專利名稱：天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白液的制備方法。
背景技術(shù)：
土傳病害是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的病害，主要使用高毒、劇毒化學(xué)農(nóng)藥或使用農(nóng)用抗生素來進(jìn)行防治。而化學(xué)農(nóng)藥存在安全性差、污染環(huán)境、危害人體健康等問題；農(nóng)用抗生素雖在一定程度上解決了化學(xué)農(nóng)藥所存在的問題，但對(duì)土傳病害防效顯著的種類極少，且長期使用會(huì)導(dǎo)致病原菌抗藥性的產(chǎn)生，以及同類醫(yī)藥抗生素在人體失效，對(duì)人體健康形成潛在危害。微生物產(chǎn)生的抗菌蛋白制品在生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用已取得了一定的成效，但是由于現(xiàn)有的抗菌蛋白制品毒性大、抗菌譜窄、在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決目前農(nóng)用抗生素對(duì)土傳病害防效顯著的種類極少，長期使用導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性及同類醫(yī)藥抗生素在人體失效和現(xiàn)有抗菌蛋白制品毒性大、抗菌譜窄的問題，而提供的一種天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液的制備方法。天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液按以下步驟制備(一)將側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到斜面活化培養(yǎng)基上，在30±2℃的條件下活化培養(yǎng)24±0.5h；(二)按50mL液體種子培養(yǎng)基接種一滿環(huán)側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21的比例將經(jīng)過活化的側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到液體種子培養(yǎng)基，然后再在30±2℃、180r/min的條件下培養(yǎng)18～24h；(三)將液體種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基混合，液體種子培養(yǎng)液占混合液總體積的3％～4％，混合液在30±2℃、180r/min的條件下培養(yǎng)48～120h，即得到天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液；其中斜面活化培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基或葡萄糖蛋白胨固體培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基按蛋白胨3～6g、牛肉膏1～4g、氯化鈉4～5g和水1000mL的比例制成，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。本發(fā)明選用的側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21(《生物技術(shù)》2005 Vol.15 No.3P.64-67)對(duì)環(huán)境和人體健康安全性高。本發(fā)明制備的天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液可直接使用，為綠色農(nóng)產(chǎn)品，無毒無害，不污染環(huán)境，對(duì)人體無不良影響。本發(fā)明制備的天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液中含有多種抗菌蛋白，抑菌譜廣，對(duì)多種植物病原真菌、部分革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌都有抑制作用，適合用于防治多種作物、果疏的土傳病害。


圖1和圖2是天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液分成三組進(jìn)行抑菌試驗(yàn)的結(jié)果圖，圖1培養(yǎng)基上的病菌是辣椒根腐病菌，圖2培養(yǎng)基上的病菌是辣椒炭疽病菌。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液按以下步驟制備(一)將側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到斜面活化培養(yǎng)基上，在30±2℃的條件下活化培養(yǎng)24±0.5h；(二)按50mL液體種子培養(yǎng)基接種一滿環(huán)側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21的比例將經(jīng)過活化的側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到液體種子培養(yǎng)基，然后再在30±2℃、180r/min的條件下培養(yǎng)18～24h；(三)將液體種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基混合，液體種子培養(yǎng)液占混合液總體積的3％～4％，混合液在30±2℃、180r/min的條件下培養(yǎng)48～120h，即得到天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液；其中斜面活化培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基或葡萄糖蛋白胨固體培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基按蛋白胨3～6g、牛肉膏1～4g、氯化鈉4～5g和水1000mL的比例制成，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。
本實(shí)施方式制備的天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液經(jīng)過胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶酶解后，抑菌活性明顯降低，甚至消失。說明產(chǎn)生抑菌活性的物質(zhì)為蛋白質(zhì)性質(zhì)。將本實(shí)施方式制備的天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明在紫外反射光源254nm下，在展層后的綠色熒光薄板上可以看到四條明顯的暗藍(lán)色條帶，抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，其中有三條條帶具有抗菌活性。在紫外透射光源下，也能看到四條明顯的亮藍(lán)色熒光條帶，但這四條亮藍(lán)色熒光條帶同反射光源254nm下觀察到的暗藍(lán)色條帶不完全一致，Rf值有差異，這說明發(fā)酵液中的組分較多，不同的組分其最大紫外吸收的波長不同。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，這四條紫外透射熒光條帶都具有抗菌活性，且抗菌活性各不相同其中第一個(gè)組分(Rf＝0)和第四個(gè)組分(Rf＝0.66)對(duì)蠟樣芽孢桿菌有較好的抗菌活性，對(duì)辣椒根腐病菌沒有抑菌效果，第二個(gè)組分(Rf＝0.31)雖然對(duì)蠟樣芽孢桿菌沒有活性，但對(duì)辣椒根腐病菌有較好的抑制作用，第三個(gè)組分(Rf＝0.50)則對(duì)蠟樣芽孢桿菌和辣椒根腐病菌都有較好的抗菌活性。這充分說明發(fā)酵液中含有多種(至少4種)活性組分，且各活性組分各不相同，因此具有較好的抑菌活性和較寬的抑菌譜。用茚三酮顯色法也能較好的觀察到該發(fā)酵液的各不同組分，同時(shí)也說明了該抗菌活性物質(zhì)是蛋白類物質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)證明本實(shí)施方式制備的天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液在10～40℃環(huán)境中抑菌活性較穩(wěn)定，在60℃的環(huán)境中抑菌活性減弱。天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液在pH5～pH9的范圍內(nèi)，均具有抑菌活性。對(duì)辣椒炭疽病菌、水稻惡苗病菌、辣椒根腐病菌、黃瓜枯萎病菌、煙草赤星病原菌、小麥根腐病菌、小麥赤霉病菌、西瓜炭疽病菌、水稻惡苗病菌、立枯絲核病菌、大蔥紫斑病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌14種植物病原菌及大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌均有抑制作用。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液按以下步驟制備(一)將側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到斜面活化培養(yǎng)基上，在30℃的條件下活化培養(yǎng)24h；(二)按50mL液體種子培養(yǎng)基接種一滿環(huán)側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21的比例將經(jīng)過活化的側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到液體種子培養(yǎng)基，然后再在30℃、180r/min的條件下培養(yǎng)20～22h；(三)將液體種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基混合，液體種子培養(yǎng)液占混合液總體積的3.2％～3.8％，混合液在30℃、180r/min的條件下培養(yǎng)60～108h，即得到天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液；其中斜面活化培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基或葡萄糖蛋白胨固體培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基按蛋白胨4～5g、牛肉膏2～3g、氯化鈉4.5g和水1000mL的比例制成，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。
將本實(shí)施方式制備的天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液分成三組進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，第一組抗菌蛋白液不做任何處理，第二組抗菌蛋白液熱處理(加熱至80～100℃)，第三組抗菌蛋白液酶處理(加入蛋白酶)。抑菌試驗(yàn)結(jié)果如圖1和圖2所示，圖1辣椒根腐病菌和圖2辣椒炭疽病菌培養(yǎng)基上都只有第一組抗菌蛋白液1出現(xiàn)抑菌環(huán)，第2組抗菌蛋白液2和第2組抗菌蛋白液3未出現(xiàn)抑菌環(huán)，證明本實(shí)施方式制備的抗菌蛋白液對(duì)辣椒根腐病菌和辣椒炭疽病菌都具有抑菌作用，而且說明本實(shí)施方式制備的抗菌液中抑菌物質(zhì)為蛋白類。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是斜面活化培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基按蛋白胨5g、牛肉膏5g、氯化鈉2g、瓊脂15～18g和水1000mL的比例制成，斜面活化培養(yǎng)基的pH值為7.0。其它與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是斜面活化培養(yǎng)基為葡萄糖蛋白胨固體培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨固體培養(yǎng)基按蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO42g和水1000mL的比例制成，斜面活化培養(yǎng)基的pH值為7.0～7.2。其它與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基按蛋白胨5g、牛肉膏5g、氯化鈉2g和水1000mL的比例制成，牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的pH值為7.0。其它與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括可溶性淀粉、FeSO4、MgSO4中的一種或幾種，每1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基中加可溶性淀粉0.001～1g、FeSO40.001～0.02g和/或MgSO40.001～0.04g，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。其它與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括可溶性淀粉，每1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基中加可溶性淀粉0.001～1g，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。其它與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括FeSO4，每1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基中加FeSO40.001～0.02g，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。其它與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括MgSO4，每1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基中加MgSO40.001～0.04g，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。其它與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括可溶性淀粉和FeSO4，每1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基中加可溶性淀粉0.001～1g和FeSO40.001～0.02g，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。其它與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括可溶性淀粉和MgSO4，每1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基中加可溶性淀粉0.001～1g和MgSO40.001～0.04g，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。其它與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
十二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括FeSO4和MgSO4，每1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基中加FeSO40.001～0.02g和MgSO40.001～0.04g，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。其它與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括可溶性淀粉、FeSO4和MgSO4，每1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基中加可溶性淀粉0.001～1g、FeSO40.001～0.02g和MgSO40.001～0.04g，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。其它與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式
十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟(三)中將液體種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基混合，液體種子培養(yǎng)液占混合液總體積的3.3％～3.7％，混合液在30℃、180r/min的條件下培養(yǎng)72h。其它步驟與實(shí)施方式一相同。
權(quán)利要求
1.天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液的制備方法，其特征在于天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液按以下步驟制備(一)將側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到斜面活化培養(yǎng)基上，在30±2℃的條件下活化培養(yǎng)24±0.5h；(二)按50mL液體種子培養(yǎng)基接種一滿環(huán)側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21的比例將經(jīng)過活化的側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL-21接種到液體種子培養(yǎng)基，然后再在30±2℃、180r/min的條件下培養(yǎng)18～24h；(三)將液體種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基混合，液體種子培養(yǎng)液占混合液總體積的3％～4％，混合液在30±2℃、180r/min的條件下培養(yǎng)48～120h，即得到天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液；其中斜面活化培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基或葡萄糖蛋白胨固體培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基按蛋白胨3～6g、牛肉膏1～4g、氯化鈉4～5g和水1000mL的比例制成，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液的制備方法，其特征在于斜面活化培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基按蛋白胨5g、牛肉膏5g、氯化鈉2g、瓊脂15～18g和水1000mL的比例制成，斜面活化培養(yǎng)基的pH值為7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液的制備方法，其特征在于斜面活化培養(yǎng)基為葡萄糖蛋白胨固體培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨固體培養(yǎng)基按蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO42g和水1000mL的比例制成，斜面活化培養(yǎng)基的pH值為7.0～7.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液的制備方法，其特征在于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基按蛋白胨5g、牛肉膏5g、氯化鈉2g和水1000mL的比例制成，牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的pH值為7.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液的制備方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括可溶性淀粉、FeSO4、MgSO4中的一種或幾種，每1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基中加可溶性淀粉0.001～1g、FeSO40.001～0.02g和/或MgSO40.001～0.04g，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。
全文摘要
天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液的制備方法，它涉及一種蛋白液的制備方法。它解決了目前農(nóng)用抗生素對(duì)土傳病害防效顯著的種類極少，長期使用導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性和現(xiàn)有抗菌蛋白制品毒性大、抗菌譜窄的問題。天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液按以下步驟制備(一)將側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL－21接種到斜面活化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(二)將經(jīng)過活化的側(cè)孢芽孢桿菌菌株BL－21接種到液體種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(三)將液體種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基混合后培養(yǎng)，即得到天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液。本發(fā)明選用的菌株對(duì)環(huán)境和人體健康安全性高。本發(fā)明制備的天然多組分抗菌蛋白發(fā)酵液中含有多種抗菌蛋白，抑菌譜廣，對(duì)多種植物病原真菌、部分革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌都有抑制作用。
文檔編號(hào)A01P3/00GK1928109SQ200610010429
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2006年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月23日
發(fā)明者平文祥, 杜春梅, 葛菁萍, 王葳, 宋剛, 凌宏志 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)