本發(fā)明實(shí)施例涉及母驢妊娠高脂血癥診斷，具體涉及一種母驢妊娠高脂血癥診斷生物標(biāo)記物及其檢測(cè)方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、高脂血癥是一種因機(jī)體脂肪組織過(guò)度動(dòng)員引起的代謝性疾病，繼發(fā)于生理性或病理性狀況導(dǎo)致的能量負(fù)平衡。驢可適應(yīng)相對(duì)惡劣的環(huán)境條件，消化吸收低質(zhì)飼料的能力較強(qiáng)，體內(nèi)容易囤積和動(dòng)員脂肪，造成血液中循環(huán)脂質(zhì)增加，因此患高脂血癥的風(fēng)險(xiǎn)較高。驢的高脂血癥發(fā)生率達(dá)10％-20％，死亡率高達(dá)43％-80％，對(duì)養(yǎng)驢業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。妊娠后期母驢的高脂血癥最為常見(jiàn)，又稱(chēng)為妊娠毒血癥。由于驢的妊娠高脂血癥發(fā)生率較高，加之早期不易發(fā)現(xiàn)，晚期死亡率高，所以對(duì)該病的預(yù)防和早期診斷十分重要。

2、驢的妊娠高脂血癥尚缺乏客觀(guān)準(zhǔn)確的診斷方法。目前初步的診斷方法為血清外觀(guān)觀(guān)察，通過(guò)血清呈現(xiàn)渾濁和輕度至重度乳白色樣，可以做出初步診斷，但該方法的準(zhǔn)確性和特異性受到局限。此外，較為可靠的診斷方法為測(cè)定血清甘油三酯等生化指標(biāo)濃度，但是該方法受到驢的品種、地域差異、飼養(yǎng)條件、測(cè)定儀器等各種潛在因素的影響。因此，尋求一種能夠滿(mǎn)足獸醫(yī)臨床和養(yǎng)驢生產(chǎn)實(shí)踐需要的特異性高、靈敏度和準(zhǔn)確性好的診斷方法，已成為精準(zhǔn)防治母驢妊娠高脂血癥急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種母驢妊娠高脂血癥診斷生物標(biāo)記物及其檢測(cè)方法與應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中由于受到驢的品種、地域差異、飼養(yǎng)條件、測(cè)定儀器等各種潛在因素的影響而導(dǎo)致的特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性不足的問(wèn)題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明實(shí)施例提供如下技術(shù)方案：

3、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第一方面，本發(fā)明提供一種母驢妊娠高脂血癥診斷生物標(biāo)記物，所述生物標(biāo)記物選自乙酰左旋肉堿、單硬脂酸甘油酯(16：0/0：0/0：0)和溶血磷脂酰膽堿(16：0/0：0)中的一種或多種。

4、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第二方面，本發(fā)明提供基于上述的生物標(biāo)記物檢測(cè)妊娠母驢高脂血癥的方法，所述方法包括以下步驟：生物樣本處理、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)、統(tǒng)計(jì)分析。

5、進(jìn)一步地，所述樣本處理包括以下步驟：取50μl母驢血清加入濃度為20％乙腈甲醇內(nèi)標(biāo)提取液300μl，渦旋3min，并在4℃下以12000rpm離心10min，然后吸取上清液200μl；靜置于-20℃冰箱中30min，4℃條件下12000rpm離心3min，最終提取180μl上清液；

6、所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)包括以下步驟：將所述上清液進(jìn)行超高壓液相串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)，檢測(cè)到至少一種所述生物標(biāo)記物則妊娠母驢患有高脂血癥。

7、其中，高效液相色譜條件：

8、色譜柱：waters?acquity?premier?hss?t3(2.1×100mm，1.8μm)；

9、柱溫：40℃；流速：0.4ml/min；進(jìn)樣量：4μl；

10、流動(dòng)相a：體積含量為0.1％的甲酸水，流動(dòng)相b：體積含量0.1％的甲酸乙腈；

11、流動(dòng)相洗脫梯度：0-2min：流動(dòng)相a和流動(dòng)相b體積比由95：5勻速漸變至80：20；

12、2-5min：流動(dòng)相a和流動(dòng)相b體積比由80：20勻速漸變至40：60；

13、5-6min：流動(dòng)相a和流動(dòng)相b體積比由40：60勻速漸變至1：99；

14、6-7.5min：流動(dòng)相a和流動(dòng)相b體積比保持1：99；

15、7.5-7.6min：流動(dòng)相a和流動(dòng)相b體積比由1：99勻速漸變至95：5；

16、7.6-10min：流動(dòng)相a和流動(dòng)相b體積比保持95：5；

17、采用信息依賴(lài)采集(ida)模式采集數(shù)據(jù)。質(zhì)譜條件：電噴霧正、負(fù)離子采集模式(esi+/-)。離子源參數(shù)：碰撞氣為氮?dú)?；采集時(shí)間為10min，離子化電壓為5kv/-4kv；離子源溫度為550℃/-450℃；噴霧氣為50psi；輔助加熱氣為60psi；氣簾氣為35psi；去簇電壓為60v/-60v。

18、離子掃描數(shù)據(jù)采集參數(shù)：掃描范圍為25-1000da；掃描時(shí)間為40ms；碰撞能量為30v/-30v，碰撞能量步長(zhǎng)為15v；電荷狀態(tài)為1to1；強(qiáng)度為100cps；排除4da以?xún)?nèi)的同位素；質(zhì)譜質(zhì)量容差為50ppm；每個(gè)周期監(jiān)測(cè)的候選離子最大數(shù)量為18。

19、所述統(tǒng)計(jì)分析包括以下步驟：用r包的xcms程序分別進(jìn)行峰提取、峰對(duì)齊和保留時(shí)間校正，采用支持向量回歸(svr)方法對(duì)峰面積進(jìn)行校正，通過(guò)檢索不同數(shù)據(jù)庫(kù)獲取代謝物鑒定信息。

20、進(jìn)一步地，所述檢測(cè)的時(shí)期為妊娠后期，即母驢妊娠最后1個(gè)月。

21、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的第三方面，本發(fā)明提供上述生物標(biāo)記物在制備診斷母驢妊娠高脂血癥的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

22、進(jìn)一步地，所述乙酰左旋肉堿、單硬脂酸甘油酯(16：0/0：0/0：0)和溶血磷脂酰膽堿(16：0/0：0)中的一種或多種制備的檢測(cè)試劑通過(guò)檢測(cè)生物樣本中得到以下數(shù)據(jù)：roc曲線(xiàn)下面積、靈敏度、特異性和95％置信區(qū)間。

23、進(jìn)一步地，所述乙酰左旋肉堿檢測(cè)試劑檢測(cè)生物樣本中得出曲線(xiàn)下面積、靈敏度、特異性和95％置信區(qū)間；所述單硬脂酸甘油酯(16：0/0：0/0：0)檢測(cè)生物樣本中得出曲線(xiàn)下面積、靈敏度、特異性和95％置信區(qū)間；所述溶血磷脂酰膽堿(16：0/0：0)檢測(cè)生物樣本中得出曲線(xiàn)下面積、靈敏度、特異性和95％置信區(qū)間。

24、本發(fā)明實(shí)施例具有如下優(yōu)點(diǎn)：

25、本發(fā)明通過(guò)超高壓液相串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行母驢妊娠高脂血癥血清的非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究，獲得血清乙酰左旋肉堿、單硬脂酸甘油酯(16：0/0：0/0：0)和溶血磷脂酰膽堿(16：0/0：0)及他們的組合對(duì)母驢妊娠高脂血癥有較好的診斷價(jià)值，所需的檢測(cè)樣本生物量較少，簡(jiǎn)單快速，精確度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以高靈敏度和特異性區(qū)分妊娠母驢高脂血癥，未來(lái)可廣泛應(yīng)用于驢的規(guī)?；B(yǎng)殖，提高母驢繁殖效率，促進(jìn)驢產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

技術(shù)特征：

1.一種母驢妊娠高脂血癥診斷生物標(biāo)記物，其特征在于，所述生物標(biāo)記物選自乙酰左旋肉堿、單硬脂酸甘油酯(16：0/0：0/0：0)和溶血磷脂酰膽堿(16：0/0：0)中的一種或多種。

2.基于權(quán)利要求1所述的生物標(biāo)記物檢測(cè)妊娠母驢高脂血癥的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：生物樣本處理、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)、統(tǒng)計(jì)分析。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)妊娠母驢高脂血癥的方法，其特征在于，

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)妊娠母驢高脂血癥的方法，其特征在于，所述檢測(cè)的時(shí)期為妊娠后期。

5.權(quán)利要求1中所述的生物標(biāo)記物在制備診斷母驢妊娠高脂血癥的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述乙酰左旋肉堿、單硬脂酸甘油酯(16：0/0：0/0：0)和溶血磷脂酰膽堿(16：0/0：0)中的一種或多種制備的檢測(cè)試劑通過(guò)檢測(cè)生物樣本中得到以下數(shù)據(jù)：roc曲線(xiàn)下面積、靈敏度、特異性和95％置信區(qū)間。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種母驢妊娠高脂血癥診斷生物標(biāo)記物及其檢測(cè)方法與應(yīng)用，屬于母驢妊娠高脂血癥診斷技術(shù)領(lǐng)域。生物標(biāo)記物選自乙酰左旋肉堿、單硬脂酸甘油酯(16：0/0：0/0：0)和溶血磷脂酰膽堿(16：0/0：0)中的一種或多種。本發(fā)明通過(guò)超高壓液相串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行母驢妊娠高脂血癥血清的非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究，獲得血清乙酰左旋肉堿、單硬脂酸甘油酯(16：0/0：0/0：0)和溶血磷脂酰膽堿(16：0/0：0)及他們的組合對(duì)母驢妊娠高脂血癥有較好的診斷價(jià)值，所需的檢測(cè)樣本生物量較少，簡(jiǎn)單快速，精確度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以高靈敏度和特異性區(qū)分妊娠母驢高脂血癥，提高母驢繁殖效率。

技術(shù)研發(fā)人員：鄧亮,孟慶澤,李威,董建寶,陸佳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15