一種短桿菌及從短桿菌發(fā)酵液中分離提純延胡索酸酶的方法
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種短桿菌及從短桿菌發(fā)酵液中分離提純延胡索酸酶的方法。
【背景技術】：
[0002] 延胡索酸酶(Fumarase)又名蘋果酸裂合酶、延胡索酸水化酶或富馬酸酶，氧化還 原酶(E.C.4.2.1.2)，是三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán)）中的一個關鍵性酶，能催化延胡索酸通過加 水生成產率和光學純度都非常高的L-蘋果酸，且反應機制較為單一，是一種非常具有商業(yè) 價值的酶。工業(yè)生產中酶一般以粗酶的形式，然而一定純度的酶不僅能夠提高催化效率，降 低能耗，同時減少因雜酶的影響而產生的副產物，影響產品純度。
[0003] 常見的延胡索酸酶蛋白純化方法有鹽析沉淀法、疏水層析、離子交換層析和凝膠 過濾等。但傳統(tǒng)方法分離回收率低，樣品處理少，雜質多，產品純度低。

【發(fā)明內容】
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[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種短桿菌，本發(fā)明的另一目的是針對現有技術提取延胡索 酸酶純度低、回收率低的問題的問題，而提供了一種簡單易行，成本低，純度低，易于大規(guī)模 生產的一種從短桿菌發(fā)酵液中分離提純延胡索酸酶的方法。
[0005] 本發(fā)明的技術方案為:一種短桿菌，菌種的拉丁學名是Brevibacterium sp.，參據 的微生物：NJWGY2133,保藏日期為2008年5月26日，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.2520〇
[0006] 本發(fā)明還提供了從上述的短桿菌的發(fā)酵液中分離提純延胡索酸酶的方法，具體步 驟如下：
[0007] (1)發(fā)酵培養(yǎng):將短桿菌菌株接種于肉湯瓊脂培養(yǎng)基后培養(yǎng);挑取1環(huán)單菌落接種 至種子培養(yǎng)基，控制裝體積液量15%~25%，溫度28~37°C，轉速180~220rpm，置于搖床中 培養(yǎng)20~28h得種子液；以2%~10%的體積接種量接種于發(fā)酵產酶培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐體積 裝液量為20~40%，控制溫度為25~37°C，攪拌速率220~400rpm，pH控制在7.0~7.5，培養(yǎng) 24~32h得發(fā)酵液；
[0008] (2)粗酶液的制備:將步驟(1)所得短桿菌發(fā)酵液離心，過濾制得菌絲體;將菌體細 胞加入去離子水中，制得質量濃度為35~45%的細胞懸浮液；用KQ-1001型超聲機超聲破 碎，得含有延胡索酸酶的混合物；
[0009] (3)雙水相萃取劑的制備：向無機鹽水溶液中添加聚乙二醇，并不斷攪拌混合均 勻，制得聚乙二醇-無機鹽雙水相體系溶液;其中雙水相體系中無機鹽的質量百分比為5~ 15%，聚乙二醇的質量百分比為15~20% ;
[0010] ⑷雙水相萃取:將步驟⑵得到的粗酶液調節(jié)pH至8.0~8.5,加入步驟⑶中聚乙 二醇-無機鹽雙水相體系溶液，雙水相體系溶液與粗酶液的體積比為1: (1.5~2.0)，震蕩萃 取;靜止待分層后，分別得無機鹽下相溶液和含有延胡索酸酶的聚乙二醇上相溶液；
[0011] (5)二次萃取:將步驟(4)制得的聚乙二醇上相溶液調節(jié)pH至6.5~7.0,加入無機 鹽，使無機鹽在總體系中的質量百分比為2~4%;震蕩萃取，靜止待分層后，分別得含有延 胡索酸酶的無機鹽下相溶液和聚乙二醇上相溶液；
[0012] (6)將步驟(5)制得的含有延胡索酸酶的無機鹽下相溶液，透析除鹽，冷凍干燥，制 得延胡索酸酶。
[0013] 優(yōu)選步驟（1)中種子培養(yǎng)基組分為：葡萄糖15~20g/L，酵母浸粉1.0~5.0g/L，玉 米漿20~35g/L，MgS〇4*7H 20 0.3~0.7g/L，控制pH 7.0~7.5;
[0014]優(yōu)選步驟（1)中發(fā)酵培養(yǎng)基包括下述組分：葡萄糖15~20g/L，酵母浸粉1.0~ 5.0g/L，玉米漿20~35g/L，MgS〇4 · 7H20 0.3~0.7g/L，氯化鈉 2~5g/L，KH2P〇42~4g/L。
[0015] 優(yōu)選步驟(2)中離心轉速為6000~8000r/min，離心時間為15~25min。
[0016] 優(yōu)選步驟(3)、（4)和（5)中的聚乙二醇分子量均為1000、1500或2000任意一種;無 機鹽選自硫酸鎂、硫酸鈉、硫酸銨、磷酸氫二鈉或磷酸氫二鉀任意一種。
[0017] 優(yōu)選步驟(4)和(5)中的靜置分相時間均為20~40min。
[0018] 優(yōu)選步驟(6)中透析選用分子量8000~1 OOOODa的透析袋。
[0019] 上述將短桿菌菌株接種于肉湯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)采用常規(guī)方法培養(yǎng)。
[0020] 本發(fā)明中延胡索酸酶的活力測定方法為：
[0021] 收集發(fā)酵結束后的菌體細胞，用生理鹽水洗滌后，再用生理鹽水制成每mL含0. lg 濕菌體的菌懸液，供測定延胡索酸酶活力使用。從中取〇. 5ml，加入含0.4%膽酸的1M延胡索 酸鈉 (pH 7.0)溶液2. OmL，于37°C反應lh。將反應混合物煮沸5min，以終止反應，在370nm處 測定吸光度值(0D)。
[0022]每g濕菌體每min催化延胡索酸生成Ιμπιο? L-蘋果酸所需的酶量定義為一個酶活 力單位(U)。
[0023] 本發(fā)明選用的CGMCC No.2520菌株具有下述特征：
[0024] 1.形態(tài)特征：
[0025]菌落在肉湯培養(yǎng)基，菌落呈圓形，平坦光滑，不透明，閃光，油質狀，無定形。全緣灰 色，偶爾產生微黃色素，大小1.4~1.7 Χ0.8μηι。在光學顯微鏡下，細胞形態(tài)為桿狀、端圓。 [0026] 2.生理生化性質：
[0027]
[0028]注:+生長或者利用；一不生長或者不利用 [0029] 有益效果：
[0030] 利用發(fā)明生產提純延胡索酸酶工藝簡單，成本低，所得延胡索酸酶純度高、回收率 高，分離過程經濟，環(huán)境友好，對延胡索酸酶活性影響小，易于實現工業(yè)化，為從微生物中分 離提純延胡索酸酶提供了可行的提取技術。
[0031] 保藏信息
[0032] 上述短桿菌Brevibacterium sp.，參據的微生物:NJWGY2133是由本實驗室選育并 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學 院微生物研究所），其簡稱為061〇：，保藏中心登記入冊編號為061〇：如.2520，保藏日期為 2008年5月26日。
【具體實施方式】：
[0033]下面結合實施例對本發(fā)明進行進一步的闡述，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并 不對其內容進行限定。
[0034] 下述實施例中，所用發(fā)酵液以短桿菌（Brevibacterium sp · )NJWGY2133CGMCC No. 2520發(fā)酵所得的發(fā)酵液為例。
[0035] 實施例1:
[0036] (1)短桿菌接種于肉湯瓊脂培養(yǎng)基后培養(yǎng)，挑取1環(huán)單菌落，接入裝有種子培養(yǎng)液 的錐形瓶中，控制體積裝液量15%，30°C、180r/min搖床中培養(yǎng)24h得種子液;按3%的體積 接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐體積裝液量為20 %，控制溫度為25 °C，攪拌速率 220rpm，pH控制在7.0，發(fā)酵培養(yǎng)30h得發(fā)酵液。其中：種子培養(yǎng)基組分為:葡萄糖20g/L，酵母 浸粉l.〇g/L，玉米漿25g/L，MgS〇4· 7H20 0.5g/L，控制pH 7。發(fā)酵所用培養(yǎng)基包括下述組分： 葡萄糖 15g/L，酵母浸粉4g/L，玉米衆(zhòng)35g/L，MgS〇4· 7H2〇 0.7g/L，氯化鈉2g/L，KH2P〇4 2g/ L〇
[0037] (2)將發(fā)酵液在8000r/min條件下離心20min，過濾制得菌絲體，將菌體細胞加入去 離子水中，制得質量濃度為40%的細胞懸浮液。用KQ-1001型超聲機超聲破碎，得含有延胡 索酸酶的粗酶液150ml，調節(jié)pH至8.0。
[0038] (3)配置硫酸鎂溶液250ml，加入PEG 2000,使得聚乙二醇在體系中質量百分比為 15%，硫酸鎂的質量百分比為5%，充分混勻。
[0039] (4)將步驟(2)所得粗酶液與步驟(3)所得雙水相體系按1:1.5體積比混合，攪拌均 勻，靜置20min分相，制得硫酸鎂下相167ml。含延胡索酸酶的聚乙二醇上相208ml。
[0040] (5)向步驟(4)中得到的上相溶液中加入硫酸鎂，使得硫酸鎂在總體系中的質量濃 度為2%，用硫酸調節(jié)pH到6.5,充分混勻。震蕩萃取，靜置30min。得含有延胡索酸酶的下相 硫酸鎂溶液60ml及聚乙二