本發(fā)明涉及細胞檢測，尤其是涉及一種用于測定腫瘤細胞變形性的微流控芯片及其檢測方法與應用。

背景技術(shù)：

1、癌癥是一種普遍存在的疾病，癌細胞向遠端器官擴散是導致癌癥死亡的主要原因。細胞力學與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化、惡性程度和轉(zhuǎn)移相關(guān)，細胞內(nèi)病理變化影響細胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能，這使得細胞的力學特征成為其健康狀況的高度敏感標志。在惡性細胞中，細胞骨架從有序的剛性結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則的柔軟狀態(tài)，包括細胞骨架聚合物和輔助蛋白的減少以及網(wǎng)絡(luò)的重組，細胞從成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓮椭?、可運動和“不死”的癌變形式。因此，惡性細胞可能會比成熟的完全分化的細胞更柔軟。相關(guān)研究報道，腫瘤細胞的可變形性和柔軟性增加，會導致腫瘤細胞具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，為了侵襲遠端部位，這些具有侵襲性的腫瘤細胞必須通過變形才能夠穿過腫瘤細胞外基質(zhì)(ecm)和內(nèi)皮屏障中的小空間，并通過比細胞大小更小的微血管循環(huán)。因此，測量細胞的變形能力可以為癌癥的風險評估提供新的依據(jù)，同時也有助于臨床指導個體化用藥以及開發(fā)新型癌癥治療藥物。

2、目前，測量腫瘤細胞變形性主要是通過量化暴露于外部剪切應力下的單個腫瘤細胞的變形能力實現(xiàn)，其相關(guān)技術(shù)包括原子力顯微鏡技術(shù)、光學鑷子技術(shù)和微管吸吮法。盡管這些方法可以提取腫瘤細胞的物理特性(如彈性模量或粘度)，但是其檢測技術(shù)要求高，流程耗時長，價格昂貴，并且難以實現(xiàn)高通量，因此限制了它們在臨床試驗中的應用。近年來微流控芯片作為一種新興技術(shù)備受關(guān)注，由于其具有單細胞、高通量、大規(guī)模、平行性、耗樣品量少、快速和分析數(shù)據(jù)直觀等特征，已被廣泛應用于腫瘤細胞變形性的檢測。其中包括通過逐漸減小通道內(nèi)微柱之間的間隙，阻礙或允許具有不同機械特性的細胞通過檢測裝置，從而分析細胞的變形能力；或者通過狹窄通道施加電場來測量hela細胞的可變形性和與電場的相互作用，然而以上方法在實際應用中極易導致芯片發(fā)生堵塞，降低了細胞形變能力檢測的準確性。

3、綜上所述，雖然腫瘤細胞變形性檢測方法種類繁多，但檢測標準各不相同，不同方法之間的相關(guān)性和一致性不理想，并且存在儀器昂貴、流程耗時長、準確度低、對細胞有損傷等缺點。因此，亟需建立簡單、無損、準確、可靠的腫瘤細胞變形性檢測裝置和檢測新方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出一種微流控芯片，能夠快速準確地檢測腫瘤細胞變形性。

2、本發(fā)明還提出一種微流控芯片的制備方法。

3、本發(fā)明還提出一種檢測系統(tǒng)。

4、本發(fā)明還提出一種微流控芯片或檢測系統(tǒng)在檢測細胞變形性、藥物篩選、分析細胞骨架狀態(tài)或評估細胞遷移能力中的應用。

5、本發(fā)明還提出一種檢測腫瘤細胞變形性的方法。

6、本發(fā)明的第一方面，提供一種微流控芯片，包含入口儲液槽、確定性橫向位移(deterministic?lateral?displacement，dld)段和出口儲液槽，其中：

7、所述確定性橫向位移段由輸入?yún)^(qū)域、若干組縱向排列的半t形微柱陣列和輸出區(qū)域依次連通組成，按照待測樣品流動方向，每組所述半t形微柱陣列的臨界截止尺寸dc值依次遞增，所述dc值的取值范圍為5～20μm；

8、所述輸入?yún)^(qū)域和所述輸出區(qū)域分別設(shè)置有至少兩個子通道，所述入口儲液槽與所述子通道連通。

9、根據(jù)本發(fā)明實施例的微流控芯片，至少具有如下有益效果：

10、本發(fā)明的微流控芯片創(chuàng)造性地提出了采用了半t形微柱陣列用于高效檢測腫瘤細胞的變形性，采用該微流控芯片無需借助電場，且能夠大大降低檢測過程中的堵塞現(xiàn)象，僅需要通過控制半t形微柱陣列的臨界截止尺寸dc值就能夠?qū)崿F(xiàn)高效分選。

11、此外，逐漸增大dc值有助于在前段微柱陣列對較大細胞進行初步篩選，有效減少后續(xù)通道內(nèi)的細胞堆積或堵塞風險，從而提高流體通暢性和檢測穩(wěn)定性。

12、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述半t形微柱陣列包含若干排平行的半t形微柱。

13、在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，所述半t形微柱的兩條邊的一端垂直連接，另一端通過第三邊連接，所述第三邊為弧形。

14、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述半t形微柱的兩條邊的長度分別為25±2μm。

15、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述dld段中所述半t形微柱陣列的組數(shù)為10～30，相鄰兩組所述半t形微柱陣列的對應的所述dc值遞增量為0.3μm～0.8μm。

16、在本發(fā)明的一些實施方式中，每組所述半t形微柱陣列的臨界截止尺寸dc值由公式dc＝1.4×g×(tanθ)0.48決定，其中：

17、所述g為兩個相鄰半t形微柱之間的間隔，范圍為15～33μm，所述θ為每組所述半t形微柱陣列的半t形微柱偏移角度。

18、在檢測腫瘤細胞變形性時，小于dc的細胞在“z”字形方向上移動，而尺寸大于dc的細胞在碰撞中以橫向位移模式移動。

19、在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，所述半t形微柱陣列的組數(shù)為18～25，相鄰兩組所述l-1形微柱陣列的對應的所述dc值遞增量為0.4μm～0.6μm。

20、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述dc值的取值范圍為6μm～16μm，相鄰兩組所述l-1形微柱陣列的對應的所述dc值遞增量為0.5μm。

21、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述θ的取值范圍為1.13～23.11°。

22、在本發(fā)明的一些實施方式中，按照待測樣品向所述出口儲液槽流動方向，每組所述半t形微柱陣列的長度遞減，所述半t形微柱陣列的長度取值范圍為200～1800μm。

23、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述輸入?yún)^(qū)域設(shè)置至少10個子通道，用于待測樣品進入所述半t形微柱陣列進行分離。

24、在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，所述輸入?yún)^(qū)域設(shè)置25～35個子通道。

25、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述輸出區(qū)域設(shè)置至少10個子通道，用于已分離的待測樣品流出所述半t形微柱陣列。

26、在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，所述輸出區(qū)域設(shè)置25～35個子通道。

27、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述出口儲液槽的直徑約為2.0～4.0mm，優(yōu)選為3.5±0.2mm。

28、本發(fā)明的第二方面，提供一種微流控芯片的制備方法，包括：基于第一方面任一項所述的微流控芯片制備pdms微通道，并在所述入口儲液槽和所述出口儲液槽對應位置進行打孔，然后與玻片組裝后即得。

29、根據(jù)本發(fā)明實施例的微流控芯片，至少具有如下有益效果：本發(fā)明的微流控芯片制備方法簡單，成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

30、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述制備pdms微通道的方法包括：將帶有所述微流控芯片微通道的硅模板進行硅烷化處理，然后將配置的pdms膠倒于硅模板上，去除起泡，經(jīng)固化后，將成形的pdms微通道從硅模板上剝離，即得。

31、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述硅烷化處理包括：取干凈硅模板，用氮氣吹干凈，然后將三甲基氯硅烷滴加在所述硅模板上進行處理。

32、硅烷化處理有助于后續(xù)將固化后的pdms微通道與硅模板剝離。

33、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述待入口儲液槽的打孔直徑約為0.5～2.5mm，優(yōu)選為1.0±0.2mm。

34、本發(fā)明的第三方面，提供一種檢測系統(tǒng)，包括：第一方面所述的微流控芯片、流體驅(qū)動裝置和成像裝置。

35、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述流體驅(qū)動裝置包括注射泵。用于將待測腫瘤細胞樣品以一定流速注入微流控芯片中。

36、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述成像裝置包括電荷耦合器件相機和顯微鏡。用于記錄微流控芯片中腫瘤細胞的尺寸分布情況。

37、本發(fā)明的第四方面，提供上述第一方面所述的微流控芯片或第三方面所述的檢測系統(tǒng)檢測在檢測細胞變形性、藥物篩選、分析細胞骨架狀態(tài)或評估細胞遷移能力中的應用。

38、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述檢測細胞變形性包括檢測腫瘤細胞變形性。

39、本發(fā)明的第五方面，提供一種檢測腫瘤細胞變形性的方法，包括：

40、采用上述第一方面所述的微流控芯片或第三方面所述的檢測系統(tǒng)檢測待測腫瘤細胞在不同流速下的腫瘤細胞平均尺寸分布，并根據(jù)所述腫瘤細胞平均尺寸分布的差值判斷所述待測腫瘤細胞變形性。

41、根據(jù)本發(fā)明實施例的檢測方法，至少具有如下有益效果：

42、本發(fā)明的腫瘤細胞變形性檢測方法簡單，且具有較好的重復性和穩(wěn)定性，且對腫瘤細胞變形性變化(如meβcd和chol誘導細胞變形性變化)具有較高的敏感性，不僅可用于腫瘤治療相關(guān)藥物的篩選，而且可以用于評價細胞骨架基本狀態(tài)和細胞遷移能力，具有廣泛的應用前景。

43、在本發(fā)明的一些實施方式中，在檢測前還包括采用非離子表面活性劑對所述微流控芯片進行預處理。

44、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述檢測的方法具體包括：將待測腫瘤細胞懸液存儲于所述入口儲液槽，控制所述待測腫瘤細胞以特定流速進入所述確定性橫向位移段，然后記錄并統(tǒng)計所述待測腫瘤細胞在半t形微柱陣列的細胞平均尺寸分布(即dapp值)。

45、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述稀釋用緩沖液包括pbs緩沖液。

46、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述流速范圍為2μl/min～30μl/min。

47、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述流速分別為2～3μl/min和20～30μl/min。

48、本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的說明書中闡述。