雪菊提取物及雪菊總黃酮在制備治療肝纖維化藥物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及雪菊的新用途，特別是雪菊提取物的新用途，即在制備治療肝纖維化 藥物或者功能食品方面的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝纖維化由多種致病因子引發(fā)的慢性肝損傷導(dǎo)致，包括慢性病毒性肝炎、酒精毒 性、自身免疫性疾病及遺傳性代謝紊亂，其引起肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生，細(xì)胞外基質(zhì)過 度沉淀。肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞是肝星狀細(xì)胞hepatic stellate cells ,HSCs)。生理情 況下，HSCs位于肝竇與肝竇壁之間的Disse間隙內(nèi)，具有存儲(chǔ)維生素A等功能。然而，肝臟受 損后HSCs被激活，轉(zhuǎn)化成為具有收縮功能的肌纖維母細(xì)胞，分泌平滑肌α肌動(dòng)蛋白（a-SMA) 和I型膠原，合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝纖維化的形成。
[0003] NF-KB是炎癥應(yīng)答的主要介導(dǎo)者，NF-KB信號(hào)通路對(duì)于肝星狀細(xì)胞的存活和肝臟內(nèi) 環(huán)境的自我平衡至關(guān)重要。NF-κΒ信號(hào)活化可以促進(jìn)HSCs增殖，產(chǎn)生分泌平滑肌α肌動(dòng)蛋白 (α-SMA)和I型膠原，合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝纖維化的形成。抑制NF-kB活化可介導(dǎo) HSCs凋亡，抑制諸如α肌動(dòng)蛋白（α-SMA)和I型膠原產(chǎn)生，從而阻斷肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程。因 此，抑制NF-κΒ信號(hào)通路可能會(huì)作為一個(gè)潛在的肝纖維化治療手段。
[0004] 雪菊系菊科金雞菊屬植物，主要產(chǎn)地為新疆昆侖山，是一種珍貴藥食兩用植物。雪 菊含有300多種天然成分，包括黃酮、維生素、氨基酸、多糖、有機(jī)酸、萜烯類等?，F(xiàn)代藥理學(xué) 研究發(fā)現(xiàn)，雪菊是一種很強(qiáng)的抗氧化植物，其生物黃酮、萜類物質(zhì)等成分可有效地清除體內(nèi) 的氧自由基，防止細(xì)胞變性衰老以及惡性轉(zhuǎn)化，對(duì)于調(diào)節(jié)血壓，降低血脂、預(yù)防糖尿病、腫瘤 等疾病有積極的保健作用。
[0005] "新疆昆侖雪菊水提液對(duì)大鼠血脂的影響"《新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》（2013,36:366-70)崔康康等人研究報(bào)道昆侖雪菊水提液可以顯著下降SD大鼠血脂水平。
[0006] "Chemical and nutraceutical properties of Coreopsis tinctoria" 《Journal of Functional Foods》（2015,13: ll_20)LiminGuo等人報(bào)道當(dāng)前雪菊的醫(yī)學(xué)效 應(yīng)主要有抗衰老、降低血糖改善糖耐受、降血脂、降血壓、抗氧化、抗凝等。
[0007] 目前未檢索到雪菊、雪菊提取物可用于治療肝纖維化的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供雪菊提取物在制備治療肝纖維化藥物方面的新用途。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供雪菊提取物及其雪菊總黃酮作為NF-κΒ信號(hào)通路抑制劑 在制備治療肝纖維化藥物方面的新用途。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過下列的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 本發(fā)明原料來源：
[0012] 雪菊coreopsis tinctoria:系菊科金雞菊屬植物，又名兩色金雞菊，原產(chǎn)美國(guó)中 西部地區(qū)，主要分布在中國(guó)新疆昆侖山北麓海拔3000米雪線的部分地區(qū)。一年生草本植物， 有降血壓、降血脂和降血糖之功效。
[0013] 本發(fā)明通過體外實(shí)驗(yàn)，給予人肝星狀細(xì)胞LX-2雪菊總黃酮后，抑制LX-2增殖，促進(jìn) LX-2凋亡，α-SMA和I型膠原表達(dá)量隨著藥物劑量增加逐漸減少。同時(shí)，雪菊總黃酮降低NF-κ B的DNA結(jié)合活性，從而抑制NF-kB信號(hào)驅(qū)動(dòng)的下游基因表達(dá)，導(dǎo)致促凋亡基因 mRNA表達(dá)增多 (如:BCL-Xs，RIPl)，抗凋亡基因 mRNA表達(dá)減少(如:A20，F(xiàn)LIP)，從而造成肝星狀細(xì)胞LX-2凋 亡。
[0014] 本發(fā)明通過體內(nèi)試驗(yàn)，分別給予經(jīng)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠雪菊總黃酮以及雪菊 提取物處理，發(fā)現(xiàn)大鼠血清AST和ALT水平顯著降低，a-SMA和ECM表達(dá)減少，肝組織細(xì)胞勻漿 經(jīng)檢測(cè)其NF-kB的DNA結(jié)合活性顯著下降，表明雪菊提取物及其雪菊總黃酮具有抗大鼠肝纖 維化，保護(hù)肝細(xì)胞，改善肝功能的功效。
[0015] 本發(fā)明不僅證實(shí)雪菊提取物及其雪菊總黃酮具有對(duì)肝纖維化大鼠肝保護(hù)作用，而 且證明其作用機(jī)理與雪菊提取物及其雪菊總黃酮可以抑制炎性轉(zhuǎn)錄因子NF-kB生物學(xué)活 性，從而實(shí)現(xiàn)肝纖維化治療的機(jī)理。
[0016] 雪菊作為一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物，臨床應(yīng)用和日常保健的安全性非常高，在治 療肝纖維化藥物治療中不失為一種好的手段，拓寬了治療肝纖維化的新方法，而且雪菊由 于具有多重健康效應(yīng)，為患者提供了非常有益的治療選擇。
[0017] 因此，本發(fā)明提供雪菊、雪菊提取物、雪菊總黃酮能夠用于治療肝纖維化藥物方面 的新用途。
[0018] 本發(fā)明還公開了雪菊提取物在制備治療肝纖維化藥物方面的應(yīng)用，所述雪菊提取 物的制備包括以下步驟：
[0019] 將雪菊花干燥，采用PULVERISETTE 14在15000rpm轉(zhuǎn)速條件下粉碎后，沸水浴1小 時(shí)，離心，取上清，通過直徑0.22微米濾膜過濾，收集濾液。然后再向沸水浴鍋內(nèi)添加沸水， 重復(fù)上述步驟2次，將3次濾液合并后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成水浸液，濃縮，干燥，得到雪菊 提取物。
[0020] 雪菊中含有綠原酸、鄰苯二酚等具有鄰苯二羥基結(jié)構(gòu)，堿性環(huán)境下與鋁離子形成 絡(luò)合物，可能會(huì)對(duì)黃酮的測(cè)定造成干擾。蘆丁是一種結(jié)構(gòu)與功能較清楚的黃酮類化合物槲 皮素的糖苷，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用AlCl 3法測(cè)得雪菊總黃酮得率為18.47%
[0021] 本發(fā)明還公開了雪菊總黃酮在制備治療肝纖維化藥物方面的應(yīng)用，所述雪菊總黃 酮的制備包括以下步驟：
[0022] 將雪菊花干燥，采用PULVERISETTE 14在15000rpm轉(zhuǎn)速條件下后粉碎，沸水浴1小 時(shí)，離心，取上清，通過直徑0.22微米濾膜過濾，收集濾液。然后再向沸水浴鍋內(nèi)添加沸水， 重復(fù)上述步驟2次，將3次濾液合并后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成水浸液，濃縮，干燥，獲得雪菊 提取物。將該提取物減壓濃縮至最小體積后用石油醚脫脂，再用正丁醇萃取，減壓回收正丁 醇，水層減壓濃縮，真空干燥，得到雪菊總黃酮。
[0023]同樣地以蘆丁為對(duì)照品，采用AlCl3法測(cè)得雪菊總黃酮得率為17.38%。
[0024]雪菊總黃酮給藥方式為口服，劑量為20mg/kg。
【附圖說明】
[0025]圖1是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中雪菊總黃酮對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖抑制率；
[0026]圖2A-1是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中雪菊總黃酮誘導(dǎo)1X-2細(xì)胞凋亡的一次流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)代 表性結(jié)果；
[0027]圖2A-2是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中雪菊總黃酮誘導(dǎo)1X-2細(xì)胞凋亡的三次獨(dú)立流式細(xì)胞術(shù)檢 測(cè)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；
[0028]圖2B是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組，給予雪菊黃酮5mg/L處理LX-2細(xì)胞凋亡蛋白PARP檢 測(cè)；
[0029]圖3是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中雪菊總黃酮下調(diào)LX-2細(xì)胞纖維化蛋白α-SMA和ECM(type I collagen)表達(dá)；
[0030]圖4是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中雪菊總黃酮抑制LX-2細(xì)胞NF-KB的DNA結(jié)合活性ELISA分析； [0031 ] 圖5A-1、5A-2、5A-3分別是促凋亡基因FAS、BCL-Xs和RIPlmRNA表達(dá)上調(diào)；
[0032] 圖5B-1、5B-2、5B-3分別是抗凋亡A20，BCL-Xl和FLIP基因mRNA表達(dá)上調(diào)；
[0033]圖5C-1是雪菊總黃酮逆轉(zhuǎn)TNFa誘發(fā)的LX-2細(xì)胞BCL-XL表達(dá)上調(diào)（圖5C(D)，
[0034] 圖5C-2是雪菊總黃酮逆轉(zhuǎn)TNFa促進(jìn)LX-2細(xì)胞促凋亡FAS基因表達(dá)(圖5C②）；
[0035] 圖6是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中雪菊提取物、雪菊總黃酮對(duì)大鼠肝纖維化模型肝組織勻漿纖 維化標(biāo)記物a_SMA檢測(cè)結(jié)果;ECM(type I collagen)、NF_icB的DNA結(jié)合活性；
[0036] 圖7是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中雪菊提取物、雪菊總黃酮對(duì)大鼠肝纖維化模型肝組織勻漿纖 維化標(biāo)記物ECM(type I collagen)檢測(cè)結(jié)果;NF-κΒ的DNA結(jié)合活性；
[0037] 圖8是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中雪菊提取物、雪菊總黃酮對(duì)大鼠肝纖維化模型肝組織勻漿纖 維化標(biāo)記物NF-kB的DNA結(jié)合活性檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0039 ]本發(fā)明試驗(yàn)采用的試劑和原料：
[0040] RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清;Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒和PI熒光染料(美國(guó) BD公司產(chǎn)品）；NF-kB的DNA結(jié)合活性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Active Motif公司產(chǎn)品）；3-(4,5_二 甲基噻唑-2 )-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，購(gòu)自碧云天生物試劑公司）；RT-PCR引物均由上 海生工公司合成;ECM，α-SMA，PARP抗體均為Santa-Cruz公司產(chǎn)品。
[0041 ]實(shí)施例1細(xì)胞活性試驗(yàn)
[0042] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(細(xì)胞濃度為7 X 103/ml)，以每孔100μΙ接種于96孔板，于37°C、 飽和濕度、5 % C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，換成含雪菊總黃酮終濃度分別為0、2.5、5、 7.5、10、15、20、30mg/L的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每一個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，每孔加入 ΜΤΤ20μ1 (以I3BS配成5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔再加入DMS0150yl，震蕩IOmin。在酶聯(lián)免 疫檢測(cè)儀上460nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。按公式:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(空白組-雪菊總黃酮組/D 空白組）X 100%，計(jì)算雪菊總黃酮對(duì)LX-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。
[0043]結(jié)果顯示，雪菊總黃酮能夠劑量依賴性抑制LX-2細(xì)胞增殖，且其IC50值為10mg/L (如圖1所示）。
[0044] 實(shí)施例2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
[0045] 以每孔IX 106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，給予不同濃度的雪菊總黃酮， 孵育24h，使用美國(guó)BD公司FITC-Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒，根據(jù)說明書給予LX-2細(xì)胞 FITC-AnnexinV和PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集細(xì)胞，放入適量裂解液，冰上裂 解30min，4 °C 12000g離心15min，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。樣品于10 % SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行 電泳，轉(zhuǎn)移至IjPVDF膜，5%脫脂奶粉封閉Ih，以1:1000比例敷上PARP抗體，4°C過夜，次日洗膜 后加入相應(yīng)二抗，37°C孵育lh，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光。
[0046]結(jié)果顯示:如圖2A-1，為一次流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)代表性結(jié)果，所示為不同給藥濃度條 件下LX-2細(xì)胞凋亡比率(第Π，m，IV象限百分比之和），圖2A-2為經(jīng)三次獨(dú)立流式細(xì)胞術(shù)檢 測(cè)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。雪菊總黃酮5mg/L的凋亡率僅有5%，而10mg/L時(shí)凋亡率達(dá)到25%。進(jìn)一 步，我們檢測(cè)了凋亡蛋白PARP(poly ADP-ribose polymerase)，其是一種DNA修復(fù)蛋白，切 割PARP通常被認(rèn)為是凋亡指示者。如圖2B所示，相較于對(duì)照組，給予雪菊黃酮5mg/L處理LX-2細(xì)胞時(shí)就出現(xiàn)了PARP切割條帶，隨著劑量增加，切割條帶越來越明顯。