一種甲氧芐啶半抗原及其膠體金檢測裝置及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種甲氧芐啶半抗原及其膠體金檢測裝 置及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲氧芐啶是一種親脂弱堿性乙胺嘧啶類抑菌劑。其抗菌譜和磺胺類藥物相似，但 抗菌作用較磺胺類藥物強，對大腸桿菌、奇異變形桿菌、肺炎桿菌、腐生葡萄球菌、多種革蘭 陽性和陰性細菌有效，但對綠膿桿菌感染無效，最低抑菌濃度常低于lOmg/1，單用易引起細 菌耐藥性，故一般不單獨使用，主要與磺胺藥組成復(fù)方制劑。因此它又被稱為磺胺增效劑， 用于擴大抗菌譜，增強抗菌活性。臨床上用于治療尿路感染、腸道感染、呼吸道感染、菌痢、 腸炎、傷寒、腦膜炎、中耳炎、流腦、敗血癥及軟組織感染等?？膳c長效磺胺藥合用于耐藥惡 性瘧的防治。隨著磺胺類藥物在獸醫(yī)臨床上不合理的使用，甚至濫用，以至于抗菌增效劑類 藥物在動物源性食品中的殘留會不可避免地發(fā)生。人類長期食用含有甲氧芐啶殘留的動物 性食品及其制品，將有可能對人類健康產(chǎn)生危害。因此為了加強對動物性食品中這類藥物 的監(jiān)控，建立一種準確、快速、方便的甲氧芐啶殘留量檢測方法很有必要。
[0003] 目前，國內(nèi)外檢測甲氧芐啶的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)，液相-質(zhì)譜聯(lián)用 (LC-MASS)法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法。在食品安全檢測中，往往先用ELISA初篩后再對陽 性樣本用HPLC或LC-MASS進行確證。上述方法中所用儀器設(shè)備安規(guī)復(fù)雜、成本高、對操作人 員技術(shù)要求高且不能立即顯示結(jié)果，因此不適用于商檢、防疫、畜牧生產(chǎn)者對懷疑對象進行 快速的在線檢測和監(jiān)控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種甲氧芐啶半抗原及其膠體金檢測裝置及其 制備方法，針對現(xiàn)有檢測甲氧芐啶技術(shù)的不足，建立一種檢測甲氧芐啶殘留的快速方法，使 其能更加快速、靈敏、簡便地檢測甲氧芐啶殘留，滿足了快速檢測的需要，給食品安全提供 重要手段。
[0005] 對此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] -種甲氧芐啶半抗原，其具有式（1)所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式：
[0007] 〇
[0008] 上述分子式的化學(xué)名為3-(4-( (2,4_二氨基嘧啶-5-)甲基-2，6_二甲氧基苯基)丙 酸，C16H2〇N4〇5，MASS [M+H]為349 · 2，熔點：214度。
[0009] 作為本發(fā)明的進一步改進，所述的甲氧芐啶半抗原采用以下步驟制備得到：
[0010] 步驟S1:在甲氧芐啶中加入氫溴酸，于90~110°C下反應(yīng)2~4h，然后加入氫氧化鈉 溶液淬滅，冷卻析出晶體后，將晶體溶解于沸水中，調(diào)節(jié)pH值至中性，重結(jié)晶提純；
[0011] 步驟S2:取步驟S1中提純的晶體溶于DMF(二甲基甲酰胺）中，加入碳酸鉀及溴丙 酸，40°C反應(yīng)4~8小時，采用乙酸乙酯萃取過柱提純得所述甲氧芐啶半抗原。
[0012] 作為本發(fā)明的進一步改進，所述甲氧芐啶與氫溴酸的摩爾比為1:3~12;優(yōu)選的， 所述氫溴酸的質(zhì)量百分比濃度為48%;進一步優(yōu)選的，所述甲氧芐啶與氫溴酸的摩爾比為 1：10〇
[0013] 本發(fā)明還公開了一種甲氧芐啶免疫抗原，采用如上所述的甲氧芐啶半抗原制備得 至1J，將所述甲氧節(jié)啶半抗原與DCC(Dicyclohexylcarbodiimide，二環(huán)己基碳二亞胺）、NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)混合，于4°C下攪拌，離心后取上清液;將人血清蛋白溶于pH值為8.0的 PBS溶液中，加入DMF后攪拌，然后將所述上清液逐漸加入其中，4°C下反應(yīng)12h，離心后，取上 清液，透析純化，得到所述甲氧芐啶免疫抗原。
[0014] 作為本發(fā)明的進一步改進，所述透析純化時，在4°C下用生理鹽水透析3天，每天更 換3次透析液。
[0015] 本發(fā)明還公開了一種甲氧芐啶單克隆抗體，采用如上所述的甲氧芐啶免疫抗原與 免疫Balb/c小鼠經(jīng)細胞融合，篩選得到分泌甲氧芐啶單克隆抗體的雜交瘤細胞，用獲得的 雜交瘤細胞采用體內(nèi)誘生腹水法制備得到甲氧芐啶單克隆抗體。
[0016] 優(yōu)選的，所述甲氧芐啶單克隆抗體采用以下方法制備得到:使用所述甲氧芐啶免 疫抗原并鑒定后免疫4只6周齡昆明小鼠，加強免疫三次后，采血測效價，待血清效價不再上 升，用兩倍劑量的抗原不加佐劑免疫小鼠，三天后脫頸致死小鼠，在無菌條件下取脾臟制備 脾細胞，與生長旺盛的小鼠骨髓瘤細胞按8:1的比例混合于50mL離心管，加入30mL無血清 IPMI1640培養(yǎng)基，1100r/min離心5分鐘棄上清，將細胞團輕輕振松，置于37攝氏度水浴中。 把lmL50% (體積百分比)PEG-4000緩緩加入細胞中，在1分鐘內(nèi)滴完，同時輕輕攪動底部沉 淀，靜置1分鐘后，前30秒沿管壁緩慢勻速加入無血清培養(yǎng)基lmL，后30秒加入2mL，然后快速 加入27mL終止融合過程，1100r/min離心5分鐘，棄上清，用HAT選擇性培養(yǎng)基重懸后加到已 鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，37攝氏度、體積百分比5%的C0 2條件下培養(yǎng)。7天后換 成HT培養(yǎng)液，待孔內(nèi)的雜交細胞數(shù)量達到300個以上時，用間接ELI SA法篩選，選擇強陽性、 抑制效果好、細胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，經(jīng)3次以上的克隆培養(yǎng)和檢測，均呈 陽性的孔內(nèi)細胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)以備單克隆抗 體的制備;然后，采用體內(nèi)誘生腹水法生產(chǎn)甲氧芐啶單克隆抗體。
[0017] 作為本發(fā)明的進一步改進，所述體內(nèi)誘生腹水法的步驟為:對小鼠腹腔注射液體 石蠟油0.5mL/只，7天后腹腔注射所述雜交瘤細胞3~5 X 106/只，10天后，待小鼠腹部明顯 膨大時收集腹水，用正辛酸-硫酸銨沉淀法來純化腹水得到所述甲氧芐啶單克隆抗體。
[0018] 本發(fā)明還公開了一種甲氧芐啶膠體金檢測裝置，其包括反應(yīng)杯和檢測試紙，所述 檢測試紙包括底板、以及底板上依次鋪設(shè)的樣品墊，硝酸纖維素膜和吸水紙;所述反應(yīng)杯里 含有膠體金標記的如上所述甲氧芐啶單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線和控制 線，所述檢測線為采用如上所述的甲氧芐啶免疫抗原在硝酸纖維素膜上進行噴涂制得。
[0019] 作為本發(fā)明的進一步改進，所述控制線為采用兔抗鼠 IgG進行噴涂制得，所述檢測 線和控制線相互平行。優(yōu)選的，所述檢測線和控制線距離至少0.5cm。
[0020]優(yōu)選的，所述兔抗鼠 IgG是通過以下方法獲得：
[0021]用載體蛋白結(jié)合抗原免疫新西蘭白兔，免疫劑量為50yg~lOOyg/次，背部皮下分 多點注射，其中所述載體蛋白為常規(guī)的載體蛋白，優(yōu)選人血清白蛋白、卵清蛋白或牛血清白 蛋白；首免，用合成的人工抗原與等量弗氏完全佐劑乳化;加強免疫，用合成的人工抗原與 等量弗氏不完全佐劑乳化，連續(xù)免疫4~5次，每次間隔4~8周，最后一次免疫后10~15天， 以ELISA法測其定效價達到10 5以上時，采血并分離收集高免血清，以飽和硫酸銨鹽析法提 取兔抗鼠 I gG抗體，-20 °C凍存?zhèn)溆谩?br>[0022]本發(fā)明還公開了如上所述的甲氧芐啶膠體金檢測裝置的制備方法，其包括以下步 驟：
[0023]步驟A:在甲氧芐啶中加入氫溴酸，于90~110°C下反應(yīng)2~4h，然后加入氫氧化鈉 溶液淬滅，冷卻析出晶體后，將晶體溶解于沸水中，隨后加入濃氨水調(diào)節(jié)至pH為7，重結(jié)晶提 純;將提純的晶體溶于DMF中，加入碳酸鉀及溴丙酸，40°C反應(yīng)6小時，采用乙酸乙酯萃取過 柱提純得所述甲氧芐啶半抗原;利用碳二亞胺法將所述甲氧芐啶半抗原與載體蛋白牛血清 偶聯(lián)，制備得到甲氧芐啶免疫抗原；
[0024]優(yōu)選的，所述甲氧芐啶與氫溴酸的摩爾比為1:3~12;優(yōu)選的，所述氫溴酸的質(zhì)量 百分比濃度為48%。進一步優(yōu)選的，所述甲氧芐啶與氫溴酸的摩爾比為1:10。
[0025]優(yōu)選的，所述甲氧芐啶免疫抗原的制備步驟為將所述甲氧芐啶半抗原與DCC、NHS 混合，于4°C下攪拌，離心后取上清液;將人血清蛋白溶