專利名稱:使用腸桿菌科菌株生產(chǎn)l－氨基酸的方法
本發(fā)明涉及一種使用腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的重組微生物生產(chǎn)L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸的方法，所述重組微生物中l(wèi)amB基因或編碼其基因產(chǎn)物麥芽糖孔蛋白(maltoporin)的核苷酸序列是擴(kuò)增的，特別是過表達(dá)的，本發(fā)明還涉及這些微生物。
現(xiàn)有技術(shù)L-氨基酸、尤其是L-蘇氨酸，被用于人類藥物及制藥工業(yè)、食品工業(yè)、以及特別用于動物營養(yǎng)。
已知氨基酸是通過腸桿菌菌株，尤其是大腸桿菌(Escherichia coli(E.coli))和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)的發(fā)酵而生產(chǎn)的。由于L-氨基酸的極其重要性，已持續(xù)進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵方法，如攪拌和供氧，或者涉及營養(yǎng)培養(yǎng)基的成分如發(fā)酵期間的糖濃度，或涉及產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或涉及微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變、選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對抗代謝物例如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥戊酸(AHV)有抗性的菌株或?qū)φ{(diào)節(jié)重要的代謝物是營養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生氨基酸例如L-蘇氨酸的菌株。
一段時(shí)間以來，重組DNA技術(shù)的類似方法也已經(jīng)用于腸桿菌科的生產(chǎn)L-氨基酸的菌株的改良，其通過擴(kuò)增各個(gè)氨基酸生物合成基因并研究對生產(chǎn)的作用而進(jìn)行。關(guān)于大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonella)的細(xì)胞和分子生物學(xué)的信息概述可見于Neidhardt(ed)Escherichia.coli andSalmonella，Cellular and Molecular Biology，2nd edition，ASM Press，Washington，D.C.，USA，(1996)。
發(fā)明目的本發(fā)明人目的在于為L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸的改良發(fā)酵生產(chǎn)而提供新方法。
發(fā)明描述本發(fā)明涉及腸桿菌科重組微生物，其含有擴(kuò)增的或過表達(dá)的編碼具有麥芽糖孔蛋白LamB活性的多肽的lamB基因，并且以改良的方式生產(chǎn)L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸。
作為對比起始點(diǎn)，在每種情況中非重組的微生物不含有擴(kuò)增的lamB基因。
這些微生物特別包括腸桿菌科的微生物，其中編碼與選自SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8的氨基酸序列至少90％、特別至少95％、優(yōu)選99％相同的多肽的多核苷酸是擴(kuò)增的，所述多肽即具有麥芽糖孔蛋白LamB活性的多肽。
優(yōu)選所述多肽的氨基酸序列與的SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或者SEQ ID No.8氨基酸序列相同。
所述微生物含有擴(kuò)增的或者過表達(dá)的多核苷酸，選自a)具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；b)具有在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；c)具有在嚴(yán)格條件下與SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ IDNo.7的序列的互補(bǔ)序列雜交的序列的多核苷酸；d)具有含有功能性中性有義突變的SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ ID No.7序列的多核苷酸，
所述多核苷酸編碼基因產(chǎn)物麥芽糖孔蛋白(見下述)。
本發(fā)明另外涉及一種使用腸桿菌科的重組微生物通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸的方法，所述微生物特別已經(jīng)產(chǎn)生L-氨基酸，并且其中至少lamB基因或者編碼基因產(chǎn)物maltoporin LamB的核苷酸序列是擴(kuò)增的。
優(yōu)選使用所描述的微生物。
在下文中，如果提及L-氨基酸或氨基酸，這是指選自如下一組的一或多種氨基酸，包括其鹽L-天冬酰胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高絲氨酸。優(yōu)選L-蘇氨酸。
本文中術(shù)語“擴(kuò)增”是指微生物中由相應(yīng)的DNA編碼的一或多種酶或者蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性或濃度增加，例如將基因的拷貝數(shù)增加至少一個(gè)，將基因與強(qiáng)啟動子功能性連接或者使用編碼具有高活性的相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)的基因或等位基因，及在合適的情況下組合使用這些方法。
所述擴(kuò)增方法、尤其是過表達(dá)提高了相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度，基于野生型蛋白質(zhì)或非重組微生物中所述蛋白質(zhì)的活性或濃度，一般提高至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最多高至1000％或2000％。非重組微生物或者親代菌株是指對其施行本發(fā)明方法的微生物。
本發(fā)明涉及一種通過發(fā)酵腸桿菌科重組微生物生產(chǎn)L-氨基酸的方法，特征在于a)在希望的L-氨基酸在培養(yǎng)基或者細(xì)胞中富集的條件下，將生產(chǎn)希望的L-氨基酸的微生物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述微生物中l(wèi)amB基因或者編碼其基因產(chǎn)物的核苷酸序列是擴(kuò)增的、特別是過表達(dá)的，b)分離希望的L-氨基酸，如果合適，發(fā)酵肉湯的成分和/或生物量的全部或者部分(≥0至100％)保留在分離的產(chǎn)物中或者被完全除去。
特別的具有擴(kuò)增的或者過表達(dá)的lamB基因的重組微生物(即本發(fā)明的主題)可以由葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉(如果合適)，纖維素(如果合適)，或由甘油和乙醇生產(chǎn)L-氨基酸。所述微生物是腸桿菌科成員，選自埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)和沙雷氏菌屬(Serratia)。優(yōu)選埃希氏菌屬和沙雷氏菌屬。在埃希氏菌屬的情況中，特別可以使用大腸桿菌，在沙雷氏菌屬的情況中，特別可以使用粘質(zhì)沙雷氏菌。
重組微生物通常使用包含希望的基因、該基因的等位基因或其一部分或者擴(kuò)增該基因表達(dá)的啟動子的載體，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合或者這些方法的組合產(chǎn)生。
合適的特別的生產(chǎn)L-蘇氨酸的埃希氏菌屬，特別是大腸桿菌的菌株例如是-大腸桿菌H4581 (EP 0 301 572)-大腸桿菌KY10935 (BioscienceBiotechnology and Biochemistry 61(11)1877-1882(1997)-大腸桿菌VNIIgenetika MG442 (US-A-4278,765)-大腸桿菌VNIIgenetika M1 (US-A-4,321,325)-大腸桿菌VNIIgenetika 472T23 (US-A-5,631,157)-大腸桿菌BKIIM B-3996 (US-A-5,175,107)-大腸桿菌kat 13 (WO 98/04715)-大腸桿菌KCCM-10132 (WO 00/09660)合適的生產(chǎn)L-蘇氨酸的沙雷氏菌屬、特別是粘質(zhì)沙雷氏菌的菌株例如是-粘質(zhì)沙雷氏菌HNr21(Applied and Environmental Microbiology38(6)1045-1051(1979))-粘質(zhì)沙雷氏菌TLr156(Gene 57(2-3)151-158(1987))-粘質(zhì)沙雷氏菌T-2000(Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3)255-265(1992))。
生產(chǎn)L-蘇氨酸的腸桿菌科菌株優(yōu)選具有選自如下一組的一或多種遺傳或表型特征α-氨基-β-羥戊酸抗性，硫賴氨酸(thialysine)抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基絲氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺旋體素抗性，環(huán)戊烷-1-羧酸抗性，利福平抗性，纈氨酸類似物例如纈氨酸氧肟酸抗性，嘌呤類似物例如6-二甲基氨基嘌呤抗性，L-甲硫氨酸需求，L-異亮氨酸的部分及可補(bǔ)償性需求(如果合適)，內(nèi)消旋二氨基庚二酸需求，對含蘇氨酸的二肽營養(yǎng)缺陷，L-蘇氨酸抗性，蘇氨酸萃余液抗性，L-高絲氨酸抗性，L-賴氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-谷氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-絲氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-纈氨酸抗性，對氟丙酮酸敏感性，蘇氨酸脫氫酶缺陷，蔗糖利用能力(如果合適)，蘇氨酸操縱子擴(kuò)增，高絲氨酸脫氫酶I擴(kuò)增，天冬氨酸激酶I(優(yōu)選反饋抗性形式)，高絲氨酸激酶擴(kuò)增，蘇氨酸合酶擴(kuò)增，天冬氨酸激酶擴(kuò)增(如果合適，反饋抗性形式)，天冬氨酸半醛脫氫酶擴(kuò)增，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶擴(kuò)增、(如果合適，反饋抗性形式)，磷酸烯醇丙酮酸合酶擴(kuò)增，轉(zhuǎn)氫酶擴(kuò)增，RhtB基因產(chǎn)物擴(kuò)增， RhtC基因產(chǎn)物擴(kuò)增，YfiK基因產(chǎn)物擴(kuò)增，丙酮酸羧化酶擴(kuò)增，以及乙酸形成弱化。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腸桿菌科的微生物在lamB基因擴(kuò)增、特別是過表達(dá)之后，以改良的形式生產(chǎn)L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸。
大腸桿菌的基因或者開放讀框(ORF)的核苷酸序列是現(xiàn)有技術(shù)的一部分，可以得自Blattner等(Science 2771453-1462(1997))公布的大腸桿菌基因組序列。已知N末端甲硫氨酸可以通過宿主特異性酶(甲硫氨酸氨肽酶)除去。
lamB基因的核苷酸序列也可以從腸桿菌科的弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimirium)中獲知。
大腸桿菌的lamB基因在下文詳述描述大腸桿菌的lamB基因編碼麥芽糖孔蛋白LamB，其也被稱作麥芽糖/麥芽糊精特異性形成孔的膜蛋白(孔蛋白(porin))。
功能大腸桿菌的麥芽糖孔蛋白LamB是一種三聚體蛋白質(zhì)，其促進(jìn)或者使得麥芽糖和麥芽糊精穿過腸細(xì)菌的外膜擴(kuò)散，并且另外作為小的親水性分子如葡萄糖或者海藻糖的非特異性孔蛋白，及作為噬菌體的細(xì)胞表面受體起作用。
參考文獻(xiàn)Blattner et al.；Science 277(5331)1453-1474(1997)Clément et al.；Cell 27507-514(1981)Schwartz；Method of Enzymology 97100-112(1983)Death et al.；Journal of Bacteriology 1751475-1483(1993)Klein et al.；Journal of Microbiology 1751682-1686(1993)Szmelcman et al.；Journal of Bacteriology 124112-118(1975)Benz et al.；Biochem.Biophys.Acta 1104299-307(1992)登記號No.AE000477另一基因名稱b4036所述核苷酸序列可得自國立醫(yī)學(xué)圖書館(Bethesda，MD，USA)的生物技術(shù)信息中心(NCBI)的數(shù)據(jù)庫、歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，Germany或者Cambridge，UK)的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫或者日本的DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ，Mishima，Japan)。
大腸桿菌的lamB基因的核苷酸序列見SEQ ID No.3所示， 弗氏志賀氏菌(AE015426)和鼠傷寒沙門氏菌(AE008897)的lamB基因的已知序列分別示于SEQ ID No.5和SEQ ID No.7。由這些開放讀框編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8。
根據(jù)本發(fā)明可以使用本文段落中描述的基因。另外，可以使用得自遺傳密碼簡并的所述基因的等位基因或者通過功能性中性有義突變得到的所述基因的等位基因。優(yōu)選使用內(nèi)源基因。
“內(nèi)源基因”或者“內(nèi)源核苷酸序列”分別是指物種群體中存在的基因或等位基因或者核苷酸序列。
包含功能性中性有義突變的lamB基因的合適等位基因含有在其編碼的蛋白質(zhì)中導(dǎo)致至少1個(gè)保守氨基酸置換的那些突變。
在芳族氨基酸的情況中，保守置換是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的彼此置換。在疏水性氨基酸的情況中，保守置換是亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的彼此置換。在極性氨基酸的情況中，保守置換是谷氨酰胺與天冬酰胺的彼此置換。在堿性氨基酸的情況中，保守置換是精氨酸、賴氨酸和組氨酸的彼此置換。在酸性氨基酸的情況中，保守置換是天冬氨酸與谷氨酸的彼此置換。在含有羥基的氨基酸的情況中，保守置換是絲氨酸與蘇氨酸的彼此置換。
在相同的方式中，可以使用編碼上述蛋白質(zhì)的變體的那些核苷酸序列，其另外在N或C末端包含至少1個(gè)氨基酸的擴(kuò)展或者縮短。這種擴(kuò)展或縮短不超過50、40、30、20、10、5、3或者2個(gè)氨基酸或者氨基酸殘基。
合適的等位基因還包括編碼其中插入或者缺失至少1個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的那些等位基因。這些稱為插入/缺失(indel)的修飾的最大數(shù)目可以是2、3、5、10、20個(gè)，但在任何情況中均不超過30個(gè)氨基酸。
另外，合適的等位基因包括可通過雜交獲得的那些等位基因，特別是在嚴(yán)格條件下使用SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ ID No.7或其一部分、特別是編碼區(qū)或者與其互補(bǔ)的序列獲得的那些等位基因。
通過雜交鑒別DNA序列的指導(dǎo)可參見寶靈格曼海姆有限公司(Boehringer Mannheim GmbH)(曼海姆，德國，1993)的手冊“The DIGSystem Users Guide for Filter Hybridization”，以及Liebl等(InternationalJournal of Systematic Bacteriology 41255-260(1991))。雜交在嚴(yán)格條件下發(fā)生，即只有這樣的雜交體形成其中探針和靶序列(即用所述探針處理的多核苷酸)是至少70％相同的。已知雜交的嚴(yán)格性(包括洗滌步驟)通過改變緩沖液成分、溫度和鹽濃度而影響或確定。雜交反應(yīng)通常在與洗滌步驟相比相對較低嚴(yán)格條件下進(jìn)行(Hybaid Hybridisation Guide，HybaidLimited，Teddington，UK，1996)。
對于雜交反應(yīng)，可以使用例如一種相應(yīng)于5×SSC緩沖液的緩沖液在大約50℃-68℃進(jìn)行。在這種情況下，探針也可以和與探針序列相同性低于70％的多核苷酸雜交。這種雜交體穩(wěn)定性較差，在嚴(yán)格條件下通過洗滌除去。這可以通過例如將鹽濃度降低至2×SSC及在合適的情況下隨后降低為0.5×SSC(The DIG System Users Guide for Filter Hybridization，Boehringer Mannheim，德國曼海姆，1995)，在設(shè)定溫度大約50℃-68℃、大約52℃-68℃、大約54℃-68℃、大約56℃-68℃、大約58℃-68℃、大約60℃-68℃、大約62℃-68℃、大約64℃-68℃、大約66℃-68℃實(shí)現(xiàn)。如果合適，可以將鹽濃度降低至相當(dāng)于0.2×SSC或者0.1×SSC。通過將雜交溫度以大約1-2℃的幅度從50℃逐步提高至68℃，對與所用探針序列例如至少70％或至少80％或至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％相同的多核苷酸進(jìn)行分離。關(guān)于雜交的進(jìn)一步指導(dǎo)可以試劑盒形式在市場上獲得(例如DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH，德國曼海姆，目錄號No.1603558)。所得核苷酸序列編碼與SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或者SEQ ID No.8的氨基酸序列具有至少90％相同性的多肽。
為了實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，例如可提高基因或等位基因的表達(dá)或者蛋白質(zhì)的催化性質(zhì)。如果合適，可以組合這兩種措施。
為獲得過表達(dá)，例如可提高相應(yīng)基因的拷貝數(shù)，或可使位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結(jié)合位點(diǎn)突變。摻入結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒或啟動子以相似方式起作用。通過導(dǎo)入可誘導(dǎo)性啟動子，在通過發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸期間增強(qiáng)表達(dá)也是可能的。延長mRNA壽命的方法也可改良表達(dá)。另外，通過防止酶蛋白的降解也可提高酶活性?；蚧蚧驑?gòu)建體可以存在于具有不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒中，或可以整合進(jìn)染色體中并擴(kuò)增?；蛘?，另外通過改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件也可獲得相關(guān)基因的過表達(dá)。
過表達(dá)的方法在現(xiàn)有技術(shù)中有充分描述，例如Martin等(Microbiological Reviews 60(3)，512-538(1996))所述。通過使用載體，拷貝數(shù)增加至少1個(gè)。作為載體，可以使用例如US 5,538,873中所述的質(zhì)粒。作為載體，也可以使用噬菌體，例如EP 0 332 448所述的噬菌體Mu，或者噬菌體lambda(λ)?？截悢?shù)的增加也可以通過將另一個(gè)拷貝摻入染色體的另一個(gè)位置而實(shí)現(xiàn)，例如在噬菌體λ的att位點(diǎn)(Yu and Court，Gene223，77-81(1998))。US 5,939,307描述了怎樣通過摻入表達(dá)盒或者啟動子而實(shí)現(xiàn)表達(dá)的增加，所述啟動子例如tac啟動子、trp啟動子、lpp啟動子或者例如位于染色體蘇氨酸操縱子上游的噬菌體λ的PL啟動子和PR啟動子。以相似的方式可以使用噬菌體T7的啟動子、gear-box啟動子或者nar啟動子。也可以使用這些表達(dá)盒或者啟動子以過表達(dá)質(zhì)粒攜帶的基因，如EP 0 593 792所述。質(zhì)粒攜帶的基因的表達(dá)接下來可以通過使用lacIQ等位基因控制(Glascock and Weickert，Gene 223，221-231(1998))。
本領(lǐng)域技術(shù)人員在如下文獻(xiàn)中可發(fā)現(xiàn)關(guān)于這方面的指導(dǎo)Chang andCohen(Journal of Bacteriology 1341141-1156(1978))，Hartley and Gregori(Gene 13347-353(1981))，Amann and Brosius(Gene 40183-190(1985))，Broer et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 8021-25(1983))，LaVallie et al.(BIO/TECHNOLOGY 11187-193(1993))，PCT/US97/13359，Llosa et al.(Plasmid 26222-224(1991))，Quandt and Klipp(Gene 80161-169(1989))，Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))，Jensen and Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58191-195(1998))及已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書。
可以使用在腸桿菌中可以復(fù)制的質(zhì)粒，例如衍生自pACYC184(Bartoloméet al.；Gene 10275-78(1991))、pTrc99A(Amann etal.；Gene 69301-315(1988))的克隆載體或者pSC101衍生物(Vocke andBastia；Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21)6557-6561(1983))。在本發(fā)明的方法中，可以使用通過質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的菌株，所述質(zhì)粒載體攜帶至少一個(gè)lamB基因或者等位基因或者編碼其基因產(chǎn)物L(fēng)amB的核苷酸序列。
術(shù)語轉(zhuǎn)化是指通過宿主(微生物)摻入一個(gè)分離的核酸。
通過序列置換(Hamilton et al.；Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))、接合或者轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以將與相應(yīng)基因表達(dá)相關(guān)的突變轉(zhuǎn)移至各種菌株中。
關(guān)于遺傳學(xué)和分子生物學(xué)術(shù)語的更詳細(xì)的解釋可見于已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書，例如Birge的教科書(Bacterial and BacteriophageGenetics，4th edition，Springer Verlag，New York(USA)，2000)或者Berg，Tymoczko和Stryer的教科書(Biochemistry，5th edition，F(xiàn)reeman andCompany，New York(USA)，2002)或者Sambrook et al.的手冊(MolecularCloning，A Laboratory Manual(3-volume set)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001)。
另外，除了擴(kuò)增lamB基因之外，擴(kuò)增一或多種已知蘇氨酸生物合成途徑的酶或者回補(bǔ)代謝的酶或者產(chǎn)生還原的煙堿腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶或者糖酵解的酶或者PTS酶或者硫代謝的酶對于使用腸桿菌科的菌株生產(chǎn)L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸可以是有利的。通常優(yōu)選使用內(nèi)源基因。
例如，可以同時(shí)擴(kuò)增、特別是過表達(dá)選自如下一組的一或多個(gè)基因●編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子的至少一個(gè)基因(US-A-4,278,765)，●編碼丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的pyc基因(WO 99/18228)，●編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular and General Genetics231(2)332-336(1992))，●編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(WO 02/064808)●編碼吡啶轉(zhuǎn)氫酶亞基的pntA和pntB基因(European Journal ofBiochemistry 158647-653(1986))，●編碼賦予高絲氨酸抗性的蛋白質(zhì)的rhtB基因(EP-A-0 994 190)，●編碼賦予蘇氨酸抗性的蛋白質(zhì)的rhtC基因(EP-A-1 013 765)，●編碼蘇氨酸輸出載體蛋白的谷氨酸棒桿菌的thrE基因(WO 01/92545)，●編碼谷氨酸脫氫酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research 11；5257-5266(1983)；gene 23199-209(1983))，●編碼葡糖磷酸變位酶的pgm基因(WO 03/004598)，●編碼果糖二磷酸醛縮酶的fba基因(WO 03/004664)，●編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS的磷酸組氨酸蛋白己糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的ptsHIcrr操縱子的ptsH基因(WO 03/004674)，●編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS的酶I的ptsHIcrr操縱子的ptsI基因(WO 03/004674)，●編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS的葡萄糖特異性IIA成分的ptsHIcrr操縱子的crr基因(WO 03/004674)，●編碼葡萄糖特異性IIBC成分的ptsG基因(WO 03/004670)，●編碼亮氨酸調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物的lrp基因(WO 03/004665)，●編碼fad調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物的fadR基因(WO 03/038106)，●編碼主要中間代謝的調(diào)節(jié)物的iclR基因(WO 03/038106)，●編碼烷基氫過氧化物還原酶的小亞基的ahpCF操縱子的ahpC基因(WO 03/004663)，●編碼烷基氫過氧化物還原酶的大亞基的ahpCF操縱子的ahpF基因(WO 03/004663)，●編碼半胱氨酸合酶A的cysK基因(WO 03/006666)，●編碼cys調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物的cysB基因(WO 03/006666)，
●編碼NADPH亞硫酸還原酶的黃素蛋白的cysJIH操縱子的cysJ基因(WO 03/006666)，●編碼NADPH亞硫酸還原酶的血紅素蛋白的cysJIH操縱子的cysI基因(WO 03/006666)，●編碼腺嘌呤基硫酸還原酶的cysJIH操縱子的cysH基因(WO03/006666)，●編碼具有抗-sigmaE活性的膜蛋白的rseABC操縱子的rseA基因(WO 03/008612)，●編碼sigmaE因子的全面調(diào)節(jié)物的rseABC操縱子的rseC基因(WO 03/008612)，●編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基的sucABCD操縱子的sucA基因(WO 03/008614)，●編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸琥珀?；D(zhuǎn)移酶(dihydrolipoyltranssuccinase)E2亞基的sucABCD操縱子的sucB基因(WO 03/008614)，●編碼琥珀酰-CoA合成酶的β-亞基的sucABCD操縱子的sucC基因(WO 03/008615)，●編碼琥珀酰-CoA合成酶的α-亞基的sucABCD操縱子的sucD基因(WO03/008615)，●編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E1成分的aceE基因(WO 03/076635)，●編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2成分的aceF基因(WO 03/076635)，●編碼sigmaE因子活性的調(diào)節(jié)物的rseB基因(Molecular Microbiology24(2)355-371(1997))，●編碼麥芽糖調(diào)節(jié)子的陽性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的malT基因(Gene 42201-208(1986)，DE102004003411.7)，●大腸桿菌的開放讀框(ORF)yaaU的基因產(chǎn)物(國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)登記號AE000114，DE10361268.8)，
●大腸桿菌的開放讀框(ORF)yodA的基因產(chǎn)物(國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)登記號AE000288，DE10361192.4)，●大腸桿菌的開放讀框(ORF)yibD的基因產(chǎn)物(國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)登記號AE000439，DE102004005836.9)。
另外，除了擴(kuò)增lamB基因之外，弱化、特別是關(guān)閉選自如下一組的一或多個(gè)基因或者降低其表達(dá)，對于生產(chǎn)L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸可以是有利的●編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因(Journal of Bacteriology 1694716-4721(1987))，●編碼蘋果酸脫氫酶(E.C.1.1.1.37)的mdh基因(Archives in Microbiology14936-42(1987))，●大腸桿菌的開放讀框(ORF)yjfA的基因產(chǎn)物(國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)登記號AAC77180，WO 02/29080)，●大腸桿菌的開放讀框(ORF)ytfP的基因產(chǎn)物(國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)登記號AAC77179，WO 02/29080)，●編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pckA基因(WO 02/29080)，●編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(WO 02/36797)，●編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的DgsA調(diào)節(jié)物的dgsA基因(WO 02/081721)，該基因也稱作mlc基因，●編碼果糖阻抑物的fruR基因(WO 02/081698)，該基因也稱作cra基因，●編碼Sigma38因子的rpoS基因(WO 01/05939)，該基因也稱作katF基因，以及●編碼天冬氨酸氨裂合酶(aspartate ammonium lyase)的aspA基因(WO 03/008603)。
文中術(shù)語“弱化”是指降低或關(guān)閉微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶或蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性或濃度，通過使用例如相比于原始菌株中較弱的啟動子或使用編碼具有較低活性的相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)的基因或等位基因?qū)崿F(xiàn)，或通過滅活相應(yīng)酶或蛋白質(zhì)或基因?qū)崿F(xiàn)，及如果合適，組合使用這些方法實(shí)現(xiàn)。
通過弱化方法，相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度一般降低至野生型蛋白質(zhì)的濃度或者非重組的起始微生物中蛋白質(zhì)活性或濃度的0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或0-5％。所述起始微生物或者親代菌株是指要對其施行本發(fā)明方法的微生物。
為了實(shí)現(xiàn)弱化，例如可以降低或者關(guān)閉基因或者開放讀框的表達(dá)或者酶蛋白的催化性質(zhì)。如果合適，可以組合這兩種方法。
基因表達(dá)的降低可以通過合適的培養(yǎng)條件進(jìn)行，通過遺傳修飾(突變)基因表達(dá)的信號結(jié)構(gòu)進(jìn)行，或者通過反義RNA技術(shù)進(jìn)行?；虮磉_(dá)的信號結(jié)構(gòu)例如是阻抑基因、激活基因、操縱子、啟動子、弱化子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子和終止子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在例如如下文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)這方面的信息Jensen and Hammer(Biotechnology andBioengineering 58191-195(1998))，Carrier and Keasling(BiotechnologyProgress 1558-64(1999))，F(xiàn)ranch and Gerdes(Current Opinion inMicrobiology 3159-164(2000))，及已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書如Knippers(“Molekulare Genetik”[Molecular Genetics]，6th edition，GeorgThieme Verlag，Stuttgart，Germany，1 995)或者Winnacker(“Gene und Klone”[Genes and Clones]，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)。
導(dǎo)致酶蛋白的催化性質(zhì)改變或降低的突變可以從現(xiàn)有技術(shù)中得知。所述現(xiàn)有技術(shù)例如Qiu and Goodman(Journal of Biological Chemistry 2728611-8617(1997))，Yano et al.(Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 955511-5515(1998))，Wente andSchachmann(Journal of Biological Chemistry 26620833-20839(1991))。
這方面的概括性解釋可見于遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書，例如Hagemann(“Allgemeine Genetik”[General Genetics]，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
考慮至少1個(gè)堿基對或核苷酸的突變、轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失。根據(jù)突變所致的氨基酸置換對酶活性的作用，這些突變被描述為錯(cuò)義突變或者無義突變。錯(cuò)義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)中指定氨基酸被置換為另一個(gè)，這種置換特別是非保守氨基酸置換。結(jié)果是蛋白質(zhì)的功能性或者活性被削弱及降低至0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或者0-5％。無義突變導(dǎo)致在基因的編碼區(qū)中產(chǎn)生終止密碼子，因此過早終止翻譯。在基因中插入或者缺失至少一個(gè)堿基對導(dǎo)致移碼突變，這導(dǎo)致?lián)饺脲e(cuò)誤的氨基酸或者翻譯過早終止。如果突變的結(jié)果是在編碼區(qū)中產(chǎn)生終止密碼子，這也導(dǎo)致翻譯過早終止。缺失至少一個(gè)或者多個(gè)密碼子也典型地導(dǎo)致酶活性的完全喪失。
關(guān)于產(chǎn)生這些突變的指導(dǎo)是現(xiàn)有技術(shù)的一部分，可以得自已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書，例如Knippers(“Molekulare Genetik”[Molecular Genetics]，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)、Winnacker(“Gene und Klone”[Genes and Clones]，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann(“Allgemeine Genetik”[General Genetics]，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)所著教科書。
可以通過基因或者等位基因置換在合適的菌株中摻入合適的基因突變。
常規(guī)的方法是Hamilton et al.(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))所述的基因置換方法，其使用條件復(fù)制型pSC101衍生物pMAK705進(jìn)行基因置換。也可以使用現(xiàn)有技術(shù)所述的其它方法，例如Martinez-Morales et al.(Journal of Bacteriology 1817143-7148(1999))或者Boyd et al.(Journal of Bacteriology 182842-847(2000))所述方法。
也可以通過接合或者轉(zhuǎn)導(dǎo)將各個(gè)基因中的突變或者與各個(gè)基因或開放讀框表達(dá)相關(guān)的突變轉(zhuǎn)移至各種菌株中。
另外，除了擴(kuò)增lamB基因之外，關(guān)閉不需要的副反應(yīng)對于L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸的生產(chǎn)可能是有益的(Nakayama“Breeding of AminoAcid Producing Microorganisms”，inOverproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，Academic Press，London，UK，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可通過分批培養(yǎng)法、補(bǔ)料分批培養(yǎng)法、重復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)法或者持續(xù)培養(yǎng)法(US.....)培養(yǎng)。已知培養(yǎng)方法見于由Chmiel所著教材(生物方法技術(shù)學(xué)1，生物工程入門，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)，或由Storhas所著教材(生物反應(yīng)器及外周設(shè)備，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合各菌株的要求。關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國細(xì)菌學(xué)會(American Society for Bacteriology)(Washington D.C.，USA，1981)的“Manual of Methods for GeneralBacteriology”。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素(如果合適)，油和脂肪如豆油、葵花籽油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的化合物如胨、酵母提取物、肉膏、麥芽提取物、玉米浸液、大豆粉和尿素，或無機(jī)化合物如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。所述氮源可單獨(dú)或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所必需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中。所述起始材料可以在培養(yǎng)期間以單批或一種適當(dāng)方式加入至培養(yǎng)基中。
發(fā)酵通常在pH5.5-9.0、特別是pH6.0-8.0進(jìn)行。為了控制培養(yǎng)物的pH值，可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸。為了控制泡沫產(chǎn)生，可以使用抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二酯。為了保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可以向培養(yǎng)基中加入合適的選擇物質(zhì)例如抗生素。為了保持有氧條件，可向培養(yǎng)物中導(dǎo)入氧氣或含氧混合氣，例如空氣。培養(yǎng)溫度通常在25℃-45℃，優(yōu)選30℃-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至形成最大量的L-氨基酸或者L-蘇氨酸。此目標(biāo)通常在10-160小時(shí)內(nèi)達(dá)到。
L-氨基酸可通過陰離子交換層析，隨后進(jìn)行茚三酮衍生化而分析，如Spackman et al.(Analytical Chemistry 301190-1206(1958))所述，或者通過反相HPLC分析，如Lindroth et al.(Analytical Chemistry 511167-1174(1979))所述。
本發(fā)明用于通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸，例如L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-高絲氨酸、L-色氨酸和L-賴氨酸，特別是L-蘇氨酸。
本發(fā)明參考后文的實(shí)施例得以更詳細(xì)的描述。
用于大腸桿菌的極限培養(yǎng)基(M9)和完全培養(yǎng)基(LB)由J.H.Miller(AShort Course in Bacterial Genetics(1992)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)描述。從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA及所有的限制、連接、Klenow和堿性磷酸酶處理技術(shù)均如Sambrook et al.(Molecular Cloning-ALaboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述進(jìn)行。除非特別指出，則大腸桿菌的轉(zhuǎn)化根據(jù)Chung et al.(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 862172-2175(1989))所述進(jìn)行。
生產(chǎn)菌株和轉(zhuǎn)化體的溫育溫度為37℃。
實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒pTrc99AlamB的構(gòu)建將大腸桿菌K12的lamB基因使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及合成的寡核苷酸擴(kuò)增。從大腸桿菌K12 MG1655(登記號AE000477，Blattner et al.(Science 2771453-1474(1997))的lamB基因的核苷酸序列開始，合成PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)。對所述引物序列進(jìn)行修飾，由此產(chǎn)生限制酶的識別位點(diǎn)。對于P_lam1neu引物，使用XbaI的識別序列，對于P_lam2neu引物，選擇HindIII的識別序列，所述序列在如下核苷酸序列中以下劃線標(biāo)示P_lam1neu5’-TCTAGAGCCTGTCACAGGTGATGTGAA-3’(SEQ ID No.1)P_lam2neu5’-AAGCTTACAGCCGTTGTAGGCCTGATA-3’(SEQ ID No.2)使用“Qiagen Genomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，Germany)，根據(jù)廠商指導(dǎo)分離用于PCR的大腸桿菌K12 MG1655染色體DNA。在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下(Innis et al.(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，Academic Press)，使用特異性引物由Vent-DNA-聚合酶(NewEngland Biolaps GmbH，F(xiàn)rankfurt，Germany)擴(kuò)增一個(gè)1498bp DNA片段(SEQ ID No.3)。
根據(jù)廠商指導(dǎo)，將擴(kuò)增的lamB片段與載體pCR-Blunt II-TOPO(ZeroTOPO TA Cloning Kit，Invitrogen，Groningen，Netherlands)連接，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10中。在混和了50μg/ml卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。在分離質(zhì)粒DNA之后，將載體用酶EcoRI和EcoRV切割，在0.8％強(qiáng)度瓊脂糖凝膠中檢測切割之后，將所述載體命名為pCRBluntlamB。
擴(kuò)增的DNA片段或者PCR產(chǎn)物的核苷酸序列通過Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.，745463-5467(1977))所述的雙脫氧鏈終止法使用得自PE Applied Biosystems(Weiterstadt，Germany)的“ABI Prism 377”測序設(shè)備進(jìn)行檢測。所述PCR產(chǎn)物的序列相應(yīng)于SEQ ID No.3所示序列的第1-1498位。相關(guān)的LamB蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于SEQ ID No.4。
隨后，將載體pCRBluntlamB用酶HindIII和XbaI切割，在0.8％強(qiáng)度瓊脂糖凝膠中解離之后從凝膠中分離大約1500bp的lamB片段(QIAquick Gel Extraction Kit，QIAGEN，Hilden，Germany)，并與已經(jīng)由酶HindIII和XbaI消化的載體pTrc99A(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)連接。將大腸桿菌菌株DH5α(Grant et al.；Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA，87(1990)4645-4649)用連接方法轉(zhuǎn)化，并在混和了50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
在質(zhì)粒DNA分離之后可以通過使用酶EcoRV和SspI進(jìn)行對照切割而表明成功的克隆。
該質(zhì)粒稱作pTrc99AlamB(圖1)。
實(shí)施例2表達(dá)質(zhì)粒pMW218lamB的構(gòu)建將實(shí)施例1所述的載體pCRBluntlamB用酶HindIII和XbaI切割，在0.8％強(qiáng)度的瓊脂糖凝膠中解離之后從凝膠中分離lamB片段(QIAquickGel Extraction Kit，QIAGEN，Hilden，Germany)，并與已經(jīng)用酶HindIII和XbaI消化的低拷貝載體pMW218(Nippon Gene，Toyama，Japan)連接。將大腸桿菌菌株DH5α(Grant et al.Proceedings of the National Academy ofSciences USA，87(1990)4645-4649)用連接方法轉(zhuǎn)化，并在混和了50μg/ml卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
在質(zhì)粒DNA分離之后可以通過使用酶ClaI進(jìn)行對照切割而表明成功的克隆。
該質(zhì)粒稱作pMW218lamB(圖2)。
實(shí)施例3使用菌株MG442/pTrc99AlamB和MG442/pMW218lamB生產(chǎn)L-蘇氨酸生產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株MG442在專利US-A-4,278,765中描述，其保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM，Moscow，Russia)，保藏號為CMIM B-1628。
將菌株MG442用實(shí)施例1和2所述的表達(dá)質(zhì)粒pTrc99AlamB和pMW218lamB及載體pTrc99A和pMW218轉(zhuǎn)化，在含有50μg/ml氨芐青霉素或者50μg/ml卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。以此方式形成菌株MG442/pTrc99AlamB、MG442/pTrc99A、MG442/pMW218lamB和MG442/pMW218。隨后將選擇的各個(gè)菌落在具有如下成分的極限培養(yǎng)基上生長3.5g/l的Na2HPO4·2H2O、1.5g/l的KH2PO4、1g/l的NH4Cl、0.1g/l的MgSO4·7H2O、2g/l葡萄糖、20g/l瓊脂、50mg/l氨芐青霉素或者50mg/l卡那霉素。在100ml錐形瓶中含有的10ml分批培養(yǎng)物中研究L-蘇氨酸的形成。向其中加入如下成分的10ml預(yù)培養(yǎng)基2g/l酵母提取物、10g/l的(NH4)2SO4、1g/l的KH2PO4、0.5g/l的MgSO4·7H2O、15g/l的CaCO3、20g/l葡萄糖、50mg/l氨芐青霉素或者50mg/l卡那霉素，接種并在37℃在得自Kühner AG(Birsfelden，Switzerland)的ESR溫箱中以180rpm溫育16小時(shí)。將該預(yù)培養(yǎng)物的250μl樣品接種于10ml生產(chǎn)培養(yǎng)基中(25g/l的(NH4)2SO4，2g/l的KH2PO4，1g/l的MgSO4·7H2O，0.03g/l的FeSO4·7H2O，0.018g/l的MnSO4·1H2O，30g/l的CaCO3，20g/l葡萄糖，50mg/l氨芐青霉素或者50mg/l卡那霉素)，在37℃溫育48小時(shí)。在溫育之后，使用得自Dr Lange(Düsseldorf，Germany)的LP2W光度計(jì)在660nm測定波長確定培養(yǎng)懸浮液的光密度(OD)。
隨后，在無菌過濾的培養(yǎng)物上清中使用得自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)的氨基酸分析儀，通過離子交換層析和使用茚三酮檢測的柱后反應(yīng)確定形成的L-蘇氨酸的濃度。
表1示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表1
附圖簡述圖1含有l(wèi)amB基因的質(zhì)粒pTrc99AlamB的圖譜圖2含有l(wèi)amB基因的質(zhì)粒pMW218lamB的圖譜長度數(shù)據(jù)為近似值。使用的縮寫和名稱具有如下含義●bla編碼氨芐青霉素抗性的基因●kan編碼卡那霉素抗性的基因●lac Iqtrc啟動子的阻抑蛋白的基因●lacZ’編碼β-半乳糖苷酶的α-肽的基因片段●trctrc啟動子區(qū)域，IPTG可誘導(dǎo)●lamBlamB基因的編碼區(qū)●5S5S rRNA區(qū)域●rrnBTrRNA終止子區(qū)域限制酶的縮寫具有如下含義●XbaI得自巴氏黃單胞菌(Xanthomonas badrii)的限制性核酸內(nèi)切酶●HindIII得自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的限制性核酸內(nèi)切酶●ClaI得自闊顯核菌(Caryophanon latum)的限制性核酸內(nèi)切酶●SspI得自球衣菌屬(Sphaerotilus)物種的限制性核酸內(nèi)切酶●EcoRV得自大腸桿菌的限制性核酸內(nèi)切酶。
序列表<110>德古薩股份公司<120>使用腸桿菌科菌株生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130>040163 BT<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>27<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(27)<223>P_lamlneu<220>
<221>Restriction site<222>(1)..(6)<223>XbaI<400>1tctagagcct gtcacaggtg atgtgaa 27<210>2<211>27<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(27)<223>P_lam2neu<220>
<221>Restriction site<222>(1)..(6)<223>HindIII<400>2aagcttacag ccgttgtagg cctgata 27<210>3<211>1498<212>DNA<213>Escherichia coli
<220>
<221>PCR product<222>(1)..(1498)<223>lamB PCR product<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(27)<223>Primer P_lamlneu<220>
<221>CDS<222>(57)..(1397)<223>lamB coding region<220>
<221>primer_bind<222>(1472)..(1498)<223>Primer P_lam2neu<400>3tctagagcct gtcacaggtg atgtgaaaaa agaaaagcaa tgactcagga gataga atg 59Met1atg att act ctg cgc aaa ctt cct ctg gcg gtt gcc gtc gca gcg ggc 107Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala Gly5 10 15gta atg tct gct cag gca atg gct gtt gat ttc cac ggc tat gca cgt 155Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala Arg20 25 30tcc ggt att ggt tgg aca ggt agc ggc ggt gaa caa cag tgt ttc cag 203Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe Gln35 40 45act acc ggt gct caa agt aaa tac cgt ctt ggc aac gaa tgt gaa act 251Thr Thr Gly Ala Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Gly Asn Glu Cys Glu Thr50 55 60 65tat gct gaa tta aaa ttg ggt cag gaa gtg tgg aaa gag ggc gat aag 299Tyr Ala Glu Leu Lys Leu Gly Gln Glu Val Trp Lys Glu Gly Asp Lys70 75 80agc ttc tat ttc gac act aac gtg gcc tat tcc gtc gca caa cag aat 347Ser Phe Tyr Phe Asp Thr Asn Val Ala Tyr Ser Val Ala Gln Gln Asn85 90 95gac tgg gaa gct acc gat ccg gcc ttc cgt gaa gca aac gtg cag ggt 395Asp Trp Glu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Asn Val Gln Gly100 105 110aaa aac ctg atc gaa tgg ctg cca ggc tcc acc atc tgg gca ggt aag 443Lys Asn Leu Ile Glu Trp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Trp Ala Gly Lys
115 120 125cgc ttc tac caa cgt cat gac gtt cat atg atc gac ttc tac tac tgg 491Arg Phe Tyr Gln Arg His Asp Val His Met Ile Asp Phe Tyr Tyr Trp130 135 140 145gat att tct ggt cct ggt gcc ggt ctg gaa aac atc gat gtt ggc ttc 539Asp Ile Ser Gly Pro Gly Ala Gly Leu Glu Asn Ile Asp Val Gly Phe150 155 160ggt aaa ctc tct ctg gca gca acc cgc tcc tct gaa gct ggt ggt tct 587Gly Lys Leu Ser Leu Ala Ala Thr Arg Ser Ser Glu Ala Gly Gly Ser165 170 175tcc tct ttc gcc agc aac aat att tat gac tat acc aac gaa acc gcg 635Ser Ser Phe Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Glu Thr Ala180 185 190aac gac gtt ttc gat gtg cgt tta gcg cag atg gaa atc aac ccg ggc 683Asn Asp Val Phe Asp Val Arg Leu Ala Gln Met Glu Ile Asn Pro Gly195 200 205ggc aca tta gaa ctg ggt gtc gac tac ggt cgt gcc aac ttg cgt gat 731Gly Thr Leu Glu Leu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Ala Asn Leu Arg Asp210 215 220 225aac tat cgt ctg gtt gat ggc gca tcg aaa gac ggc tgg tta ttc act 779Asn Tyr Arg Leu Val Asp Gly Ala Ser Lys Asp Gly Trp Lau Phe Thr230 235 240gct gaa cat act cag agt gtc ctg aag ggc ttt aac aag ttt gtt gtt 827Ala Glu His Thr Gln Ser Val Leu Lys Gly Phe Asr Lys Phe Val Val245 250 255cag tac gct act gac tcg atg acc tcg cag ggt aaa ggg ctg tcg cag 875Gln Tyr Ala Thr Asp Ser Met Thr Ser Gln Gly Lys Gly Leu Ser Gln260 265 270ggt tct ggc gtt gca ttt gat aac gaa aaa ttt gcc tac aat atc aac 923Gly Ser Gly Val Ala Phe Asp Asn Glu Lys Phe Ala Tyr Asn Ile Asn275 280 285aac aac ggt cac atg ctg cgt atc ctc gac cac ggt gcg atc tcc atg 971Asn Asn Gly His Met Leu Arg Ile Leu Asp His Gly Ala Ile Ser Met290 295 300 305ggc gac aac tgg gac atg atg tac gtg ggt atg tac cag gat atc aac 1019Gly Asp Asn Trp Asp Met Met Tyr Val Gly Met Tyr Gln Asp Ile Asn310 315 320tgg gat aac gac aac ggc acc aag tgg tgg acc gtc ggt att cgc ccg 1067Trp Asp Asn Asp Asn Gly Thr Lys Trp Trp Thr Val Gly Ile Arg Pro325 330 335atg tac aag tgg acg cca atc atg agc acc gtg atg gaa atc ggc tac 1115Met Tyr Lys Trp Thr Pro Ile Met Ser Thr Val Met Glu Ile Gly Tyr
340 345 350gac aac gtc gaa tcc cag cgc acc ggc gac aag aac aat cag tac aaa 1163Asp Asn Val Glu Ser Gln Arg Thr Gly Asp Lys Asn Asn Gln Tyr Lys355 360 365att acc ctc gca caa caa tgg cag gct ggc gac agc atc tgg tca cgc 1211Ile Thr Leu Ala Gln Gln Trp Gln Ala Gly Asp Ser Ile Trp Ser Arg370 375 380 385ccg gct att cgt gtc ttc gca acc tac gcc aag tgg gat gag aaa tgg 1259Pro Ala Ile Arg Val Phe Ala Thr Tyr Ala Lys Trp Asp Glu Lys Trp390 395 400ggt tac gac tac acc ggt aac gct gat aac aac gcg aac ttc ggc aaa 1307Gly Tyr Asp Tyr Thr Gly Asn Ala Asp Asn Asn Ala Asn Phe Gly Lys405 410 415gcc gtt cct gct gat ttc aac ggc ggc agc ttc ggt cgt ggc gac agc 1355Ala Val Pro Ala Asp Phe Asn Gly Gly Ser Phe Gly Arg Gly Asp Ser420 425 430gac gag tgg acc ttc ggt gcc cag atg gaa atc tgg tgg taa 1397Asp Glu Trp Thr Phe Gly Ala Gln Met Glu Ile Trp Trp435 440 445tagcaaaacc tgggccggat aaggcgttta cgccgcattc ggcaaccaac gcctgatgcg 1457acgcttgcgc gtcttatcag gcctacaacg gctgtaagct t 1498<210>4<211>446<212>PRT<213>Escherichia coli<400>4Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala1 5 10 15Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala20 25 30Arg Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe35 40 45Gln Thr Thr Gly Ala Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Gly Asn Glu Cys Glu50 55 60Thr Tyr Ala Glu Leu Lys Leu Gly Gln Glu Val Trp Lys Glu Gly Asp
65 70 75 80Lys Ser Phe Tyr Phe Asp Thr Asn Val Ala Tyr Ser Val Ala Gln Gln85 90 95Asn Asp Trp Glu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Asn Val Gln100 105 110Gly Lys Asn Leu Ile Glu Trp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Trp Ala Gly115 120 125Lys Arg Phe Tyr Gln Arg His Asp Val His Met Ile Asp Phe Tyr Tyr130 135 140Trp Asp Ile Ser Gly Pro Gly Ala Gly Leu Glu Asn Ile Asp Val Gly145 150 155 160Phe Gly Lys Leu Ser Leu Ala Ala Thr Arg Ser Ser Glu Ala Gly Gly165 170 175Ser Ser Ser Phe Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Glu Thr180 185 190Ala Asn Asp Val Phe Asp Val Arg Leu Ala Gln Met Glu Ile Asn Pro195 200 205Gly Gly Thr Leu Glu Leu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Ala Asn Leu Arg210 215 220Asp Asn Tyr Arg Leu Val Asp Gly Ala Ser Lys Asp Gly Trp Leu Phe225 230 235 240Thr Ala Glu His Thr Gln Ser Val Leu Lys Gly Phe Asn Lys Phe Val245 250 255Val Gln Tyr Ala Thr Asp Ser Met Thr Ser Gln Gly Lys Gly Leu Ser260 265 270Gln Gly Ser Gly Val Ala Phe Asp Asn Glu Lys Phe Ala Tyr Asn Ile275 280 285Asn Asn Asn Gly His Met Leu Arg Ile Leu Asp His Gly Ala Ile Ser290 295 300
Met Gly Asp Asn Trp Asp Met Met Tyr Val Gly Met Tyr Gln Asp Ile305 310 315 320Asn Trp Asp Asn Asp Asn Gly Thr Lys Trp Trp Thr Val Gly Ile Arg325 330 335Pro Met Tyr Lys Trp Thr Pro Ile Met Ser Thr Val Met Glu Ile Gly340 345 350Tyr Asp Asn Val Glu Ser Gln Arg Thr Gly Asp Lys Asn Asn Gln Tyr355 360 365Lys Ile Thr Leu Ala Gln Gln Trp Gln Ala Gly Asp Ser Ile Trp Ser370 375 380Arg Pro Ala Ile Arg Val Phe Ala Thr Tyr Ala Lys Trp Asp Glu Lys385 390 395 400Trp Gly Tyr Asp Tyr Thr Gly Asn Ala Asp Asn Asn Ala Asn Phe Gly405 410 415Lys Ala Val Pro Ala Asp Phe Asn Gly Gly Ser Phe Gly Arg Gly Asp420 425 430Ser Asp Glu Trp Thr Phe Gly Ala Gln Met Glu Ile Trp Trp435 440 445<210>5<211>1341<212>DNA<213>Shigella flexneri<220>
<221>CDS<222>(1)..(1341)<223>lamB coding region<400>5atg atg att act ctg cgc aaa ctt cct ctg gcg gtt gcc gtc gca gcg 48Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala1 5 10 15ggc gta atg tct gct cag gca atg gct gtt gat ttc cac ggc tat gca 96Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala20 25 30
cgt tcc ggt att ggc tgg aca ggt agc ggc ggt gaa caa cag tgt ttc 144Arg Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe35 40 45cag act acc ggt gct caa agt aaa tac cgt ctt ggc aac gaa tgt gaa 192Gln Thr Thr Gly Ala Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Gly Asn Glu Cys Glu50 55 60act tat gct gaa tta aaa ttg ggt cag gaa gtg tgg aaa gag ggc gat 240Thr Tyr Ala Glu Leu Lys Leu Gly Gln Glu Val Trp Lys Glu Gly Asp65 70 75 80aag agc ttc tat ttc gac act aac gtg gcc tat tcc gtc gcg caa cag 288Lys Ser Phe Tyr Phe Asp Thr Asn Val Ala Tyr Ser Val Ala Gln Gln85 90 95aat gac tgg gaa gct acc gat ccg gcc ttc cgt gaa gca aac gtg cag 336Asn Asp Trp Glu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Asn Val Gln100 105 110gga aaa aac ctg atc gaa tgg ctg cca ggt tcc acc atc tgg gca ggt 384Gly Lys Asn Leu Ile Glu Trp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Trp Ala Gly115 120 125aag cgc ttc tac caa cgt cat gac gtt cat atg atc gac ttc tac tac 432Lys Arg Phe Tyr Gln Arg His Asp Val His Met Ile Asp Phe Tyr Tyr130 135 140tgg gat att tct ggt cct ggt gcc ggt ctg gaa aac atc gat gtt ggc 480Trp Asp Ile Ser Gly Pro Gly Ala Gly Leu Glu Asn Ile Asp Val Gly145 150 155 160ttc ggt aaa ctc tct ctg gca gca acc cgc tcc tct gaa gct ggt ggt 528Phe Gly Lys Leu Ser Leu Ala Ala Thr Arg Ser Ser Glu Ala Gly Gly165 170 175tct tcc tct ttt gcc agc aac aat att tat gac tat acc aac gaa acc 576Ser Ser Ser Phe Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Glu Thr180 185 190gcg aac gac gtt ttc gat gtg cgt tta gcg cag atg gaa atc aac ccg 624Ala Asn Asp Val Phe Asp Val Arg Leu Ala Gln Met Glu Ile Asn Pro195 200 205ggc ggc aca tta gaa ctg ggt gtc gac tac ggt cgt gcc aac ctg cgt 672Gly Gly Thr Leu Glu Leu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Ala Asn Leu Arg210 215 220gat aac tat cgt ctg gtt gat ggc gca tcg aaa gac ggc tgg tta ttc 720Asp Asn Tyr Arg Leu Val Asp Gly Ala Ser Lys Asp Gly Trp Leu Phe225 230 235 240act gct gaa cat act cag agt gtc ctg aag ggc ttt aac aag ttt gtt 768Thr Ala Glu His Thr Gln Ser Val Leu Lys Gly Phe Asn Lys Phe Val
245 250 255gtt cag tac gct act gac tcg atg acc tcg cag ggt aaa ggt ctg tcg 816Val Gln Tyr Ala Thr Asp Ser Met Thr Ser Gln Gly Lys Gly Leu Ser260 265 270cag ggt tct ggc gtc gcg ttt gat aac gaa aaa ttt gcc tac aat atc 864Gln Gly Ser Gly Val Ala Phe Asp Asn Glu Lys Phe Ala Tyr Asn Ile275 280 285aac aac aac ggt cac atg ctg cgt atc ctc gac cac ggt gcg atc tcc 912Asn Asn Asn Gly His Met Leu Arg Ile Leu Asp His Gly Ala Ile Ser290 295 300atg ggc gac aac tgg gac atg atg tac gtg ggt atg tac cag gat atc 960Met Gly Asp Asn Trp Asp Met Met Tyr Val Gly Met Tyr Gln Asp Ile305 310 315 320aac tgg gat aac gac aac ggc acc aag tgg tgg acc gtt ggt att cgc 1008Asn Trp Asp Asn Asp Asn Gly Thr Lys Trp Trp Thr Val Gly Ile Arg325 330 335ccg atg tac aag tgg acg cca atc atg agc acc gtg atg gaa atc ggc 1056Pro Met Tyr Lys Trp Thr Pro Ile Met Ser Thr Val Met Glu Ile Gly340 345 350tac gac aac gtc gaa tcc cag cgc acc ggc gac aag aac aat cag tac 1104Tyr Asp Asn Val Glu Ser Gln Arg Thr Gly Asp Lys Asn Asn Gln Tyr355 360 365aaa att acc ctc gca caa caa tgg cag gct ggc gac agc atc tgg tca 1152Lys Ile Thr Leu Ala Gln Gln Trp Gln Ala Gly Asp Ser Ile Trp Ser370 375 380cgc ccg gct att cgt gtc ttc gca acc tac gcc aag tgg gat gag aaa 1200Arg Pro Ala Ile Arg Val Phe Ala Thr Tyr Ala Lys Trp Asp Glu Lys385 390 395 400tgg ggt tac gac tac aac ggc gat agc aag gtt aac ccg aac tac ggc 1248Trp Gly Tyr Asp Tyr Asn Gly Asp Ser Lys Val Asn Pro Asn Tyr Gly405 410 415aaa gcc gtt cct gct gat ttc aac ggc ggc agc ttc ggt cgt ggc gac 1296Lys Ala Val Pro Ala Asp Phe Asn Gly Gly Ser Phe Gly Arg Gly Asp420 425 430agc gac gag tgg acc ttc ggt gcc cag atg gaa atc tgg tgg taa 1341Ser Asp Glu Trp Thr Phe Gly Ala Gln Met Glu Ile Trp Trp435 440 445<210>6<211>446<212>PRT<213>Shigella flexneri
<400>6Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala1 5 10 15Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala20 25 30Arg Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe35 40 45Gln Thr Thr Gly Ala Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Gly Asn Glu Cys Glu50 55 60Thr Tyr Ala Glu Leu Lys Leu Gly Gln Glu Val Trp Lys Glu Gly Asp65 70 75 80Lys Ser Phe Tyr Phe Asp Thr Asn Val Ala Tyr Ser Val Ala Gln Gln85 90 95Asn Asp Trp Glu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Asn Val Gln100 105 110Gly Lys Asn Leu Ile Glu Trp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Trp Ala Gly115 120 125Lys Arg Phe Tyr Gln Arg His Asp Val His Met Ile Asp Phe Tyr Tyr130 135 140Trp Asp Ile Ser Gly Pro Gly Ala Gly Leu Glu Asn Ile Asp Val Gly145 150 155 160Phe Gly Lys Leu Ser Leu Ala Ala Thr Arg Ser Ser Glu Ala Gly Gly165 170 175Ser Ser Ser Phe Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Glu Thr180 185 190Ala Asn Asp Val Phe Asp Val Arg Leu Ala Gln Met Glu Ile Asn Pro195 200 205
Gly Gly Thr Leu Glu Leu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Ala Asn Leu Arg210 215 220Asp Asn Tyr Arg Leu Val Asp Gly Ala Ser Lys Asp Gly Trp Leu Phe225 230 235 240Thr Ala Glu His Thr Gln Ser Val Leu Lys Gly Phe Asn Lys Phe Val245 250 255Val Gln Tyr Ala Thr Asp Ser Met Thr Ser Gln Gly Lys Gly Leu Ser260 265 270Gln Gly Ser Gly Val Ala Phe Asp Asn Glu Lys Phe Ala Tyr Asn Ile275 280 285Asn Asn Asn Gly His Met Leu Arg Ile Leu Asp His Gly Ala Ile Ser290 295 300Met Gly Asp Asn Trp Asp Met Met Tyr Val Gly Met Tyr Gln Asp Ile305 310 315 320Asn Trp Asp Asn Asp Asn Gly Thr Lys Trp Trp Thr Val Gly Ile Arg325 330 335Pro Met Tyr Lys Trp Thr Pro Ile Met Ser Thr Val Met Glu Ile Gly340 345 350Tyr Asp Asn Val Glu Ser Gln Arg Thr Gly Asp Lys Asn Asn Gln Tyr355 360 365Lys Ile Thr Leu Ala Gln Gln Trp Gln Ala Gly Asp Ser Ile Trp Ser370 375 380Arg Pro Ala Ile Arg Val Phe Ala Thr Tyr Ala Lys Trp Asp Glu Lys385 390 395 400Trp Gly Tyr Asp Tyr Asn Gly Asp Ser Lys Val Asn Pro Asn Tyr Gly405 410 415Lys Ala Val Pro Ala Asp Phe Asn Gly Gly Ser Phe Gly Arg Gly Asp420 425 430
Ser Asp Glu Trp Thr Phe Gly Ala Gln Met Glu Ile Trp Trp435 440 445<210>7<211>1359<212>DNA<213>Salmonella typhimurium<220>
<221>CDS<222>(1)..(1359)<223>lamB coding region<400>7atg atg att act ctg cgc aaa ctc cca ctg gcg gtt gct gtc gca gcg 48Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala1 5 10 15ggc gta atg tcc gct cag gca atg gct gtc gat ttc cac ggt tac gcc 96Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala20 25 30cgt tcc ggt att ggc tgg acg gga agc ggc ggc gaa caa cag tgt ttc 144Arg Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe35 40 45cag gca acg ggt gcc caa agt aaa tac cgt ctc ggt aac gaa tgt gaa 192Gln Ala Thr Gly Ala Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Gly Asn Glu Cys Glu50 55 60acc tat gcg gaa ctg aaa ctg ggc cag gaa gtg tgg aaa gag ggc gat 240Thr Tyr Ala Glu Leu Lys Leu Gly Gln Glu Val Trp Lys Glu Gly Asp65 70 75 80aag agc ttc tat ttc gac acc aac gtc gcc tat tcg gtt aac cag cag 288Lys Ser Phe Tyr Phe Asp Thr Asn Val Ala Tyr Ser Val Asn Gln Gln85 90 95aac gac tgg gaa tcg acc gat ccc gcc ttc cgc gaa gcg aac gtg cag 336Asn Asp Trp Glu Ser Thr Asp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Asn Val Gln100 105 110ggt aaa aac ctg att gaa tgg ctg ccg ggc tct acc atc tgg gcc ggt 384Gly Lys Asn Leu Ile Glu Trp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Trp Ala Gly115 120 125aag cgc ttc tat cag cgt cat gac gta cac atg atc gac ttc tac tac 432Lys Arg Phe Tyr Gln Arg His Asp Val His Met Ile Asp Phe Tyr Tyr130 135 140tgg gat att tca ggt cct ggc gca ggt atc gaa aat atc gat ctg ggc 480Trp Asp Ile Ser Gly Pro Gly Ala Gly Ile Glu Asn Ile Asp Leu Gly145 150 155 160
ttc ggt aag ctt tca ctg gcg gcg acc cgg tct act gaa gcg ggc ggc 528Phe Gly Lys Leu Ser Leu Ala Ala Thr Arg Ser Thr Glu Ala Gly Gly165 170 175tct tac acc ttc agc agc cag aat att tat gat gaa gtg aaa gat acc 576Ser Tyr Thr Phe Ser Ser Gln Asn Ile Tyr Asp Glu Val Lys Asp Thr180 185 190gct aac gac gtc ttt gac gta cgt ctg gct ggt ctg caa acg aac ccg 624Ala Asn Asp Val Phe Asp Val Arg Leu Ala Gly Leu Gln Thr Asn Pro195 200 205gac ggc gta ctg gag cta ggc gtt gat tac ggt cgc gcc aat acg acc 672Asp Gly Val Leu Glu Leu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Ala Asn Thr Thr210 215 220gat ggt tat aag ctg gct gat ggg gca tcg aaa gac ggc tgg atg ttc 720Asp Gly Tyr Lys Leu Ala Asp Gly Ala Ser Lys Asp Gly Trp Met Phe225 230 235 240acc gcc gaa cac acg caa agc atg ttg aaa ggc tat aac aag ttt gtc 768Thr Ala Glu His Thr Gln Ser Met Leu Lys Gly Tyr Asn Lys Phe Val245 250 255gtg caa tat gcc acc gat gcc atg acc acg cag ggt aaa ggc cag gcg 816Val Gln Tyr Ala Thr Asp Ala Met Thr Thr Gln Gly Lys Gly Gln Ala260 265 270cgc ggt tcc gac ggt tct tca tct ttc act gaa gaa ttg tct gat gga 864Arg Gly Ser Asp Gly Ser Ser Ser Phe Thr Glu Glu Leu Ser Asp Gly275 280 285acc aaa att aat tac gcc aat aag gtc atc aat aat aat ggc aat atg 912Thr Lys Ile Asn Tyr Ala Asn Lys Val Ile Asn Asn Asn Gly Asn Met290 295 300tgg cgt att ttg gat cat ggc gcc atc tcg ctt ggt gat aaa tgg gat 960Trp Arg Ile Leu Asp His Gly Ala Ile Ser Leu Gly Asp Lys Trp Asp305 310 315 320ttg atg tac gtc ggt atg tac cag aat atc gat tgg gat aat aac ctg 1008Leu Met Tyr Val Gly Met Tyr Gln Asn Ile Asp Trp Asp Asn Asn Leu325 330 335ggt act gag tgg tgg acc gtg ggt gta cgt cca atg tac aag tgg acg 1056Gly Thr Glu Trp Trp Thr Val Gly Val Arg Pro Met Tyr Lys Trp Thr340 345 350cca atc atg agc acc ctg ctg gaa gtc ggc tac gac aac gtg aaa tct 1104Pro Ile Met Ser Thr Leu Leu Glu Val Gly Tyr Asp Asn Val Lys Ser355 360 365cag cag acc ggc gat cgt aac aat caa tat aaa atc acc ctg gcg caa 1152Gln Gln Thr Gly Asp Arg Asn Asn Gln Tyr Lys Ile Thr Leu Ala Gln370 375 380
cag tgg cag gcg ggc gac agc atc tgg tcg cgt ccg gct atc cgt att 1200Gln Trp Gln Ala Gly Asp Ser Ile Trp Ser Arg Pro Ala Ile Arg Ile385 390 395 400ttc gcc acc tac gcg aaa tgg gat gag aaa tgg ggc tat atc aaa gac 1248Phe Ala Thr Tyr Ala Lys Trp Asp Glu Lys Trp Gly Tyr Ile Lys Asp405 410 415ggc gat aac att tcc cgt tat gcc gca gcg act aac tcc ggc att tcc 1296Gly Asp Asn Ile Ser Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Asn Ser Gly Ile Ser420 425 430acc aac agc cgt ggc gat agc gat gag tgg acc ttc ggc gcc cag atg 1344Thr Asn Ser Arg Gly Asp Ser Asp Glu Trp Thr Phe Gly Ala Gln Met435 440 445gaa atc tgg tgg taa 1359Glu Ile Trp Trp450<210>8<211>452<212>PRT<213>Salmonella typhimurium<400>8Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala1 5 10 15Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Val Asp Phe His Gly Tyr Ala20 25 30Arg Ser Gly Ile Gly Trp Thr Gly Ser Gly Gly Glu Gln Gln Cys Phe35 40 45Gln Ala Thr Gly Ala Gln Ser Lys Tyr Arg Leu Gly Asn Glu Cys Glu50 55 60Thr Tyr Ala Glu Leu Lys Leu Gly Gln Glu Val Trp Lys Glu Gly Asp65 70 75 80Lys Ser Phe Tyr Phe Asp Thr Asn Val Ala Tyr Ser Val Asn Gln Gln85 90 95Asn Asp Trp Glu Ser Thr Asp Pro Ala Phe Arg Glu Ala Asn Val Gln100 105 110
Gly Lys Asn Leu Ile Glu Trp Leu Pro Gly Ser Thr Ile Trp Ala Gly115 120 125Lys Arg Phe Tyr Gln Arg His Asp Val His Met Ile Asp Phe Tyr Tyr130 135 140Trp Asp Ile Ser Gly Pro Gly Ala Gly Ile Glu Asn Ile Asp Leu Gly145 150 155 160Phe Gly Lys Leu Ser Leu Ala Ala Thr Arg Ser Thr Glu Ala Gly Gly165 170 175Ser Tyr Thr Phe Ser Ser Gln Asn Ile Tyr Asp Glu Val Lys Asp Thr180 185 190Ala Asn Asp Val Phe Asp Val Arg Leu Ala Gly Leu Gln Thr Asn Pro195 200 205Asp Gly Val Leu Glu Leu Gly Val Asp Tyr Gly Arg Ala Asn Thr Thr210 215 220Asp Gly Tyr Lys Leu Ala Asp Gly Ala Ser Lys Asp Gly Trp Met Phe225 230 235 240Thr Ala Glu His Thr Gln Ser Met Leu Lys Gly Tyr Asn Lys Phe Val245 250 255Val Gln Tyr Ala Thr Asp Ala Met Thr Thr Gln Gly Lys Gly Gln Ala260 265 270Arg Gly Ser Asp Gly Ser Ser Ser Phe Thr Glu Glu Leu Ser Asp Gly275 280 285Thr Lys Ile Asn Tyr Ala Asn Lys Val Ile Asn Asn Asn Gly Asn Met290 295 300Trp Arg Ile Leu Asp His Gly Ala Ile Ser Leu Gly Asp Lys Trp Asp305 310 315 320Leu Met Tyr Val Gly Met Tyr Gln Asn Ile Asp Trp Asp Asn Asn Leu325 330 335
Gly Thr Glu Trp Trp Thr Val Gly Val Arg Pro Met Tyr Lys Trp Thr340 345 350Pro Ile Met Ser Thr Leu Leu Glu Val Gly Tyr Asp Asn Val Lys Ser355 360 365Gln Gln Thr Gly Asp Arg Asn Asn Gln Tyr Lys Ile Thr Leu Ala Gln370 375 380Gln Trp Gln Ala Gly Asp Ser Ile Trp Ser Arg Pro Ala Ile Arg Ile385 390 395 400Phe Ala Thr Tyr Ala Lys Trp Asp Glu Lys Trp Gly Tyr Ile Lys Asp405 410 415Gly Asp Asn Ile Ser Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Asn Ser Gly Ile Ser420 425 430Thr Asn Ser Arg Gly Asp Ser Asp Glu Trp Thr Phe Gly Ala Gln Met435 440 445Glu Ile Trp Trp450
權(quán)利要求
1.一種腸桿菌科重組微生物，其含有擴(kuò)增的或過表達(dá)的編碼具有麥芽糖孔蛋白LamB活性的多肽的lamB基因，并以改良的方式生產(chǎn)L-氨基酸、特別是L-蘇氨酸。
2.權(quán)利要求
1的腸桿菌科微生物，其中編碼與選自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8的氨基酸序列至少90％、特別是至少95％、優(yōu)選99％相同的多肽的多核苷酸是被擴(kuò)增的，所述多肽是具有麥芽糖孔蛋白LamB活性的多肽。
3.權(quán)利要求
2的微生物，其含有選自如下一組的相應(yīng)于lamB基因的過表達(dá)或者擴(kuò)增的多核苷酸a)具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；b)具有在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應(yīng)于SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ ID No.7的核苷酸序列的多核苷酸；c)具有在嚴(yán)格條件下與SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ IDNo.7的序列的互補(bǔ)序列雜交的序列的多核苷酸；d)具有含有功能性中性有義突變的SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或者SEQ ID No.7序列的多核苷酸。
4.權(quán)利要求
2的微生物，所述多肽具有與選自SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6和SEQ ID No.8的序列之一至少95％相同的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求
2的微生物，所述多肽具有與SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或者SEQ ID No.8的序列相同的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求
1-4中任一項(xiàng)的微生物，其通過使用含有l(wèi)amB基因、這個(gè)基因的等位基因或其部分和/或啟動子的載體經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合或者這些方法的組合而產(chǎn)生。
7.權(quán)利要求
1-6中任一項(xiàng)的微生物，其中l(wèi)am基因或者具有這種功能的多核苷酸序列的拷貝數(shù)至少增加1個(gè)。
8.權(quán)利要求
7的微生物，所述lamB基因的拷貝數(shù)增加至少1個(gè)是通過將該基因或者具有這一功能的多核苷酸序列整合進(jìn)所述微生物的染色體中而實(shí)現(xiàn)的。
9.權(quán)利要求
7的微生物，所述lamB基因的拷貝數(shù)增加至少1個(gè)是通過在染色體外復(fù)制的載體實(shí)現(xiàn)的。
10.權(quán)利要求
1或2的微生物，其特征在于為了實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，a)所述啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)域或者核糖體結(jié)合位點(diǎn)在lamB基因的上游被突變，或者b)在所述lamB基因的上游摻入表達(dá)盒或者啟動子。
11.權(quán)利要求
1或2的微生物，所述lamB基因在擴(kuò)增該基因表達(dá)的啟動子的控制下。
12.權(quán)利要求
1-11中任一項(xiàng)的微生物，其中通過擴(kuò)增所述lamB基因，LamB基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的濃度或者活性基于在非重組的起始菌株中該基因產(chǎn)物的活性或者濃度增加至少10％。
13.權(quán)利要求
1-12中任一項(xiàng)的微生物，其中在所述微生物中希望的L-氨基酸的生物合成途徑的其它基因另外是以擴(kuò)增的形式、特別是以過表達(dá)的形式存在。
14.權(quán)利要求
1-13中任一項(xiàng)的微生物，特征在于所述微生物選自埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、普羅威登斯菌屬和沙雷氏菌屬。
15.一種通過發(fā)酵腸桿菌科重組微生物生產(chǎn)L-氨基酸的方法，特征在于a)在希望的L-氨基酸在培養(yǎng)基或細(xì)胞中富集的條件下，將生產(chǎn)希望的L-氨基酸的微生物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述微生物中l(wèi)amB基因或者編碼基因產(chǎn)物麥芽糖孔蛋白LamB的核苷酸序列是擴(kuò)增的、特別是過表達(dá)的，和b)分離希望的L-氨基酸，發(fā)酵肉湯的成分和/或生物量的全部或者部分(≥0至100％)保留在分離的產(chǎn)物中或者被完全除去。
16.權(quán)利要求
15的方法，特征在于使用權(quán)利要求
1-14中任一項(xiàng)的微生物。
17.權(quán)利要求
15或16的方法，特征在于為了生產(chǎn)L-蘇氨酸，發(fā)酵腸桿菌科的微生物，所述微生物中選自如下一組的一或多個(gè)基因也同時(shí)被擴(kuò)增，特別是過表達(dá)17.1編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子的至少一個(gè)基因，17.2編碼丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒桿菌的pyc基因，17.3編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因，17.4編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因，17.5編碼吡啶轉(zhuǎn)氫酶亞基的pntA和pntB基因，17.6編碼賦予高絲氨酸抗性的蛋白質(zhì)的rhtB基因，17.7編碼賦予蘇氨酸抗性的蛋白質(zhì)的rhtC基因，17.8編碼蘇氨酸輸出載體蛋白的谷氨酸棒桿菌的thrE基因，17.9編碼谷氨酸脫氫酶的gdhA基因，17.10編碼葡糖磷酸變位酶的pgm基因，17.11編碼果糖二磷酸醛縮酶的fba基因，17.12編碼磷酸組氨酸蛋白己糖磷酸轉(zhuǎn)移酶的ptsH基因，17.13編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的酶I的ptsI基因，17.14編碼葡萄糖特異性IIA成分的crr基因，17.15編碼葡萄糖特異性IIBC成分的ptsG基因，17.16編碼亮氨酸調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物lrp基因，17.17編碼fad調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物的fadR基因，17.18編碼主要中間代謝的調(diào)節(jié)物的iclR基因，17.19編碼烷基氫過氧化物還原酶的小亞基的ahpC基因，17.20編碼烷基氫過氧化物還原酶的大亞基的ahpF基因，17.21編碼半胱氨酸合酶A的cysK基因，17.22編碼cys調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)物的cysB基因，17.23編碼NADPH亞硫酸還原酶的黃素蛋白的cysJ基因17.24編碼NADPH亞硫酸還原酶的血紅素蛋白的cysI基因，17.25編碼腺苷酰硫酸還原酶的cysH基因，17.26編碼具有抗-SigmaE活性的膜蛋白的rseA基因，17.27編碼SigmaE因子的全面調(diào)節(jié)物的rseC基因，17.28編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基的sucA基因，17.29編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸琥珀?；D(zhuǎn)移酶E2亞基的sucB基因，17.30編碼琥珀酰-CoA合成酶的β-亞基的sucC基因，17.31編碼琥珀酰-CoA合成酶的α-亞基的sucD基因，17.32編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E1成分的aceE基因，17.33編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2成分的aceF基因，17.34編碼SigmaE因子活性的調(diào)節(jié)物的rseB基因，17.35編碼麥芽糖調(diào)節(jié)子的正性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的malT基因，17.36大腸桿菌的開放讀框(ORF)yaaU的基因產(chǎn)物，17.37大腸桿菌的開放讀框(ORF)yodA的基因產(chǎn)物，和17.38大腸桿菌的開放讀框(ORF)yibD的基因產(chǎn)物。
18.權(quán)利要求
15-17中任一項(xiàng)的方法，特征在于使用其中降低希望的L-氨基酸形成的代謝途徑被至少部分弱化的微生物。
19.權(quán)利要求
18的方法，特征在于為了生產(chǎn)L-蘇氨酸，發(fā)酵腸桿菌科的微生物，其中選自如下一組的一或多個(gè)基因同時(shí)被弱化、特別是被關(guān)閉，或者降低其表達(dá)19.1編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因，19.2編碼蘋果酸脫氫酶的mdh基因，19.3大腸桿菌的開放讀框(ORF)yjfA的基因產(chǎn)物，19.4大腸桿菌的開放讀框(ORF)ytfP的基因產(chǎn)物，19.5編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pckA基因，19.6編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因，19.7編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的DgsA調(diào)節(jié)物的dgsA基因，19.8編碼果糖阻抑物的fruR基因，19.9編碼Sigma38因子的rpoS基因，19.10編碼天冬氨酸氨裂合酶的aspA基因。
20.權(quán)利要求
15-17中任一項(xiàng)的方法，特征在于生產(chǎn)選自如下一組的L-氨基酸L-天冬酰胺、L-絲氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-高絲氨酸。
21.權(quán)利要求
20的方法，特征在于生產(chǎn)選自如下一組的L-氨基酸L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-高絲氨酸、L-色氨酸和L-賴氨酸。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種通過發(fā)酵腸桿菌科的重組微生物生產(chǎn)L－氨基酸的方法，其特征是a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生所希望的L－氨基酸并且其中l(wèi)amB基因或編碼基因產(chǎn)物麥芽糖孔蛋白的核苷酸序列被擴(kuò)增，特別被過表達(dá)的微生物，所述培養(yǎng)在使得所希望的L－氨基酸在所述培養(yǎng)基中或細(xì)菌中被富集的條件下進(jìn)行，和b)分離所希望的L－氨基酸，其中發(fā)酵肉湯中的組分和/或生物量以其整體或部分保留(＝0 bis 100％)在分離的產(chǎn)物中或被完全移除。
文檔編號C12P13/08GK1993461SQ20058002626
公開日2007年7月4日 申請日期2005年7月5日
發(fā)明者梅希特希爾德·里平 申請人:德古薩股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan