體的反應性"是指與通過下述方法形成的淀粉樣蛋白球體發(fā)生反應。該抗體的反應性的測定可以通過其本身通常使用的方法來進行，當利用這些方法進行測定時，如果所述抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β 淀粉樣蛋白纖維的反應性高，則其包含在本發(fā)明的抗體中。根據優(yōu)選的方式，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性是對β淀粉樣蛋白纖維的反應性的3倍以上，更優(yōu)選為4倍以上、最優(yōu) 選為5倍以上。此時，可以對使用相同的抗體濃度和量、相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量時的反應性進行比較。另外，以與淀粉樣蛋白球體發(fā)生特異性反應、不與β淀粉樣蛋白纖維發(fā)生反應為特征的抗體也包含在本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白特異性抗體中。
[0098] 根據第二方式，本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性高。此時，抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性優(yōu)選是對β淀粉樣蛋白單體蛋白（Αβ)的反應性的50倍以上、更優(yōu)選為100倍以上、最優(yōu)選為500倍以上。此時，可以對使用相同的抗體濃度和量、相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量時的反應性進行比較。
[0099] 當在阿爾茨海默病模型動物或臨床試驗中給予抗Αβ抗體時，可確認誘發(fā)腦出血。該出血認為是由抗體對腦血管淀粉樣蛋白的結合所產生的炎癥反應引起的，是用抗Α β 抗體進行治療的副作用。腦血管淀粉樣蛋白的沉積在80?90%的阿爾茨海默病患者中可見，被稱為Α β型腦淀粉樣血管?。–erebral Amyloid Angiopathy, CAA)。與阿爾茨海默病中的老年斑的淀粉樣蛋白以Αβ 42為主要成分不同，CAA中的沉積以Αβ 40為主體。由此，作為本發(fā)明中的抗體，特別優(yōu)選選擇性地與淀粉樣蛋白球體反應、而對Αβ 40的反應性低的抗體。具體而言，本發(fā)明中的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性優(yōu)選是對Α β 40的反應性的50倍以上、更優(yōu)選是100倍以上、最優(yōu)選是500倍以上。 [0100] 本發(fā)明顯示與抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體具有高反應性的"淀粉樣蛋白球體" 是指β淀粉樣蛋白單體蛋白發(fā)生自締合且具有粒狀形態(tài)的物質。"粒狀形態(tài)"是指只要呈現(xiàn) 粒狀則可以是任何形狀，包括顆粒狀、細粒狀、晶體、聚集塊等全部。粒徑通常為約10?約 20nm、優(yōu)選為約10?約15nm、更優(yōu)選為約10?約12nm、特別優(yōu)選為約12nm左右。另外，關于淀粉樣蛋白球體，其蛋白質濃度為約1 μ g/ml以下、優(yōu)選為約0. 45 μ g/ml以下，且具有誘導神經系統(tǒng)細胞發(fā)生細胞死亡的高的神經細胞死亡活性。另外，當用甘油密度梯度離心法對具有所述物性的淀粉樣蛋白球體進行分級時，能夠得到甘油濃度為約15%以上的級分。 [0101] 作為本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對抗原的反應性的測定方法，可列舉出例如免疫印跡法、點印跡法、ELISA法等其本身已知的免疫學測定法、或使用電子顯微鏡觀察的方法等。另外，作為此時的比較對照的β淀粉樣蛋白單體是指由約40個氨基酸殘基構成的蛋白，其在機體中，通過蛋白酶介導的過程由淀粉樣蛋白前體蛋白（ΑΡΡ)產生。已知根據該蛋白酶的種類和其后的修飾的不同而存在的各種種類，但根據在剛分泌后C末端的氨基酸殘基的長度不同，主要存在β 40淀粉樣蛋白，序列號1)和β 42淀粉樣蛋白（Ah_42，序列號2)，另外M3淀粉樣蛋白（AiV43，序列號3)也微量存在，β淀粉樣蛋白單體包括它們中的任意一種。另外，也包括它們的部分多肽和衍生物。此外，β淀粉樣蛋白纖維是指β淀粉樣蛋白自締合形成的纖維狀的纖維，其具有神經細胞死亡活性。這樣的 β淀粉樣蛋白纖維包括例如從機體內獲得的纖維或通過]^^1^0，六.6七31.，？1'0(3.似1：1· Acad. Sci. USA.，91，12243-12247 (1994)中所述的方法制造的纖維。
[0102] 根據第三方式，本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體是具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性的抗體。"淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導"是指通過上述或后述方法制備的淀粉樣蛋白球體誘導神經細胞發(fā)生細胞死亡的活性，所誘導的細胞死亡可以是凋亡或壞死中的任意一種。另外，關于神經細胞，只要是神經系統(tǒng)細胞則沒有特殊限制，可以使用哺乳動物（人、大鼠、小鼠、猴、豬等）來源的神經系統(tǒng)細胞。也可以使用從ES細胞等分化誘導得到的神經細胞。作為原代培養(yǎng)細胞，可列舉出從上述動物的海馬和前腦基底、大腦皮質等獲得的神經細胞。還包括培養(yǎng)上述動物的海馬等器官而獲得的細胞。作為具有這樣的活性的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的特征，可列舉出例如對淀粉樣蛋白球體的反應性比對淀粉樣前體蛋白、β淀粉樣蛋白纖維或β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性高等。其中，可優(yōu)選使用對淀粉樣蛋白球體的反應性是對淀粉樣前體蛋白的反應性的約10?約20倍的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體。
[0103] 本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體具有的抑制對神經細胞死亡的誘導的活性是指，優(yōu)選具有完全抑制上述的淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的能力，但也包括根據抗體的給藥量不同而部分地抑制的情況。關于抑制活性的具體的測定方法，如后所述。
[0104] 另外，除了第一?第三中的任意1個以上的方式外，以在不顯示對人正常組織的顯著的交叉反應性的情況下、與阿爾茨海默病腦發(fā)生特異性反應為特征的抗體也包括在本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體中。
[0105] 另外，第一?第三中的任意1個以上的方式或者前述的方式中，以識別淀粉樣蛋白球體的立體結構特異性表位為特征的抗體也包括在本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體中。其中優(yōu)選以β淀粉樣蛋白單體蛋白的Ν末端為表位進行識別、或不以β淀粉樣蛋白單體蛋白上的一次序列為表位進行識別為特征的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體。"以識別淀粉樣蛋白球體的立體結構特異性表位為特征的抗體"是指，具體而言，只要淀粉樣蛋白球體是自然的狀態(tài)就能夠結合、而在淀粉樣蛋白球體為改性狀態(tài)的情況下則不能結合的抗體。
[0106] 以下對本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的具體的制造方法和上述的特征的分析方法進行詳細說明。
[0107] (2)淀粉樣蛋白球體（抗原）的制作
[0108] 本發(fā)明的抗體可以將具有下述性質的淀粉樣蛋白球體作為抗原來得到。在本發(fā)明中，淀粉樣蛋白球體是指β淀粉樣蛋白發(fā)生自締合、且具有粒狀形態(tài)的物質。"粒狀形態(tài)" 是指只要呈現(xiàn)為粒狀則可以是任意形狀，包括顆粒狀、細粒狀、晶體、聚集塊等全部。粒徑通常為約10?約20nm、優(yōu)選為約10?約15nm、更優(yōu)選為約10?約12nm、特別優(yōu)選為約12nm 左右。另夕卜，淀粉樣蛋白球體在蛋白質濃度為約1 μ g/ml以下、優(yōu)選為約0. 45 μ g/ml以下時具有誘導神經系統(tǒng)細胞發(fā)生細胞死亡的高的神經細胞死亡活性。另外，當用甘油密度梯度離心法對具有所述物性的淀粉樣蛋白球體進行分級時，能夠得到甘油濃度為約15%以上的級分。
[0109] 這種淀粉樣蛋白球體可以首先通過使含有β淀粉樣蛋白的水溶液對流（第一工序）來進行制備。此外，為了制備高效地含有淀粉樣蛋白球體的溶液，可以使用將對流得到的水溶液中的淀粉樣蛋白球體進行分級（第二工序）的方法。本發(fā)明的抗體的抗原也可以使用上述任意的淀粉樣蛋白球體含有液。
[0110] 上文中的" β淀粉樣蛋白"是指由約40個氨基酸殘基構成的蛋白，其是在機體中通過蛋白酶介導的過程由淀粉樣蛋白前體蛋白（ΑΡΡ)產生的。已知根據所述蛋白酶的種類的不同以及經過其后修飾的不同而存在各種種類，但根據在剛分泌后C末端的氨基酸殘基的長度不同，主要存在β40淀粉樣蛋白，序列號1)和β42淀粉樣蛋白（Ai^_ 42，序列號2)，并且微量存在β 43淀粉樣蛋白（Αβ i_43，序列號3)。淀粉樣蛋白球體的制備中優(yōu)選使用例如剛分泌后的β淀粉樣蛋白的全長分子種即Αβ χ_4(ι、Αβ χ_42*Αβ x_43、或者它們的突變體或衍生物，其中特別優(yōu)選。另外，β淀粉樣蛋白可以使用利用肽合成機等合成的蛋白、市售的蛋白或從生物試樣提取精制而得到的蛋白等任意蛋白。當使用合成肽作為β淀粉樣蛋白時，其合成、提取精制方法可以使用那些本身已知的通常使用的方法。另外，合成肽的精制度只要按照能夠在高效液相色譜法中得到單一的峰的程度進行就足夠了，作為精制方法，可以使用例如凝膠過濾、高效液相色譜法等。在本說明書中，有時也將"β淀粉樣蛋白"稱為"β淀粉樣蛋白單體"、"β淀粉樣蛋白單體蛋白"、"Αβ"、"Αβ單體"。如此得到的β淀粉樣蛋白例如溶解于滅菌精制水中，用于淀粉樣蛋白球體含有液的制備。溶解所用的滅菌精制水的量只要是β淀粉樣蛋白溶解的范圍即可，但優(yōu)選水溶液中的 β淀粉樣蛋白的濃度為達到約50ηΜ?約2mM、優(yōu)選為約1 μ Μ?約ImM、更優(yōu)選為約50?約 700 μ Μ的范圍。優(yōu)選將該溶液調節(jié)成適當?shù)柠}濃度。鹽濃度只要是β淀粉樣蛋白能夠溶解的范圍則任何濃度均可，例如最終的pH為約3?約11、優(yōu)選為約5. 5?約8. 5、更優(yōu)選為約7. 5,鹽優(yōu)選為約1M以下。作為調節(jié)至這樣的鹽濃度的方法，可以使用例如將PBS(-)與 β淀粉樣蛋白水溶液等量添加的方法。溶解的方法只要是β淀粉樣蛋白在適量的適當鹽濃度的溶液中完全溶解的方法，則沒有特殊限制。
[0111] 關于淀粉樣蛋白球體含有液的制備方法的第一工序，可列舉出例如日本特開 2001-247600號公報中記載的工序。雖然如此得到的淀粉樣蛋白球體含有液即使不經任何處理也具有誘導神經細胞死亡的活性，能夠作為本發(fā)明的抗原使用，但進行作為第二工序的分級，能夠得到具有更高的神經細胞死亡活性的級分。作為分級的方法，可以使用例如日本特開2002-105099號公報中記載的方法。如此得到的淀粉樣蛋白球體含有液在根據需要進行了濃縮等處理后，可作為抗原用于以下的免疫工序中。
[0112] 作為確認淀粉樣蛋白球體形成的方法，可列舉出下述的對神經細胞死亡活性進行分析的方法或利用電子顯微鏡進行測定的方法等。電子顯微鏡的測定方法只要是能夠分析淀粉樣蛋白球體的粒徑的方法、且是在淀粉樣蛋白球體的自締合不受損傷的情況下能夠進行觀察的方法，則可以是任何方法。具體而言，例如，首先在直徑為18_左右的玻璃皿等中加入30?40°C的蒸餾水，向其水面滴加約30 μ 1左右的火棉膠1. 5% (W/V)醋酸異戊酯溶液等，溶劑立即揮發(fā)生成薄膜。將該支撐膜張貼到柵格上干燥后，真空蒸鍍碳并使用利用輝光放電的親水化處理裝置對表面進行親水化。接著，使張貼有所述支撐膜的柵格面朝下，與含有制備后的淀粉樣蛋白球體的溶液的小滴接觸，立即用濾紙擦去多余的水分，并添加醋酸鈾溶液進行觀察。優(yōu)選下述方法等：在穩(wěn)定的100?120kV的高壓加速下使用電子顯微鏡，為了防止電子射線破壞試樣，使用柵格的端部等進行像散校正，然后使用電子射線損傷降低法進行觀察。
[0113] (3)將淀粉樣蛋白球體作為抗原的抗體的制備
[0114] 關于獲得上述（2)中所述的將淀粉樣蛋白球體作為抗原的抗體的方法，只要是能夠獲得具有對淀粉樣蛋白球體的反應性比對淀粉樣前體蛋白的反應性高、且具有下述任意 1項以上的特征的抗體的方法，則沒有特殊限制。具體而言，優(yōu)選可以使用下文詳細記載的方法。
[0115] (i)對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白纖維的反應性高；
[0116] (ii)對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性高；
[0117] (iii)具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性。
[0118] 關于抗原，將上述（2)中所述的淀粉樣蛋白球體與通常作為載體的KLH(匙孔血藍蛋白）、BSA (牛血清白蛋白）、0VA (卵清蛋白）等蛋白質或高分子體結合或者聚合而得到的抗原作為免疫用抗原使用，但載體并不是必需的。另外，也可以將通過不同載體的結合法制備的多種抗原混合制成免疫用抗原。
[0119] 用于免疫的動物沒有特殊限定，兔、山羊、綿羊、倉鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、雞、除了產生人抗體的人以外的動物等均可以使用。優(yōu)選使用倉鼠。充分混合弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑與免疫用抗原后，對免疫用抗原的動物在皮下、肌肉內、腹腔內進行接種。每2 周?5周實施1次接種，持續(xù)到免疫動物的抗體對接種的抗原的反應性充分上升為止。1次免疫的抗原的量只要是免疫動物的抗體的反應性能夠充分上升的量，則沒有特殊限制，具體而言，優(yōu)選為約1?約1〇〇 μ g。另外，關于免疫的次數(shù)，優(yōu)選反復從經免疫的動物采血，用后述的方法檢測該血中所含的抗體對抗原的反應性，直至對淀粉樣蛋白球體的反應性比對 β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性高為止。具體而言，優(yōu)選為5?20次。
[0120] 在從最后的免疫過7?10日后，從該動物采集血液、腹水等。優(yōu)選例如采集全血，用離心分離等方法制備血清。關于該血清中所含的本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的反應性的測定方法，只要是能夠分析與上述（2)中制備的淀粉樣蛋白球體的反應性的方法，則可以是任意方法，例如可列舉出用熒光物質等對上述淀粉樣蛋白球體進行標記，使其與上述血清反應，然后測定與該抗體結合的標記劑的活性的方法等。具體而言，可列舉出上述的利用電子顯微鏡觀察的方法、后述的ELISA法等酶免疫測定法、免疫印跡法或點印跡法等。其中，對于本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體，當測定比較與β淀粉樣蛋白纖維的反應性時，可以優(yōu)選使用利用電子顯微鏡觀察的方法，當測定比較β淀粉樣蛋白單體蛋白與作為其自締合體的淀粉樣蛋白球體的反應性時，可以優(yōu)選使用點印跡法或ELISA法等酶免疫測定法。另外，通過比較β淀粉樣蛋白纖維、β淀粉樣蛋白單體蛋白或它們的部分多肽與發(fā)生特異性反應的抗體的反應性，能夠選擇性地獲得本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體。
[0121] 抗體的分離精制可以利用其本身已知的免疫球蛋白的分離精制法來進行精制。具體而言，可列舉出鹽析法、醇沉淀法、等電點沉淀法、電泳法、利用離子交換體的吸附法、超離心分離法、凝膠過濾法、利用抗原抗體結合物或活性吸附劑來僅對特異性抗體進行吸附分離的方法等。
[0122] 如此制作的抗體為多克隆抗體，其可以以IgG為主要成分并包含IgM、IgA等其他的免疫球蛋白。
[0123] 另一方面，當制備單克隆抗體時，對上述免疫動物僅靜脈注射作為通?？乖牡?粉樣蛋白球體，在其2?5日、優(yōu)選3日后采集認為包含抗體產生細胞的脾臟或者淋巴結，使該脾臟細胞或淋巴細胞與腫瘤細胞發(fā)生細胞融合。其后，將經細胞融合并永生化的抗體產生細胞（雜交瘤）分離。這里使用的腫瘤細胞優(yōu)選與通常從經免疫的動物制備的脾臟細胞或者淋巴細胞為相同種，但異種動物間的細胞也可以。另外，作為永生化的方法，還可以使用除細胞融合以外的公知的方法。例如，也可以利用使用了 EB病毒（Epstein-Barr virus)的轉化法（D.Kozbor 等，Eur J Immunol，14 :23(1984))來進行。
[0124] 作為腫瘤細胞的例子，使用 P3(p3/x63-Ag8)、P3Ul、NS-l、MPC-ll、SP2/0-Agl4、F0、 x63. 6. 5. 3、S194、R210等骨髄瘤細胞。細胞融合可以按照通常進行的方法，例如《単夕口一 ^抗體実験7二Λ 7卟》（講談社寸4工^4 7 4 v夕1987年出版），6.1(0!11^狀冊(：· MILSTEIN，Nature，256,495 (1975)中記載的方法等來實施。細胞融合可以通過將細胞融合促進劑加入到懸浮有要融合的細胞的融合培養(yǎng)基中來實施。作為細胞融合促進劑，可列舉出仙臺病毒或平均分子量為1000?6000的聚乙二醇等。此時，為了進一步提高融合效率，可以將二甲基亞砜等助劑或IL-6等細胞因子添加到融合培養(yǎng)基中。關于腫瘤細胞與進行了免疫的脾臟細胞或者淋巴細胞的混合比，可以使用例如相對于腫瘤細胞為約1倍?約10 倍左右的脾臟細胞或者淋巴細胞。
[0125] 作為上述融合培養(yǎng)基，可以使用ERDF培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、GIT 培養(yǎng)基等通常的各種培養(yǎng)基，融合時通?？梢灶A先將胎牛血清（FBS)等血清從培養(yǎng)基中除去。融合通過如下方法來實施：將規(guī)定量的進行了上述免疫的脾臟細胞或淋巴細胞與腫瘤細胞在上述培養(yǎng)基內充分混合，加入約20?約50%左右的預先加熱到37°C左右的聚乙二醇溶液，優(yōu)選使其在30?37°C下反應1?10分鐘左右。之后，反復進行逐次添加適當?shù)呐?養(yǎng)基并離心以除去上清夜的操作。
[0126] 將目標雜交瘤在通常的選擇性培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基（含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基）中培養(yǎng)。為了使除目標雜交瘤以外的細胞（未融合細胞等）死亡，在該HAT培養(yǎng)基中的培養(yǎng)可以進行足夠的時間通常為數(shù)日?數(shù)周。
[0127] 得到的雜交瘤產生的抗體包含在上述雜交瘤的培養(yǎng)上清液中。通過與測定上述多克隆抗體的方法同樣地測定該抗體的反應性或反應特異性等，可以選擇性獲得產生本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的雜交瘤。
[0128] 通過將得到的雜交瘤利用有限稀釋法進行克隆，可以得到產生單一的單克隆抗體的雜交瘤克隆。該雜交瘤克隆使用加入有約1?約10%左右的預先除去了 FBS中所含的牛抗體（IgG)的FBS的培養(yǎng)基或者無血清用培養(yǎng)基來進行培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)上清液作為精制目標單克隆抗體的原料。另一方面，也可以將得到的雜交瘤克隆移植到預先給予了姥鮫烷的Balb/c小鼠或者Balb/c(nu/nu)小鼠的腹腔內，在10?14日后采集高濃度地含有單克隆抗體的腹水，作為精制目標單克隆抗體的原料。精制單克隆抗體的方法可以通過使用通常的免疫球蛋白精制法例如硫酸銨分級法（ammonium sulfate fractionation)、聚乙烯分級法、乙醇分級法、陰離子交換色譜法、結合有蛋白A、蛋白G或抗小鼠免疫球蛋白抗體等的親和色譜法等來實施。
[0129] 如此得到的本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體可以直接使用，也可以以通過規(guī)定的方法即番木瓜蛋白酶處理得到的Fab形式或者以通過胃蛋白酶處理得到的F(ab'） 2 或Fab'的形式使用。另外，通過其本身已知的方法獲得含有該抗體的Η鏈和L鏈這兩可變區(qū)內的互補決定區(qū)（CDR)、或超可變區(qū)等的片段或編碼它們的基因，此外人型的抗體也包含在本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體中。此外，使用噬菌體展示法或人抗體產生小鼠等制備的完全人抗體也包含在本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體中。此外，上述產生單克隆抗體的雜交瘤細胞系也包含在本發(fā)明中。作為本發(fā)明的雜交瘤的具體例子，可列舉出在以下的實施例中獲得的具有保藏編號為FERM BP-10871或者為FERM BP-10872的雜交瘤。
[0130] 將非人（小鼠、大鼠、倉鼠、兔等）抗體人型化后得到的抗體（以下稱為人源化抗體）是嵌合體免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（例如Fv、Fab'、F(ab'） 2或者抗體之外的抗原結合亞序列），其包含非人免疫球蛋白來源的最小序列。作為人源化抗體，特別優(yōu)選通過改變具有非人抗體的互補決定區(qū)（CDR)的抗體的序列，由人抗體生殖胚系來源的氨基酸序列部分地或整體地構成的抗體。這種改變通過用人抗體的恒定區(qū)替換非人抗體恒定區(qū) 來實現(xiàn)，能夠制成在醫(yī)藥應用中具有可容許程度的低的免疫原性的人/非人嵌合體。更優(yōu) 選甚至是將抗體的可變區(qū)和CDR通過到目前為止本領域所公知的技術進行人源化。有時也將可變區(qū)的框架區(qū)用相應的人框架區(qū)替換，非人CDR實質上沒有變化或者被其人基因組來源的序列替換。
[0131] 人源化抗體進一步是包含人框架和至少1個非人抗體來源的⑶R的抗體，這里存在的任意的恒定區(qū)表示與人免疫球蛋白恒定區(qū)實質上相同。實質上相同表示至少85? 100%、優(yōu)選95?100%的氨基酸序列相同。即，該人源化抗體的除了 CDR部分外的所有部分和與1個或1個以上的天然的人免疫球蛋白序列對應的部分相同。
[0132] 人源化抗體在作為藥品用于人的治療的情況下，與非人抗體和嵌合體抗體相比至少具有3個優(yōu)點。
[0133] 1)由于效應部分為人，因此與人體內的免疫反應中的其他因子的相互作用良好。例如，通過補體依賴性細胞毒性（CDC)或者抗體依賴性細胞毒性（ADCC)高效地破壞靶細胞。
[0134] 2)認為人免疫系統(tǒng)不會將人源化抗體的框架或者恒定區(qū)作為外源物進行識別。因此，認為當將該人源化抗體給予人體內時，抗原抗體反應比對非人抗體或者嵌合體抗體的反應低。
[0135] 3)還報告在人的循環(huán)系統(tǒng)中，給予的非人抗體的半衰期比人抗體的短。在給予了人源化抗體的情況下，期待具有與天然的人抗體本質上相同的半衰期，給藥量和給藥頻率可以更少。
[0136] 將非人抗體進行人源化的方法是本領域熟知的。例如通過Winter等的方法（日本專利第 2912618 號公報）、Jones 等的方法（Nature, 321 :522(1986))、Riechmann 等的方法（Nature，332 :323 (1988) )、Verhoeyen 等的方法（Science，239 :1534 (1988) )、Queen 等的方法（Proc. Natl. Acad. Sci.USA88 :2869(1991))等來實施。在獲得人源化抗體的作業(yè) 中，為了使表達人源化抗體的宿主細胞中的表達最優(yōu)化，優(yōu)選進行密碼的沉默突變（例如 Nakamura等的方法：Nuclecic Acid Res29 :292(2000))。如此得到的抗體只要具有本申請所述的特異性，則下述人源化抗體也包含在本申請發(fā)明中，該人源化抗體的特征在于其在所述可變區(qū)中具有1個以上的氨基酸的缺失、替換、插入或者添加形成的氨基酸序列。
[0137] (4)抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對抗原的反應性的測定
[0138] 下面說明用于測定本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對抗原的反應性的 ELISA、點印跡法的具體的方法的例子。作為ELISA，可列舉出例如固相ELISA、液相ELISA 等。另外，還可以測定本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對抗原的解離常數(shù)?？贵w的解離常數(shù)的測定可以使用BIAC〇re(BIACORE公司制）等儀器或通過按照它的方法來進行。
[0139] (a)包覆淀粉樣蛋白球體的固相載體和淀粉樣蛋白球體固相ELISA
[0140] 通過使用包覆有淀粉樣蛋白球體的固相載體來測定抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對抗原的反應性，能夠對抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體進行測定。這里，作為固相載體，可列舉出聚苯乙烯、聚丙烯等塑料制的球狀、棒狀、板狀等的載體，優(yōu)選塑料制板。為了使淀粉樣蛋白球體包覆到固相載體上，可列舉出使用常用方法例如吸附法、交聯(lián)劑的方法等，從簡便性出發(fā)，優(yōu)選使用使淀粉樣蛋白球體物理吸附的吸附法。
[0141] 作為使用了包覆淀粉樣蛋白球體的固相載體的測定法，具體而言，可列舉出淀粉樣蛋白球體ELISA。首先，在Nunc公司制等的ELISA板上涂布上述（2)中制備的淀粉樣蛋白球體。此時，溶劑只要不使淀粉樣蛋白球體脫締合，可以是任意溶劑，但優(yōu)選使用例如 PBS(-)。將該板用適當?shù)娜芤?、例如含?. 05% TWeen20等表面活性劑的生理鹽水等洗滌，用牛血清白蛋白/磷酸緩沖液（Phosphate buffered saline :PBS)等封閉，然后使之與上述得到的抗體反應。之后，在進一步洗滌后，使之作為第二抗體（二抗）和與免疫動物的免疫球蛋白反應的抗體接觸。同樣地洗滌后，以被標記物的活性等為指標，檢測結合在板上的所述第二抗體。這種被標記物的活性可以使用例如ELISA酶標儀（ELISA plate reader)等進行測定。另外，使用淀粉樣蛋白球體ELISA，可以確定本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的抗原決定部位（表位）。具體而言，通過淀粉樣蛋白球體ELISA，可以測定β淀粉樣蛋白單體蛋白的片段與抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的結合競爭抑制并確定表位。也可以多個組合β淀粉樣蛋白單體蛋白的片段。此外，通過淀粉樣蛋白球體ELISA，可以測定表位已知的抗體與抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的結合競爭抑制并確定表位。此外，表位的確定可以通過"Antibodies :A LABORATORY MANUAL"(Ed Harlow et al.，Cold SpringHarbor Laboratory(1988))等的實驗書中記載的方法或通過按照它的方法來進行。
[0142] (b)淀粉樣蛋白球體液相ELISA
[0143] 使含有抗淀粉樣蛋白球體的抗體的樣品例如雜交瘤培養(yǎng)上清液與淀粉樣蛋白球體在室溫下混和1小時以上并反應。向預先涂布了適量的兔抗淀粉樣蛋白球體IgG并用例如牛血清白蛋白/PBS封閉的ELISA板上添加一定量的上述混合液，并使其在室溫下反應1 小時以上。然后，在進一步洗滌后，使其作為第二抗體和與樣品中的免疫球蛋白反應的抗體例如抗小鼠 IgG抗體、抗小鼠 IgM、抗小鼠免疫球蛋白接觸。同樣地洗滌后，以被標記物的活性等為指標檢測板上結合的所述第二抗體。這種被標記物的活性可以使用例如ELISA酶標儀等來進行測定。
[0144] (c) β淀粉樣蛋白單體ELISA
[0145] 使含有抗體的樣品例如雜交瘤培養(yǎng)上清液與在N末端結合有生物素的β淀粉樣蛋白單體蛋白或在C末端結合有生物素的β淀粉樣蛋白單體蛋白混合并在室溫下反應1 小時以上。將該混合液添加到預先用牛血清白蛋白/PBS封閉的鏈霉親和素 ELISA板上，使其在室溫下反應30分鐘以上。然后，在洗滌后使其作為第二抗體和與樣品中的免疫球蛋白反應的抗體例如抗小鼠 IgG抗體、抗小鼠 IgM、抗小鼠免疫球蛋白接觸。同樣地洗滌后，以被標記物的活性等為指標檢測板上結合的所述第二抗體。這種被標記物的活性可以使用例如 ELISA酶標儀等進行測定。
[0146] (d)點印跡法
[0147] 下面說明用于測定本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對抗原的反應性的點印跡法的具體方法的例子。首先，使用Bio Rad公司制等的市售的Blotter等，將適量的上述（2)中制備的淀粉樣蛋白球體在硝酸纖維素膜等上印跡。此時，溶劑只要不使淀粉樣蛋白球體脫締合，則可以是任意溶劑，優(yōu)選使用例如PBS(-)。除了對淀粉樣蛋白球體進行印跡（blotting)以外，也對β淀粉樣蛋白單體蛋白或其部分肽、溶劑本身進行印跡以作為對照。在將該膜用適當?shù)木彌_液例如磷酸緩沖液（Phosphate buffered saline,PBS)等洗漆并用脫脂乳/TTBS(Tween_Tris buffered saline)等封閉后，使膜與上述得到的抗體接觸，然后，在進一步用TTBS等洗滌后，使其作為第二抗體和與免疫動物的免疫球蛋白反應的抗體接觸，將其同樣地洗滌后，以被標記物的活性等為指標檢測膜上結合的所述第二抗體。作為對照，優(yōu)選使用與β淀粉樣蛋白單體蛋白反應的抗體。作為這樣的抗體，可列舉出例如 "6Ε10"（Senetek 公司制）等。
[0148] (5)抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性的分析
[0149] 下面說明本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體具有的、抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性（下文有時也將其稱為"神經細胞毒性中和活性"或者"抑制神經細胞死亡誘導的活性"）的分析方法的例子。
[0150] 首先，使用了淀粉樣蛋白球體的神經細胞死亡的誘導可以如下進行：在神經系統(tǒng) 的細胞等的培養(yǎng)液中添加上述淀粉樣蛋白球體，按照通常的方法進行培養(yǎng)。這里，當分析本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體是否具有該神經細胞毒性中和活性時，可以如下進行：在抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的存在下，將上述神經細胞與淀粉樣蛋白球體一起培養(yǎng)，確認未誘導神經細胞死亡。由淀粉樣蛋白球體誘導的細胞死亡可以是凋亡或壞死中的任意一種。另外，作為使用的細胞，只要是神經系統(tǒng)細胞，則沒有特殊限制，優(yōu)選哺乳動物 (人、大鼠、小鼠、猴、豬等）來源的神經系統(tǒng)細胞。另外，優(yōu)選原代培養(yǎng)細胞。作為原代培養(yǎng) 細胞，優(yōu)選從上述動物的海馬和前腦基底、大腦皮質等獲得的細胞。另外，也可以直接使用將上述動物的海馬等器官培養(yǎng)得到的細胞。另外，也可以使用從ES細胞等分化誘導得到的神經細胞。
[0151] 這些細胞或器官可以按照通常的培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。具體而言，作為神經系統(tǒng) 細胞的原代培養(yǎng)和神經系統(tǒng)已構建細胞株的培養(yǎng)方法，可以使用Hoshi，M. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,93, 2719-2723 (1996)和 Schubert, D.et al·，Nature, 249 (454)， 224-227(1974)中記載的方法等，關于器官培養(yǎng)，可以使用Gary Banker and Kimbery Goslin, Culturing nerve cells, 2nd Edition, MIT Press, Cambridge (1998)中記載的方法等。為了誘導這樣培養(yǎng)的神經系統(tǒng)的細胞和器官發(fā)生細胞死亡，所添加的淀粉樣蛋白球體的量可以適當選擇，淀粉樣蛋白球體通常能夠與阿爾茨海默病等的患者的腦內存在的毒性β淀粉樣蛋白以實質上同等的濃度誘導細胞死亡。例如，上述（2)中得到的淀粉樣蛋白球體如上所述，能夠以培養(yǎng)液中的β淀粉樣蛋白濃度為約1 μ g/ml以下、更優(yōu)選為約 0. 45μ g/ml以下等的量誘導原代培養(yǎng)細胞發(fā)生細胞死亡。但是，上述濃度僅是為了舉例，并不受該量的限定。
[0152] 存在于該培養(yǎng)中的本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的量可以根據所用的抗體對抗原的反應性來適當選擇，具體而言，優(yōu)選例如以約0. 0001?約lmg/ml的量存在。另外，抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體向所述培養(yǎng)液中添加的時期只要能夠確認神經細胞毒性中和活性，則沒有特殊限制，淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導是從培養(yǎng)后約6小時左右開始被誘導的，因此預先在這之前優(yōu)選在培養(yǎng)初期添加。此外，將淀粉樣蛋白球體與抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體在另外的容器中孵育后，添加到所述培養(yǎng)液中。另外，作為對照，優(yōu)選使用與淀粉樣蛋白球體不反應的抗體或對淀粉樣蛋白球體的反應性低且其反應性不影響對神經細胞死亡的誘導的抗體。作為這樣的抗體，優(yōu)選可以使用例如抗β淀粉樣蛋白單體蛋白的抗體，具體而言，例如"6Ε10"（Senetek公司制）等。
[0153] 由淀粉樣蛋白球體誘導的神經細胞死亡通常在添加了有效量的淀粉樣蛋白球體后、從約6小時左右開始發(fā)生，在約48小時左右后，能夠觀察到明顯的細胞死亡。因此，在該分析方法中，當測定對神經細胞死亡的誘導時，優(yōu)選開始培養(yǎng)的約20小時以后，但可以根據使用的淀粉樣蛋白球體的細胞死亡活性體系來適當選擇。
[0154] 作為測定這些神經細胞死亡活性的方法，可以使用通常所用的細胞死亡檢測法。具體而言，可以使用 MTT 活性測定法（Mossman, T.，J. Immunol. Methods, 65, 55 (1983))、使用碘化丙陡（Ankarcrona，M.et al·，Neuron, 15, 961 (1995))等的染色法、或臺盼藍拒染法(Trypan blue dye exclusion)(Woo, K. B. , Funkhouser, ff. K. , Sullivan, C. and Alabaster, 0·，Cell Tissue Kinet.，13(6)，591-604(1980))、檢測 TUNEL 或片段化 DNA 的 ELISA (Roche公司制）等。其中，特別優(yōu)選使用碘化丙啶等的染色法或檢測片段化DNA的 ELISA。使用碘化丙啶等的染色法可以是使用僅選擇性地對死亡細胞進行染色的碘化丙啶進行單一染色，也可以與其他多種染色色素組合使用。作為可組合的染色色素，具體而言，優(yōu)選選擇性地對活細胞進行染色的Calcein-AM(Molecular Probes公司制）、對全部細胞進行染色的Hoechst33258(H33258，BisbenzimideH33258)等。
[0155] 另外，本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體抑制對神經細胞死亡的誘導的活性也可以通過將本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體直接給予動物個體來進行。由淀粉樣蛋白球體誘導的細胞死亡可以是凋亡或壞死中的任意一種。另外，作為所用的動物，只要是具有哺乳動物（小鼠、大鼠、靈長類等）等的神經系統(tǒng)細胞的動物，則沒有特殊限制，優(yōu)選可以使用阿爾茨海默病的模型動物等特別是正在發(fā)生神經細胞死亡的動物。另外，給藥方法除了向腦等神經系統(tǒng)細胞存在的部位直接給藥的方法外，還可以使用經口給藥法、靜脈注射法、腹腔給藥法等通常藥物給藥中所使用的方法。作為向腦等神經系統(tǒng)細胞存在的部位直接給藥的方法，具體而言，例如在大鼠或小鼠等的腦組織的情況下，可以用滲透泵向靶部位附近的腦室內給藥的方法、用微量加液器等向靶部位的腦實質進行微灌流（micro fusion，microperfusion)的方法等，并在給藥一定期間后，使用PET · MRI測量腦功能的變化，然后快速取出給藥部位周圍的組織，制成組織切片，從而能夠檢驗有無神經細胞死亡。有無神經細胞死亡的檢驗可以通過組織染色法或Western印跡法等來進行，作為組織染色法，可列舉出TUNEL染色或利用抗Caspase抗體等的免疫染色等。
[0156] (6)阿爾茨海默病的治療/和預防藥以及篩選方法
[0157] 當?shù)矸蹣拥鞍浊蝮w被添加到神經系統(tǒng)的培養(yǎng)細胞中時，其能夠導致所述細胞死亡，因此認為在阿爾茨海默病中，同樣地β淀粉樣蛋白自締合形成的淀粉樣蛋白球體會誘導神經變性。
[0158] 本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體顯示對該淀粉樣蛋白球體的高的反應性，具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性，因此通過使受檢物與本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體競爭地與淀粉樣蛋白球體結合，并以其反應性為指標對物質進行選擇，能夠進行阿爾茨海默病的治療/和預防藥的篩選。另外，本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體本身即可作為阿爾茨海默病的治療/和預防藥的有效成分。即，本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體由于對以淀粉樣前體蛋白為代表的淀粉樣蛋白β的單體或能夠形成該單體的其他的結構體的反應性低、而對腦的特異性高，因此與W02006/016644號公報中已知的以往的抗淀粉樣蛋白球體抗體相比，能夠成為安全性更高的阿爾茨海默病的治療藥。
[0159] 下面說明所述物質的篩選方法的具體例子。作為受檢物，可列舉出例如肽、蛋白、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產物、細胞提取液、植物提取液、動物組織提取液等，這些化合物可以是新型的化合物，也可以是公知的化合物。關于與淀粉樣蛋白球體的反應性，可列舉出在分析上述（4)的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體與淀粉樣蛋白球體的反應性的方法中，在反應液中添加上述受檢物來進行的方法等。淀粉樣蛋白球體、抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體和受檢物的混合量可以通過分別選擇適當?shù)臐舛葋磉M行。
[0160] 受檢物優(yōu)選用標記物等預先進行了標記。通過所述分析，能夠判斷與淀粉樣蛋白球體結合的物質可以用作阿爾茨海默病的治療/和預防藥的有效成分。此外，優(yōu)選用選擇的物質代替上述（5)中記載的方法中的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體來確認是否抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導。
[0161] 如此選擇的物質和本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體本身作為用于阿爾茨海默病的預防和/或治療的藥物的有效成分是有用的，也可以是生理學上可容許的它們的鹽、水合物以及溶劑合物等。優(yōu)選添加 Fe或Ζη等的金屬離子或糖鏈、糖蛋白而成的物質。作為生理學上容許的鹽，可列舉出例如鹽酸鹽、硫酸鹽等無機酸類的鹽，檸檬酸鹽、草酸鹽、對甲苯磺酸鹽等有機酸的鹽，甘氨酸等氨基酸的鹽等。另外，抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體更優(yōu)選使用通過上述方法改變?yōu)槿诵偷目贵w或者完全人抗體?？贵w的適于對人等進行給藥的改變可以組合其本身公知的方法來進行。
[0162] 本發(fā)明提供的藥品含有將根據本發(fā)明的篩選方法判定為對神經細胞死亡具有抑制作用的物質或者本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體以作為有效成分，并能夠用作用于阿爾茨海默病的預防和/或治療的藥品。根據本發(fā)明的篩選方法判定為對神經細胞死亡具有抑制作用的物質和抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體其本身可以作為藥品給予患者，但通常優(yōu)選制造成含有這些有效成分中的1種或2種以上的藥物組合物來給予患者。作為這樣的藥物組合物，可以例舉片劑、膠囊劑、顆粒劑、細粒劑、散劑、丸劑、錠劑（troche)、舌下劑或液體制劑等經口給藥的制劑、或者注射劑、栓劑、軟膏、貼劑等非經口給藥用的制劑。
[0163] 經口給藥用的片劑或膠囊劑通常以單位給藥物的形式提供，其可以通過添加粘合齊?、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、香味劑和濕潤劑等通常制劑用載體來進行制造。片劑可以按照本領域公知的方法、例如使用腸溶性包衣劑等進行包衣，并使用例如填充劑、崩解劑、潤滑劑、濕潤劑等來進行制造。
[0164] 經口給藥用的液體制劑除了例如水性或油性懸浮液、溶液、乳液、糖漿劑或酏劑等之外，還可以以在使用前能夠用水或適當?shù)慕橘|再溶解的干燥制劑的形式提供。這樣的液體制劑中可以配合通常的添加劑例如抗沉降劑、乳化劑、保存劑以及根據需要的通常的香味劑或著色劑。
[0165] 經口給藥劑的制劑可以通過混合、填充或壓片等本領域公知的方法來制造。另外，還可以使有效成分分布到通過反復配合操作并使用大量填充劑等制成的制劑中。非經口給藥用的制劑通常以含有作為有效成分的物質和滅菌介質的液體載體給藥量制劑的形式提供。非經口給藥用的溶劑通常通過將作為有效成分的物質溶解到介質中并滅菌過濾，接著填充到適當?shù)男∑炕虬碴持胁⒚芊鈦碇圃?。為了提高穩(wěn)定性，可以將組合物冷凍后填充到小瓶中，并在真空下除去水。非經口懸浮液實質上可以采用與非經口溶液相同的方法來制造，但優(yōu)選通過將有效成分懸浮到介質中并用環(huán)氧乙烷等進行滅菌來制造。另外，為了使有效成分均勻分布，還可以根據需要添加表面活性劑、濕潤劑等。
[0166] 作為有效成分的物質的給藥量可以通過考慮物質的活性的強弱、治療或預防的目的、患者的癥狀、體重、年齡或性別等來適當確定。另外，優(yōu)選分成每日1?數(shù)次進行給藥。例如，當本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體為有效成分時，其給藥量在1次給藥中可以以每kg體重通常為約1 μ g?約100mg、優(yōu)選為約10 μ g?約50mg的量來進行給藥。
[0167] (7)使用了抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的阿爾茨海默病個體的檢測方法和檢測用試劑
[0168] 當將淀粉樣蛋白球體添加到神經系統(tǒng)的培養(yǎng)細胞中時，會導致所述細胞死亡，因此認為在阿爾茨海默病中，同樣地β淀粉樣蛋白單體蛋白自締合形成的淀粉樣蛋白球體會誘導神經變性。由于本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體對淀粉樣蛋白球體具有高的反應性，因此通過使用該抗體對生物試樣中的淀粉樣蛋白球體進行檢測，能夠進行阿爾茨海默病個體的檢測。
[0169] 作為生物試樣，可列舉出從懷疑具有阿爾茨海默病的個體獲得的血液、腦脊髄液、尿等體液等，其中特別優(yōu)選血液。該試樣可以如下獲得：例如在血液的情況下，可以從懷疑具有阿爾茨海默病的個體的肘靜脈等通過采血管等進行采血并利用離心分離等方法將血漿或血清分離來得到。另外，在將腦脊髄液作為試樣的情況下，可以從懷疑具有阿爾茨海默病的個體通過例如麻醉下的腰椎穿刺來采集腦脊髄液并進行離心分離而得到。為了防止獲得的生物試樣中的淀粉樣蛋白球體變化或血液凝固等，優(yōu)選在試樣采集時或樣品采集后向試樣中加入酶抑制劑。作為酶抑制劑，可以使用蛋白分解酶抑制劑例如抑肽酶 (aprotinin)、抗蛋白酶（antipain)、胃蛋白酶抑制素（pepstatin)、亮肽素（leupeptin)、 EGTA、PMSF(苯基甲磺酰氯）、TLCK(磺酰賴氨酸氯甲基酮）等。對得到的機體樣品進一步根據需要進行濃縮等，能夠提高淀粉樣蛋白球體的檢測靈敏度。
[0170] 使用了該抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的生物試樣中的淀粉樣蛋白球體的檢測可以使用其本身已知的免疫學測定法。具體而言，可以使用例如夾層法、競爭法 (competition method)、免疫測定法（Immunometric assay)、散射測池法（nephelometry) 等。在夾層法中，通過使生物試樣與經固相化的本發(fā)明的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體接觸，進而與經標記的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體反應，然后測定結合于固相的標記物的信號，從而能夠測定生物試樣中的淀粉樣蛋白球體量。當通過這樣的免疫學測定方法來測定生物試樣中的淀粉樣蛋白球體量時，優(yōu)選利用使用含有已知量的淀粉樣蛋白球體的標準液制作的標準曲線來計算。詳細而言，可以按照生化學実験法11《I >吁4 A 4 A 7 7 7 七 ?〉（Tijssen Ρ·著、東京化學同人）、"Antibodies :A LABORATORY MANUAL"（Ed Harlow et al·，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))等實驗書，適當?shù)剡x擇、組合來進行。另夕卜，本發(fā)明中也包括這些檢測中使用的、包括抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的用于阿爾茨海默病個體檢測的試劑。
[0171] 實施例
[0172] 以下通過實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不受這些實施例的任何限定。需要說明的是，在下述實施例和本說明書中，"PBS"表示"磷酸緩沖液鹽（Phosphate Buffered Saline)，'、"TTBS，'表示"吐溫/Tris 緩沖液鹽（Tween-Tris Buffered Saline)，'、"HRP"表不"辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase)"。
[0173] 實施例1 :淀粉樣蛋白球體含有液的制備
[0174] (1) β 40淀粉樣蛋白（序列號1)樹脂的制造
[0175] 將 Fmoc-Val 樹脂 342mg (胺含量為 0· 73mmol/g 的樹脂）放置到 PerkinElmer Applied Biosystems公司制的A433型自動肽合成機中，向其供給Fmoc-Val-〇H、 Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-〇H、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc_Gly-〇H、 Fmoc_Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-Asn (Trt) -〇H、Fmoc-Ser (tBu) -〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Asp (OtBu) -〇H、 Fmoc-Glu(0tBu)-0H、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-〇H> Fmoc-Lys(Boc)-〇H> Fmoc-Gln(Trt)-〇H> Fmoc-His(Trt)-〇H> Fmoc-His (Trt) -〇H、Fmoc-Val-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Tyr (tBu) -〇H、Fmoc-Gly-〇H、 Fmoc-Ser (tBu)-〇H、Fmoc-Asp (OtBu)-〇H、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-Arg(Pmc)-〇H、 Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Glu (OtBu) -OH、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Asp (OtBu) -0H，并以 HBTU (2- (1H-苯并三氮唑-1基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸鹽）為縮合劑使其依次縮合，得到側鏈保護 β40淀粉樣蛋白樹脂1.515g。
[0176] (2)三氟乙酸處理
[0177] 取上述（1)中得到的側鏈保護β 40淀粉樣蛋白樹脂中的304mg，向其中加入苯酚 0. 75ml、茴香硫醚0. 5ml、三氟乙酸8. 25ml、乙烷二硫醇0. 25ml和蒸餾水0. 5ml，用冰冷卻5 分鐘，接著在室溫下使其反應1. 5小時。反應結束后，加入用冰冷卻了的二乙基醚200ml，使肽沉淀。用玻璃過濾器過濾得到全部內容物，用冷二乙基醚洗滌，然后用含有35%的乙腈的 0· 1%三氟乙酸（約 200ml)進行提取處理，得到以 H-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-L ys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-〇H 表不的粗膚 191mg。
[0178] (3)肽的精制
[0179] 將該粗肽溶解到含有35%的乙腈的0. 1%三氟乙酸（40ml)中，利用HPLC進行精制，所述HPLC使用了在二氧化硅上結合有0DS (十八烷基硅烷）的反相柱（內徑為2cm、長度為25cm)。洗脫是通過在0. 1 %三氟乙酸中用20分鐘使乙腈濃度從22%直線上升到42% 來進行的。精制物的獲得量為35mg。該物質的結構用MALDI-T0F質量分析來確認。相對于測定值_!1]+433〇.99，計算值（(： 194!129#53〇5831+!1)為433〇.89。另外，關于0 42淀粉樣蛋白，將按照上述方法進行合成/生成得到的β42淀粉樣蛋白和從Bachem公司購買的β42 淀粉樣蛋白二者用于下述實驗。
[0180] (4)淀粉樣蛋白球體含有液的制備
[0181] 將上述（3)中精制得到的lOnmol的β 40淀粉樣蛋白放入1. 5ml容量的Eppendorf tube中，向其中依次加入500 μ 1的超純水和500 μ 1的Dulbecco磷酸緩沖液（-)(Nissui 公司制；下文也稱為PBS(-))，使β淀粉樣蛋白完全溶解。將裝有該β淀粉樣蛋白水溶液的 Eppendorf tube 安裝到 Duck rotor(TAITEC 公司制、rotor :RT50)上，使其在 37°C 下以 35rpm的速度旋轉7日，從而制備淀粉樣蛋白球體40。對于β 42淀粉樣蛋白（上述（3)中精制得到的β 42淀粉樣蛋白或者Bachem公司制），按照上述方法，使其旋轉約10小時，從而制備淀粉樣蛋白球體42。
[0182] 實施例2 :倉鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體的制備
[0183] 將在PBS中制備的淀粉樣蛋白球體42和等量的弗氏完全佐劑（WAK0公司制）混合乳化，在亞美尼亞倉鼠背部皮下用0. 2ml進行免疫（16 μ g/0. 2ml/倉鼠）。每隔2周，用經弗氏不完全佐劑（Sigma-Aldrich公司制）乳化的淀粉樣蛋白球體同樣地進行免疫。在5 次免疫后，從頸動脈采血制備血楽。用1%牛血清白蛋白（BSA，fraction V;Sigma-Aldrich 公司制）溶液（PBS(-)中）將血漿連續(xù)稀釋，測定對下述的淀粉樣蛋白球體固相ELISA法淀粉樣蛋白球體的反應性。
[0184] 對進行6?12次免疫后反應性充分上升的個體，最后向腹腔內給予淀粉樣蛋白球體16μ g(PBS(-)0. 2ml中）以進行加強。在加強3日后回收脾細胞，通過使用聚乙二醇4000 的常用方法，將其與為脾細胞數(shù)的1/2的小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0-Agl4)進行細胞融合。將融合得到的細胞懸浮到含有10%胎牛血清、10% BM condimed H_1 (Roche Diagnostics公司制）和HAT(Sigma-Aldrich公司制）的GIT培養(yǎng)基（WAK0公司制）中，按照每孔5X 104 個骨髓瘤細胞/〇. lml培養(yǎng)液的方式播種到96孔板（FALCON公司制）中。3日后追加培養(yǎng) 液，在7日后更換培養(yǎng)液，再培養(yǎng)2?3日后回收上清液。用下述ELISA法檢查上清液中的抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體，將產生特異性抗體的細胞擴展（expand)到24孔板（IWAKI 公司制）中。在利用有限稀釋法進行克隆時，將雜交瘤以每孔200μ1培養(yǎng)液播種到96孔板中，并達到0. 3Cell/well，每周更換一次一半培養(yǎng)液地進行培養(yǎng)。
[0185] 將從如此得到的產生倉鼠單克隆抗體的雜交瘤H3-17-2-2 (雜交瘤haASD 1)、 H5-3-2-45(雜交瘤 haASD2)、H5-24-7、H5-47-10、H4-3-5-4 獲得的抗體分別稱為 haASDl、 haASD2、haASD3、haASD4、haASD5。
[0186] 將雜交瘤 haASDl 以 FERM BP-10871、將雜交瘤 haASD2 以 FERM BP-10872 于 2007 年（平成19年）7月13日保藏于日本獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心（日本國茨城県< ti'市東一丁目1番地1中央第6)。
[0187] 從雜交瘤 H3-17-2-2、H5-3-2-45、H5-24-7、H5-47-10、H4-3-5-4 獲得的抗體的分離精制如下進行。將雜交瘤在約1L的⑶Hybridoma培養(yǎng)基（Invitrogen公司制）中培養(yǎng)1周，通過離心分離回收培養(yǎng)上清液。將其用0. 45 μ m的過濾器過濾，然后將其添加到用 PBS(-)平衡了的2ml的Protein-A瓊脂糖（S印harose)中，之后與W02006/016644號的實施例2(1)同樣地分離精制IgG抗體。
[0188] 實施例3抗體的性狀分析
[0189] (1)淀粉樣蛋白球體固相ELISA法（與淀粉樣蛋白球體的反應性的確認）
[0190] 在96孔ELISA板（Nunc公司制MaxiSorp)中添加 50 μ 1的在1/2濃度PBS (-)中稀釋至1 μ g/ml的淀粉樣蛋白球體42,并在4°C下過夜。在室溫下添加 1 %牛血清白蛋白 (BSA，fraction V ;Sigma-Aldrich公司制）溶液（PBS(-)中）1小時以上以封閉非特異性結合部位，然后用水洗滌平板。添加 50 μ 1的用1%牛血清白蛋白溶液（PBS(-)中）稀釋的抗血清或雜交瘤培養(yǎng)上清液，使其在室溫下反應1小時以上。用含有0. 05% Tween20的生理鹽水洗滌平板5次，然后同樣添加稀釋至1 μ g/ml的過氧化物酶標記的第二抗體（抗倉鼠 IgG抗體（ROCKLAND公司制）），使其在室溫下反應1小時。在洗滌5次后，添加底物溶液，使其顯色一定時間，用酶標儀測定吸光度。
[0191] 實施例2中構建的倉鼠單克隆抗體的代表例的結果示于圖1。實施例2中構建的抗體以低濃度對淀粉樣蛋白球體顯示強的反應性。
[0192] (2)點印跡分析（與淀粉樣蛋白球體、β淀粉樣蛋白纖維、β淀粉樣蛋白單體和淀粉樣前體蛋白的反應性的確認）
[0193] 使用Blotter (BioRad公司制）將溶于溶劑1，1，1，3, 3, 3,-六氟-2-丙醇 (Sigma-Aldrich公司制）的β 40淀粉樣蛋白或42單體蛋白、實施例1中制備的淀粉樣蛋白球體40或42含有液、由β 40淀粉樣蛋白制備的Αβ纖維和市售的淀粉樣前體蛋白 sAPP a (Sigma公司制）分別以每個5ng吸印到硝酸纖維素膜（Schleicher&Schuell, 0. 2 μ ) 上，將該膜用PBS (-)洗滌，然后從Blotter取下。
[0194] 將吸印有上述蛋白質的膜用5%脫脂乳/0. 05% TTBS封閉1小時后，浸到兔多克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體（rpASDl、rpASD2、rpASD3) (0. 01 μ g/mL)、小鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體（mASD3) (0. 05 μ g/mL)、和實施例2中獲得的抗體haASDl (0. 01 μ g/ mL)中，在濕氣箱中在4°C下反應過夜。然后，將該膜用0.05% TTBS洗滌，使其作為第二抗體與0. 05?1 μ g/ml的結合有辣根來源的過氧化物酶的抗兔IgG或抗小鼠 IgG或者抗倉鼠 IgG反應1小時。然后，用0. 05% TTBS洗滌，除去未反應的第二抗體，浸到SuperSignal West-Femto (Pierce 公司制）中孵育 5 分鐘，然后用 Image Analyzer"LAS_1000plus"(Fuji Photo Film公司制）檢測化學發(fā)光信號和獲取圖像數(shù)據。作為上述抗體反應性的對照，使用0· 5 μ g/mL的抗β淀粉樣蛋白抗體"6E10"（Senetek公司制）和0· 04 μ g/mL的抗APP N-末端抗體"22C11"（Chemicon公司制）作為第一抗體（一抗）。
[0195] 其結果示于圖2。
[0196] 圖2中，Α β 1-40和Αβ 1-42分別示出單體、實施例1中制備的淀粉樣蛋白球體40 含有液及其l〇〇kDa超濾膜滯留級分、和淀粉樣蛋白球體42含有液及其100kDa超濾膜滯留級分的點；fibril表示由Αβ 1-40制備的Αβ纖維的點；另外，sAPPa表示市售的淀粉樣前體蛋白（Sigma公司制）的點。由圖可知，市售的抗β淀粉樣蛋白抗體"6E10"與實施例1 中制備的淀粉樣蛋白球體40、淀粉樣蛋白球體42、單體、纖維、sAPPa蛋白質均發(fā)生反應，與此相對，實施例2中構建的倉鼠單克隆抗體（haASDl)與淀粉樣蛋白球體40和淀粉樣蛋白球體42高選擇性地發(fā)生反應,而對淀粉樣前體蛋白sAPPa完全不顯示反應性。
[0197] (3)解離常數(shù)測定
[0198] 在50mM醋酸緩沖液中，將10μ g/ml淀粉樣蛋白球體（42ASPD)、β淀粉樣蛋白單體（42Αβ、40Αβ)、由 40Αβ 制備的 Αβ 纖維（fibril)耦合到 BIACore3000(BIAcore 公司制）的 CM5 傳感器芯片上。使用用 10mM HEPES、pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005% Surfactant P20從最高濃度ΙΟΟηΜ連續(xù)稀釋2倍得到的抗體溶液，求出結合速度常數(shù)和解離速度常數(shù)。利用這些常數(shù)通過下式計算出解離常數(shù)。
[0199] 解離常數(shù)=解離速度常數(shù)/結合速度常數(shù)
[0200] 表1表示小鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體、倉鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體和市售抗體^E10)相對于淀粉樣蛋白球體的解離常數(shù)（Kd)。
[0201] 倉鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體特異性抗體與小鼠單克隆抗淀粉樣蛋白球體抗體同樣具有對Asro的強的親和性（Kdur11?κγ 9μ)，并且顯示比對β淀粉樣蛋白單體或纖維更（1個級別?2個級別）高的選擇性。
[0202] [表1]各種抗淀粉樣蛋白球體抗體的解離常數(shù)
[0203]

【權利要求】
1. 一種抗淀粉樣蛋白球體的單克隆抗體，其對淀粉樣蛋白球體的反應性比對淀粉樣前體蛋白的反應性高，且具有以下的任意1個以上的特征： (i) 對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白纖維的反應性高； (ii) 對淀粉樣蛋白球體的反應性比對β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性高； (iii) 具有抑制淀粉樣蛋白球體對神經細胞死亡的誘導的活性，所述抗體為來自倉鼠的抗體或將該來自倉鼠的抗體人型化后得到的人源化抗體。
2. 根據權利要求1所述的抗體，其對sAPPa的反應性為IC5(I彡ΙΟΟηΜ。
3. 根據權利要求1所述的抗體，其對淀粉樣蛋白球體的反應性是對淀粉樣前體蛋白的反應性的約10?20倍。
4. 根據權利要求1?3任一項所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以及相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和β淀粉樣蛋白纖維的反應性的體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性是對β淀粉樣蛋白纖維的反應性的3 倍以上。
5. 根據權利要求1?3中任一項所述的抗體，其中，在使用相同的抗體濃度和抗體量以及相同的抗原蛋白濃度和抗原蛋白量來比較抗體對淀粉樣蛋白球體和β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性的體系中，抗體對淀粉樣蛋白球體的反應性是對β淀粉樣蛋白單體蛋白的反應性的50倍以上。
6. 根據權利要求1?3中任一項所述的抗體，其中，所述抗體對淀粉樣蛋白球體的解離常數(shù)為1〇_9以下。
7. 根據權利要求1?3中任一項所述的抗體，其中，所述抗體在不顯示對人正常組織的顯著的交叉反應性的情況下，與阿爾茨海默病腦發(fā)生特異性反應。
8. 根據權利要求1?3中任一項所述的抗體，其中，所述抗體對淀粉樣蛋白球體的立體結構特異性表位進行識別。
9. 一種阿爾茨海默病的治療和/或預防藥物的篩選方法，其包括：使受檢物和權利要求1?8中任一項所述的抗體與淀粉樣蛋白球體接觸，并以受檢物對淀粉樣蛋白球體的結合性為指標來選擇候補物質。
10. -種阿爾茨海默病個體的檢測方法，其包括：使從懷疑具有阿爾茨海默病的個體獲得的生物試樣與權利要求1?8中任一項所述的抗體接觸，測定該樣品中有無與該抗體發(fā)生反應的物質。
11. 一種神經細胞保護劑，其含有權利要求1?8中任一項所述的抗體。
12. -種阿爾茨海默病的檢測用的試劑，其含有權利要求1?8中任一項所述的抗體。
13. -種藥品，其含有權利要求1?8中任一項所述的抗體。
14. 一種阿爾茨海默病的治療和/或預防藥物，其含有權利要求1?8中任一項所述的抗體。
【文檔編號】G01N33/68GK104098695SQ201410347530
【公開日】2014年10月15日申請日期:2008年10月29日優(yōu)先權日:2007年10月29日
【發(fā)明者】星美奈子, 佐藤道夫, 井手野祥次, 內藤幸嗣, 保理江智, 野田宗宏, 堀井肇申請人:道健康生活醫(yī)藥株式會社

完整全部詳細技術資料下載