生物催化生產(chǎn)磷酸肌酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及磷酸肌酸的制備方法的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用生物酶催化技術(shù) 生產(chǎn)磷酸肌酸的生物催化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 磷酸肌酸(phosphocreatine)是在肌肉或其他可興奮組織(如腦和神經(jīng)）中的一種 高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暫時(shí)貯存形式。磷酸肌酸的作用非常多，其主要作用有以 下七點(diǎn)：（1)心肌保護(hù)劑:磷酸肌酸廣泛地分布于身體各組織，90%在肌肉組織中，磷酸肌酸 是用來(lái)維持ATP水平的，磷酸肌酸通過(guò)開放合成通路和減少分解作用，保護(hù)肌纖維膜免受缺 血損害并維持細(xì)胞的核酸儲(chǔ)備。臨床用于心麻痹癥的心臟保護(hù)及心肌代謝窘迫的其他狀 況。適用于心肌缺血、肥厚、心梗及心衰的治療(輔助治療），亦可用作各種心臟手術(shù)；（2)緩 沖肌肉中酸性物質(zhì)突然增高；（3)磷酸肌酸(CP)還參與能量運(yùn)輸，即把能量從線粒體運(yùn)載到 肌肉的其它部位；（4)運(yùn)動(dòng)員首選的運(yùn)補(bǔ)劑:磷酸肌酸對(duì)于增加運(yùn)動(dòng)員的體能，提高運(yùn)動(dòng)成 績(jī)有明顯的效果、安全有效，無(wú)副作用。在比賽中，磷酸肌酸(CP)水平的增加能提高訓(xùn)練和 比賽成績(jī)；（5)ATP的貯存形式:磷酸肌酸可以把高能磷酸轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP，因此磷酸肌酸 是ATP的貯存形式；（6)與ADP作用而產(chǎn)生ATP:當(dāng)體內(nèi)肌酸磷酸激酶降低至零之前，腦組織缺 氧時(shí)，磷酸肌酸均能與ADP作用而產(chǎn)生ATP; (7)緩沖劑的作用:磷酸肌酸除提供能量外，在大 強(qiáng)度練習(xí)中還可以對(duì)控制肌肉中的酸性物質(zhì)起緩沖劑的作用，這是因?yàn)榱姿峒∷嵩诤铣?ATP過(guò)程中需要消耗大強(qiáng)度練習(xí)中堆積在肌肉中乳酸釋放出來(lái)的氫離子，而肌肉中氫離子 過(guò)多會(huì)阻礙肌肉收縮，所以磷酸肌酸能起緩沖作用并推遲疲勞的出現(xiàn)。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，磷酸肌酸的生產(chǎn)方法包括化學(xué)合成法和生物催化法?；瘜W(xué)合成法具 有反應(yīng)條件苛刻、激烈、不易控制，生成產(chǎn)物復(fù)雜，污染環(huán)境，合成過(guò)程中需要用到有毒且易 燃的原料等缺點(diǎn)；而生物催化法則是以肌酸和ATP為底物，在肌酸激酶的催化下，專一生成 磷酸肌酸，具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快、專一性強(qiáng)及低碳環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于肌酸激 酶的活力較低，且來(lái)源受限，致使磷酸肌酸的生產(chǎn)成本過(guò)高，嚴(yán)重制約了磷酸肌酸生物催化 法的規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述【背景技術(shù)】中提到的磷酸肌酸現(xiàn)有生產(chǎn)方法存在的缺陷，本發(fā)明的目的在 于提供一種產(chǎn)率高、成本低、適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的磷酸肌酸的生物催化生產(chǎn)方法。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明人對(duì)具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的Oryctolagus cuniculus肌酸激酶親本基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，PCR擴(kuò)增后插入適當(dāng)?shù)妮d體，隨后在LB培養(yǎng)基 上篩選，從而獲得了具有高催化活性的肌酸激酶突變體，因此，本發(fā)明提供了一種生物催化 生產(chǎn)磷酸肌酸的方法，其特征在于：以肌酸和三磷酸腺苷為底物，在肌酸激酶突變體的催化 作用下生產(chǎn)磷酸肌酸，所述肌酸激酶突變體具有如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
[0006] 上述肌酸激酶突變體可以是未經(jīng)純化的粗酶形式;也可以是經(jīng)部分純化或完全純 化的酶，純化過(guò)程可采用常規(guī)的Histag法;如果需要，還可以是利用固化技術(shù)制成的固相酶 或者固相細(xì)胞形式的固化酶。
[0007]優(yōu)選地，所述肌酸與所述三磷酸腺苷的摩爾比為20:1。
[0008] 優(yōu)選地，所述催化過(guò)程還需加入MgCl2和三聚磷酸鈉。
[0009] 優(yōu)選地，所述催化過(guò)程是在pH值為7~8的緩沖溶液中進(jìn)行。
[0010] 所述緩沖溶液優(yōu)選為Tr is-HCl緩沖溶液。
[0011] 優(yōu)選地，所述肌酸激酶突變體為固定在酶固定化載體上的固定化肌酸激酶突變 體。
[0012] 所述酶固定化載體優(yōu)選為環(huán)氧型LX-3000、二氧化硅、活性炭、玻璃珠或者大孔型 聚N-氨乙基丙稀酰胺-聚乙稀。
[0013] 優(yōu)選地，所述固定化肌酸激酶突變體的加入量為0.01-0.5g/ml緩沖溶液。
[0014] 優(yōu)選地，所述固定化肌酸激酶突變體的制備方法包括以下步驟：
[0015] ⑴制備洗酶緩沖液：〇.〇2M Tris-HCl和0.001M EDTA的混合溶液，pH值為7.0;
[0016] (2)制備PB溶液:2 · Omol/L磷酸二氫鉀，pH值為7 · 5;
[0017] (3)用步驟（1)制備的洗酶緩沖液將所述肌酸激酶突變體稀釋至5-10mg/ml，并將 得到的酶稀釋液與步驟(2)制備的PB溶液等體積混合，再加入所述酶固定化載體，于搖床中 反應(yīng)，所述酶固定化載體的加入量為10毫克酶/克載體；
[0018] (4)待步驟(3)反應(yīng)完全后將所得反應(yīng)液過(guò)濾，并用步驟（1)制備的洗酶緩沖液清 洗，即得固定化肌酸激酶突變體。
[0019]以O(shè)ryctolagus cuniculus肌酸激酶親本的基因?yàn)槟０逯苽渖鲜黾∷峒っ竿蛔凅w 的方法優(yōu)選包括以下步驟：
[0020] (l)PCR擴(kuò)增具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的肌酸激酶親本，擴(kuò)增引物對(duì) 如下
[0021] ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '，
[0022] ckm-R:5'GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3'；
[0023] (2)步驟(1)擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后與載體連接，得質(zhì)粒A;
[0024] (3)以步驟(2)得到的質(zhì)粒A為模板，PCR擴(kuò)增得F-YR片段，擴(kuò)增引物對(duì)如下
[0025] ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '，
[0026] 100YR:5'TTCCTATTATACATCTCTGGCCTTTTTACCTCATA3'；
[0027] (4)以步驟(2)得到的質(zhì)粒A為模板，PCR擴(kuò)增得YF-R片段，擴(kuò)增引物對(duì)如下
[0028] 100YF:5'AGAGATGTATAATAGGAAAGAATATTCAGGAAC 3'，
[0029] ckm-R:5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '；
[0030] (5)以步驟(3)得到的F-YR片段以及步驟(4)得到的YF-R片段為模板，PCR擴(kuò)增得全 長(zhǎng)突變體基因 F100Y，擴(kuò)增引物對(duì)如下
[0031] ckm-F:5 ' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3 '，
[0032] ckm-R：5'GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3'；
[0033] (6)步驟(5)得到的FI 00Y經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后與載體連接，得質(zhì)粒B;
[0034] (7)將步驟(6)得到的質(zhì)粒B轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞中，對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)并 誘導(dǎo)表達(dá)，然后進(jìn)行細(xì)胞破碎處理，提取即得肌酸激酶突變體。
[0035] 本發(fā)明提供的上述肌酸激酶突變體的制備方法中，載體優(yōu)選為pRSET-A。當(dāng)然，其 還可采用任何適用的其他載體，例如:包括PRSET和pES21在內(nèi)的原核表達(dá)載體、包括pUCl 8/ 19和pBluscript-SK在內(nèi)的克隆載體等。
[0036] 本發(fā)明提供的上述肌酸激酶突變體的制備方法中，所獲得的肌酸激酶突變體基因 可以在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)，也可采用本領(lǐng)域已知的任何其它適當(dāng)方法實(shí)現(xiàn)在原 核細(xì)胞或真核細(xì)胞胞外表達(dá)。
[0037] 本發(fā)明提供的上述肌酸激酶突變體的制備方法中，載體的宿主細(xì)胞可以是包括大 腸桿菌在內(nèi)的原核細(xì)胞，也可以是包括釀酒酵母和畢赤巴斯德酵母在內(nèi)的真核細(xì)胞。
[0038] 有益效果：
[0039] 本發(fā)明提供的磷酸肌酸的生物催化生產(chǎn)方法除具備傳統(tǒng)的生物催化方法所共同 具備的反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快、專一性強(qiáng)及低碳環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)之外，還兼具目前現(xiàn)有的磷 酸肌酸的生物催化方法所不具備的產(chǎn)率高、成本低、適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。前述后 一部分優(yōu)點(diǎn)的獲得在本發(fā)明中主要來(lái)源于以下兩個(gè)方面：1、經(jīng)酶活性測(cè)定，本發(fā)明人工誘 導(dǎo)獲得的具有如SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列的肌酸激酶突變體的比活性較肌酸激酶親 本高出111% ;2、經(jīng)過(guò)固定化的肌酸激酶突變體具有更高的活力和更好的穩(wěn)定性，可提高酶 重復(fù)使用率。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明提供的生物催化方法使肌酸轉(zhuǎn)化為磷酸肌酸的轉(zhuǎn)化率超 過(guò) 85 %。
【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1為肌酸激酶親本與肌酸激酶突變體的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；
[0041] 圖中，從左至右的三條泳道依次為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、肌酸激酶親本粗提蛋白（A)、 肌酸激酶突變體粗提蛋白（B)，箭頭所指示為目的酶的位置。
【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā) 明的解釋，本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例，實(shí)施例中未注明具體條件者，按常規(guī)條件或制造 商建議的條件進(jìn)行。
[0043] 實(shí)施例1
[0044]肌酸激酶親本基因的擴(kuò)增與克隆
[0045] 肌酸激酶親本系指來(lái)自O(shè)ryctolagus cuniculus的肌酸激酶(CKM)，其核苷酸序列 如SEQIDN0:l所示（參考GenBankNM_001082239)，氨基酸序列如SEQIDN0:2所示（參考 GenBank ΝΡ_00 1075708 )。根據(jù)肌酸激酶親本的基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)ckm-F: 5' GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT3 ' 和ckm-R: 5 ' GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3 '。用引 物對(duì)ckm_F和ckm-R從Oryctolagus cuniculus cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增肌酸激酶編碼基因。
[0046] 擴(kuò)增條件為：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2S〇4,2mM MgS〇4， 0.1%Triton X-100,50mM dATP，50mM dTTP，50mM dCTP，50mM dGTP，400nM引物ckm-F， 400nM引物ckm-R，100ng cDNA，1.0U Pfu DNA聚合酶（Promega，USA)，再用無(wú)菌水調(diào)反應(yīng)體 積至50ml。
[0047] PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C3分鐘，35圈循環(huán):95°C50秒、50°C30秒和72°C1分鐘，最 后7 2 °C 10分鐘。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nd e I和BamH I酶切后與經(jīng)同樣限制性內(nèi)切酶 Ndel和BamHI酶切的載體pRSET-A(源自 Invitrogen，USA)連接，得質(zhì)粒pRSET-ckm。經(jīng)DNA測(cè) 序，確定該被克隆的肌酸激酶的核苷酸序列，具體示于序列表中