專利名稱：：植物通過表達非哺乳動物糖基轉移酶而表現(xiàn)出哺乳動物類型的糖基化作用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及在轉基因植物中加工糖蛋白的領域，尤其涉及在用于生產重組生物藥劑學蛋白的植物中加工糖蛋白的領域。
背景技術：
：重組蛋白生產構成了轉基因植物的重要應用。除了重組蛋白的生產領域成本和產量是有利的，轉基因植物比其他生產系統(tǒng)，如細菌，酵母，和動物細胞具有一定的優(yōu)勢。事實上，它們對人無傳染性，并能在存儲組織，如種子或塊莖中積累目的蛋白質。這有利于在環(huán)境溫度下將其處理，運輸和儲存，而同時提供了隨后提取的可能性。此外，轉基因植物，或其某些部分，可以用來作為藥物或疫苗的載體。雖然植物的蛋白類物質工廠的優(yōu)勢主要是從生物制藥的角度解釋的，但植物也可用于生產其他蛋白質，例如，工業(yè)酶制劑等，因為它們的糖基化的能力，導致例如更高的穩(wěn)定性。目前，研究了利用植物生產用于治療和其他用途的異源蛋白，這些植物有大豆，煙草，馬鈴薯，水稻和油菜，以及其中生產的糖蛋白包括單克隆抗體，激素，疫苗的抗原，酶和血液蛋白。這些蛋白質有一些已經證明了它們在人體有效。在植物生產糖蛋白的缺點涉及到植物生產的糖蛋白的糖基化模式。像其他異源表達系統(tǒng)一樣，與哺乳動物相比，植物表現(xiàn)出不同的糖基化特征。與細菌(無N-連接的聚糖)和酵母(僅有高甘露糖型N-連接的聚糖)相比，植物能夠生產具有復雜類型的N相連的聚糖的蛋白質。然而，植物糖蛋白具有復雜的N-連接的聚糖，后者含有在哺乳動物未發(fā)現(xiàn)的131，2-木糖和a1，3-巖藻糖殘基。此外，植物糖蛋白缺乏在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的特征性的含半乳糖的復雜的N-聚糖。總之，植物的糖蛋白分析顯示，盡管存在著相似之處，植物和哺乳動物的糖基化途徑在幾個步驟是不同的，特別是在復雜的聚糖合成中。植物的復雜聚糖通常要小得多，并且包含P-l，2木糖或a-l，3巖藻糖殘基，連接至Man3(GlcNAc)2核心上。已知糖蛋白上這些殘基是免疫源性殘基，其導致帶有這些糖類的重組蛋白在某些應用中存在一些問題。
發(fā)明內容盡管已經提出了或正在使用一些以植物為基礎的生產糖蛋白的系統(tǒng)，但是需要改進了的以植物為基礎的系統(tǒng)用于人源化蛋白的生產。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供了這種改進了的以植物為基礎的系統(tǒng)。以前提出的以植物為基礎的系統(tǒng)，例如，W001/31045(全部內容納入本文)所述，利用哺乳動物P1，4-半乳糖轉移酶用于人源化蛋白的生產。現(xiàn)在已經發(fā)現(xiàn)，某些以前沒有鑒定的糖基轉移酶，如那些來自非哺乳動物，雞和斑馬魚的糖基轉移酶，顯示出與已經鑒定的哺乳動物的Pl，4-半乳糖轉移酶的某些部分同源，這表明在人源化蛋白的生產方面相對于以前的方法有意料不到的改進。10根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供的生產能將半乳糖殘基以P-l，4-鍵加入到N-連接的聚糖中的轉基因植物或轉基因植物細胞的方法。這些方法包括將編碼非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的核酸分子插入植物或植物細胞中，并選擇攝入編碼非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的核酸分子和表達這種核酸分子的轉基因植物或轉基因植物細胞，從而產生出能將13_1，4鍵上的半乳糖殘基加入N-連接的聚糖中的轉基因植物或轉基因植物細胞。在某些具體實施方式中，非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶包含雞或斑馬魚的P-l，4-半乳糖轉移酶l。在某些具體實施方式中，雞P-1，4-半乳糖轉移酶1包含SEQIDN0:2，而斑馬魚的P-1，4-半乳糖轉移酶1包含SEQIDN0:14。在某些具體實施方式中，雞或斑馬魚的非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶可增加能指導非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶在高爾基體內定位的氨基酸序列。在某些具體實施方式中，非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶可在N-末端增加對應于哺乳動物13-1，4-半乳糖轉移酶1的N-末端氨基酸序列的氨基酸序列。在某些具體實施方式中，N-末端氨基酸序列在前10個N-末端氨基酸中至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中[K/R]代表賴氨酸或精氨酸殘基，并且X能是任何氨基酸。在某些具體實施方式中，N-末端氨基酸序列是MRLREPLLSGSAA(SEQIDNO:21)。在某些具體實施方式中，非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的胞漿-跨膜-莖區(qū)(CTS)被另一種定位在高爾基體的蛋白的CTS替代。在某些具體實施方式中，CTS來源于哺乳動物或植物的定位在高爾基體的蛋白。在某些具體實施方式中，CTS來源于哺乳動物唾液酸轉移酶。在某些具體實施方式中，CTS來源于大鼠a2，6-唾液酸轉移酶。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供生產包含一種或多種半乳糖基化N-連接聚糖的異源性糖蛋白的方法，所述方法包含將編碼非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的核酸分子和編碼異源性糖蛋白的核酸分子插入植物或植物細胞中，從而產生轉基因植物或轉基因植物細胞，并且在適于該核酸分子表達的條件下維持轉基因植物或轉基因植物細胞，藉此產生包含一種或多種半乳糖基化的N-連接的聚糖的異源性糖蛋白。在某些具體實施方式中，非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶是雞P-l，4-半乳糖轉移酶或斑馬魚P-1，4-半乳糖轉移酶。在某些具體實施方式中，雞13-1，4-半乳糖轉移酶或斑馬魚P-l，4-半乳糖轉移酶可在N-末端增加對應于哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶l的N-末端氨基酸序列。在某些具體實施方式中，雞P-l，4-半乳糖轉移酶或斑馬魚13-1，4_半乳糖轉移酶的CTS被另一種定位于高爾基體的蛋白的CTS取代。在某些具體實施方式中，方法進一步包含將異源性糖蛋白從轉基因植物或轉基因植物細胞中至少部分地分離出來。在某些具體實施方式中，糖蛋白在一個或多個N-聚糖上包含一個或多個半乳糖殘基。在某些具體實施方式中，糖蛋白的N-聚糖基本上不含木糖或巖藻糖殘基或這兩個殘基都不含。在某些具體實施方式中，編碼異源性糖蛋白的核酸分子編碼激素；細胞因子、疫苗；粘附分子或抗體或其功能片段。在某些具體實施方式中，植物或植物細胞此外還包含編碼至少一種在植物或植物細胞中表達的選擇標記的核酸分子。在某些具體實施方式中，植物或植物細胞是或來源于煙草屬的物種(Nicotianassp.)。在某些具體實施方式中，核酸分子經顯微注射法，PEG轉化法、土壤桿菌屬介導的轉化法，電穿孔法，基因槍法、直接基因轉移法、脂質體融合、植物活體轉化法(inplantatransformation)、磷酸鈣沉淀法、農桿菌浸潤法(agro-filtration)或病毒傳染法插入。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供生產能將半乳糖殘基以P-l，4-鍵加入到N-連接的聚糖的轉基因植物或轉基因植物細胞的方法，其中編碼非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的核酸與雞Pl，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDN0:1)或斑馬魚的PI,4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDNO:13)至少具有85%的同一性。在另一具體實施方式中，該核酸與雞P1，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDN0:1)或斑馬魚的Pl，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDNO:13)至少具有90%，95%或98%的同一性。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供生產能將半乳糖殘基以P-l，4-鍵加入到N-連接的聚糖的轉基因植物或轉基因植物細胞的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)或斑馬魚的131，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)至少具有85%的同一性。在另一具體實施方式中，非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)或斑馬魚的Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)至少具有90%，95%或98%的同一性。在某些具體實施方式中，非哺乳動物P_1，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列此外還包含哺乳動物延長序列。在某些具體實施方式中，哺乳動物延長序列是MRLREPLLSGSAA(SEQIDNO:21)。在某些具體實施方式中，非哺乳動物P_1，4-半乳糖轉移酶的CTS被來自另一定位于高爾基體蛋白的CTS取代，并且其中非哺乳動物13-1，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞131，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)或斑馬魚的P1，4_半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDN0:14)有至少85%的同一性。在其他具體實施方式中，非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶酶活性結構域的氨基酸序列與雞Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)或斑馬魚的131，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDN0:14)有至少90%，95%或98%的同一性。在某些具體實施方式中，來自另一定位于高爾基體的蛋白的CTS是來自大鼠a2，6-唾液酸轉移酶的CTS。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供生產能將半乳糖殘基以P-l，4-鍵加入到N-連接的聚糖的轉基因植物或轉基因植物細胞的方法，其中植物或植物細胞產生一種糖蛋白，其包含既無Pl，2-木糖殘基也無al，3-巖藻糖殘基的雜交類型的N-連接的聚糖。在某些具體實施方式中，產生的既無Pl，2-木糖殘基也無al，3-巖藻糖殘基的雜交類型的N-連接的聚糖的數(shù)量是表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物或植物細胞的產生的量的兩倍。在另一具體實施方式中，產生的既無Pl，2-木糖殘基也無al，3-巖藻糖殘基的雜交類型的N-連接的聚糖的數(shù)量是表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物或植物細胞的產生的量的五倍，十倍或五十倍。在某些具體實施方式中，植物或植物細胞產生包含雙觸角的N-聚糖的糖蛋白，其中該N-聚糖包含至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基。在這些具體實施方式中，產生的包含至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角的N-聚糖的數(shù)量是表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物或植物細胞的產生的量的兩倍，五倍，十倍或五十倍。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本文所述的方法產生的糖蛋白。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本文所述的方法產生的植物或這種植物的部分。在某些具體實施方式中植物是選自種子、胚胎、愈傷組織、葉、根、芽、花粉或小孢子的植物部分。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本文所述的方法產生的植物細胞。在某些具體實施方式中，植物細胞懸浮培養(yǎng)方式生長。在某些具體實施方式中，懸浮培養(yǎng)的植物細胞選自煙草BY2、胡蘿卜或擬南芥細胞懸液。在某些具體實施方式中，植物細胞是選自苔蘚植物(Bryophytaea)、小立碗蘚(Physcomitrellapatens)、葫戸蘚(F皿ariahygrometrica)或角齒蘚(Ceratodonpurpureus)的苔蘚的部分。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供編碼多肽的核酸，所述的多肽含有雞PI,4_半乳糖轉移酶1(SEQIDNO:2)或斑馬魚的P1，4-半乳糖轉移酶1(SEQIDNO:14)及其N-末端延長的氨基酸序列，其中延長的氨基酸序列是對應于哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶1的N-末端氨基酸序列的氨基酸序列，其中N-末端氨基酸序列在前10個N-末端氨基酸中至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中[K/R]代表賴氨酸或精氨酸殘基，并且X能是任何氨基酸。在某些具體實施方式中，氨基酸序列是MRLREPLLSGSAA(SEQIDNO:21)。在某些具體實施方式中，氨基酸序列包含SEQIDN0:8或SEQIDNO:15。在某些具體實施方式中，編碼包含雞P-l，4-半乳糖轉移酶l(SEQIDNO:2)或斑馬魚P_1，4-半乳糖轉移酶l(SEQIDNO:14)的多肽的核酸，其中雞P-l，4-半乳糖轉移酶或斑馬魚|3_1，4-半乳糖轉移酶的CTS被另一定位于高爾基體的蛋白的CTS取代。在某些具體實施方式中，CTS來源于哺乳動物或植物的定位于高爾基體的蛋白。在某些具體實施方式中，CTS來源于哺乳動物的唾液酸轉移酶。在某些具體實施方式中，CTS來源于大鼠a2，6-唾液酸轉移酶。在某些具體實施方式中，氨基酸序列包含SEQIDN0:11或SEQIDNO:18。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供編碼多肽的核酸，所述的多肽包含非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞P-1，4-半乳糖轉移酶1(SEQIDN0:2)或斑馬魚P-l，4-半乳糖轉移酶l(SEQIDNO:14)的酶活性結構域的氨基酸序列同一性至少是90X，以及其N末端延長序列，其中該延長序列的氨基酸序列對應于哺乳動物P1，4-半乳糖轉移酶1的N-末端氨基酸序列，其中N-末端氨基酸序列在其前10個N-末端氨基酸上至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中[K/R]代表賴氨酸或精氨酸殘基，并且X能是任何氨基酸。在另一具體實施方式中，該序列的同一性至少是95%或98%。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供包含本文所述的核酸分子的表達載體。在某些具體實施方式中，核酸分子連接至對于核酸分子在真核或原核細胞內轉錄是足夠的調節(jié)元件上。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供宿主細胞，所述宿主細胞包含本文所述的連接至對于在植物細胞中轉錄是足夠的異源性調節(jié)元件上的核酸分子或包含本文所述的載體。圖l描述各種哺乳動物(人，小鼠，牛)和非哺乳動物(雞，斑馬魚，蛙)起源的P1，4-半乳糖轉移酶的序列比對(ClustalW)。"哺乳動物延長序列"是哺乳動物特異性的氨基末端區(qū)域，在非哺乳動物的131，4-半乳糖轉移酶的直系同源物上未發(fā)現(xiàn)該區(qū)(實線方框)。"TM"標記跨膜區(qū)(虛線方框)。圖2描述從表達雞的基因的轉基因植物中純化的N-聚糖的Maidi-TOF分析結果。從頂端至底端，正常雞的基因(雞GalT)，13氨基酸N-末端人GalT-雞GalT，和SialT-CTS-雞GalT。圖3描述從表達斑馬魚GalT基因的轉基因植物中純化的N_聚糖的Maldi-T0F分析結果。從頂端至底端，正常斑馬魚的基因(斑馬魚GalT，2種植物)，13氨基酸N-末端人GalT-斑馬魚GalT，和SialT-CTS-斑馬魚GalT。圖4描述匯總了來自人，斑馬魚和雞GalT的結果的柱形圖，關于雙觸角的"野生型"植物N-聚糖(GlcNAc2-Man3-Xyl-Fuc-GlcNAc2-Asn)，帶有一個半乳糖(并不含木糖和巖藻糖)雜交類型的N-聚糖，和帶有兩個半乳糖的雙觸角N-聚糖(從頂端至底端)。圖5描述Dgal(SEQDgal，SEQIDNO:14)與推定的斑馬魚P1，4-GalTl(發(fā)表于文獻Machingoetal.，DevBiol297，471-82，2006;NM_001017730)之間的氨基酸序列比較。具體實施例方式高爾基體是復雜的聚糖構型發(fā)生的場所的細胞器和糖基化機械裝置的位點。糖基化的關鍵介質是糖基轉移酶。最佳的研究高爾基體相關的糖基轉移酶之一是Pl，4-半乳糖轉移酶l(GalT)。Pl，4-半乳糖轉移酶1由細胞漿中的尾部，跨膜結構域(TMD)和催化結構域構成。已經克隆多種哺乳動物糖基轉移酶基因。轉化植物系統(tǒng)的便宜性使得研究者能夠將來自哺乳動物的糖基轉移酶"補充"到植物的高爾基體中以將其產生的聚糖或糖蛋白進行"人源化"或"哺乳動物源化"。迄今為止，尚未報道非哺乳動物131，4_半乳糖轉移酶(GalT)用于在植物中生產哺乳動物源化或人源化的糖蛋白的用途。已經發(fā)現(xiàn)，某些以前未鑒定的非哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶，如來自雞和斑馬魚的131，4-半乳糖轉移酶，能用于在植物中進行N-連接的糖蛋白的末端半乳糖基化作用，并且這些非哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶相對于以前的生產人源化蛋白的方法顯示出出乎意料的改進。例如，雞P1，4-半乳糖轉移酶產生大多數(shù)不含131，2-木糖和a1，3-巖藻糖殘基的雜交型N-連接的聚糖。進一步發(fā)現(xiàn)，來自雞和斑馬魚的非哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶比哺乳動物P1，4-半乳糖轉移酶短，并不含在哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶中含有的氨基末端區(qū)。這些非哺乳動物P1，4-半乳糖轉移酶能在其氨基末端延長一段與哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶的氨基末端相對應的氨基酸序列，"哺乳動物延長序列"。這些修飾版本的非哺乳動物Pl，4-半乳糖轉移酶產生某些N-連接聚糖達到比人Pl，4-半乳糖轉移酶高的程度。例如，其氨基酸末端被大鼠的唾液酸轉移酶的CTS區(qū)替換的斑馬魚GalT主要產生雙觸角，雙半乳糖基化的N-聚糖。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供用于在植物中產生哺乳動物化的糖蛋白的未修飾的或修飾的來自雞或魚的非哺乳動物GalT。某些具體實施方式還提供了在表達這種非哺乳動物P1，4-半乳糖轉移酶的植物或植物細胞中產生的哺乳動物化的糖蛋白。"定義"本文所使用的術語"核酸"是指脫氧核糖核酸或核糖核酸多聚體，即單鏈或雙鏈形式的多聚核苷酸，和除非另外限制，包含已知的類似物，在其與單鏈核酸以與天然存在的核酸(例如肽核酸)相似的方式雜交方面具有天然核苷酸的主要性質。多聚核苷酸能是天然的或異源的結構性或調節(jié)性基因的全長或子序列。除非另外限制，該術語是指特定序列以及與其互補的序列。因此，為了使其穩(wěn)定或其它原因修飾其骨架的DNA或RNA是該術語所指的"多聚核苷酸"。此外，包含罕見的堿基(如肌苷)或修飾堿基(如三苯甲基化的堿基)(僅是兩個例子)的DNA或RNA是該術語所指的"多聚核苷酸"。應理解，已經對DNA和RNA進行很多種修飾，這些修飾服務于對本領域技術人員已知的許多有用的目的。正如在本文所用的術語"多聚核苷酸"包含這種化學的，酶的或代謝修飾的多聚核苷酸的形式，以及具有病毒或細胞(包括其它物種中的簡單和復雜細胞的)的特征的DNA和RNA的化學形式。本文所用的"為……編碼的核酸分子"或"編碼……的核酸分子"并不限于個體或各個分子，例如作為各個實體的核酸分子，其中每個實體包含一種核酸分子，還包括一種或多種核酸分子可連接至一種連續(xù)的序列中，可被任何插入序列分開。在一種連續(xù)序列中的核酸分子的順序和方向不限于任何特定構型，例如該核酸分子可連接至同一啟動子或不同啟動子上，可是單向或雙向的，并可是直接相連或被插入序列分隔。本領域已知各種這種構型。此外，核酸分子可合并在一條連續(xù)的序列中，或可以各個實體提供。例如，在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供包含核酸分子的植物或植物細胞，所述核酸分子包含非哺乳動物13-1，4-半乳糖轉移酶，異源性糖蛋白和一種或多種選擇標記。這些核酸分子可以本文所述的一種，兩種，三種，或多種載體的形式提供。術語"多肽"，"肽"和"蛋白"本文可互換使用，是指氨基酸殘基的多聚體。這些術語應用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應的天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸多聚體人工化學類似物的氨基酸多聚體。這些天然存在的氨基酸多聚體的類似物的主要特性是，當摻入蛋白中時，該蛋白是特定響應于同一蛋白誘導產生的抗體，但是其完全由天然存在的氨基酸構成。術語"多肽"，"肽"和"蛋白"還包括修飾形式的"多肽"，"肽"和"蛋白"，其包括但不限于糖基化、連接脂質、硫酸化、谷氨酸殘基的Y-羧化、羥基化和ADP核糖基化。"編碼"或"為……編碼"的序列是部分編碼蛋白的氨基酸序列的基因或編碼功能性RNA(如tRNA或rRNA)的基因和特定指核酸序列包含翻譯成特定蛋白的信息這一事實。編碼蛋白的核酸可在核酸的翻譯區(qū)內包含非翻譯序列(例如內含子)，或可不含這種插入性非翻譯序列(例如在cDNA內)。蛋白編碼的信息通過使用密碼子限定。通常，使用"通用"遺傳密碼子的核酸編碼氨基酸序列。然而，通用密碼子的變體，如在某些植物、動物和真菌線粒體，細菌山羊支原體(Mycoplasmac即ricolum)或纖毛蟲大核(theciliateMacro皿cleus)中出現(xiàn)的變體可用于當核酸在其中表達時。當用合成方法制備或改變核酸時，采用在欲將核酸在其中表達的目的宿主中存在的已知密碼子能是有優(yōu)勢的。例如，雖然本發(fā)明的核酸序列既可在單子葉植物物種中表達也可在雙子葉植物物種中表達，但是序列能被修飾以產生特定密碼子參數(shù)，并且單子葉植物或雙子葉植物中的GC含量的參數(shù)如這些參數(shù)已經顯示有區(qū)別。"表達"是指基因轉錄成結構性RNA(rRNA，tRNA)或隨后翻譯成蛋白的信使RNA(mRNA)。涉及蛋白或核酸的術語"非哺乳動物的"是指來源于非哺乳動物，包括例如非哺乳脊椎動物，如鳥類(例如雞或鴨)或魚，和非哺乳無脊椎動物的這種化合物。非哺乳動物15P-l，4-半乳糖轉移酶(和編碼序列)的非常合適的來源是雞和魚。涉及蛋白或核酸的術語"哺乳動物的"是指來源于哺乳動物，例如人，非人的靈長類動物，小鼠，豬，牛，山羊，貓，家兔，大鼠，豚鼠，倉鼠，馬，猴，綿羊，小袋鼠，鴨嘴獸或其他非人類的哺乳動物的這種化合物。術語"P-1，4-半乳糖轉移酶"是指糖基轉移酶EC2.4.1.38(P-l，4-GalTl)，其對于自2型鏈(Gal131—4GlcNAc)的骨架結構的生物合成是必需的，2型鏈(Gal131—4GlcNAc)的骨架結構似乎廣泛出現(xiàn)在N_連接聚糖上，即該酶對于固有活性(i.a)的N-連接聚糖具有半乳糖基化活性。該2型鏈在合成分別在免疫系統(tǒng)和早期胚胎發(fā)生中發(fā)揮作用的唾液酸化的路易斯抗原(sialyllewisx)和SSEA-1中尤其重要。本發(fā)明提供哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶(例如來自人，小鼠，大鼠)以及來自非哺乳動物物種如雞和魚的P-l，4-半乳糖轉移酶的直系同源物。本文所使用的術語"序列同一性"表示在兩條或多條多聚核苷酸之間或在兩條或多條多肽之間存在同一性。當與另一條多聚核苷酸或多肽進行最大相關性的比對時，如果一條多聚核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列是相同的，那么多聚核苷酸或多肽具有"同一性"序列。兩條或多條多聚核苷酸或多肽之間的序列比較通常通過在比較窗口比較兩條序列的部分進行，以鑒定和比較序列的局部區(qū)域的相似性。比較窗口通常是自大約20至200的連續(xù)核苷酸或是自大約7至70的連續(xù)氨基酸。對于多聚核苷酸或多肽的"序列同一性百分數(shù)"，如50，60，70，80，90，95，98，99或100百分數(shù)的序列同一性可通過將兩條最佳比對系列經比較窗口進行比較而確定，其中在比較窗口中的多聚核苷酸或多肽序列部分可包括當與參考序列比較時的添加或缺失(即縫隙)，而用于兩條序列的最佳比對的參考序列不包括添加或缺失。通過下列計算該百分數(shù)(a)確定相同的核酸堿基或氨基酸殘基在兩條序列中都出現(xiàn)的位置的數(shù)目已產生出匹配位置數(shù)目；(b)將匹配位置數(shù)被比較窗口中的位置的總數(shù)除沮(c)結果乘以100以產生同源性序列百分數(shù)。進行比較的最佳比對可通過已知算法的計算機化的工具或通過檢查進行。在比對進行比較的序列和計算序列同源性或同一性中適合使用的算法和軟件對于本領域技術人員是已知的。這種工具的顯著的例子是基于皮爾森和利波曼查找的FASTA和BLAST程序，這些程序詳見文獻(Altschuletal(1997)，NucleicAcidRes.25:3389-3402;Altschuletal(1990)，J.Mol.Biol.215:403-10;PearsonandLipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-8;LipmanandPearson(1985)，Science227:1435-41))。其它合適的程序包括PILEUP，LINEUP,GAP,BESTFIT和FASTA程序(威斯康辛軟件包GCG⑧中)(theUniversityofWisconsinGeneticsComputerG麗p，Madison，WI，USA)現(xiàn)在由AccelrysInc.提供。在互聯(lián)網上通過htt。〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BUVST或鏡像站點禾口htt。〃www.accelrys.com/products/gcgWisconsinpackage.可得到上述程序的細節(jié)。因此，這種同源性或同一性能使用公共或商業(yè)上可得到的軟件包或通過互聯(lián)網上的計算機服務器來確定。術語"同一性"是指，雖然事實是該系列可在需要將縫隙導入的位置含有缺失或添加以獲得最高的氨基酸或堿基百分數(shù)，然而當序列進行最佳比對時，在參考序列的同一相對位置上發(fā)現(xiàn)的所主張的氨基酸序列或核酸系列的起始百分數(shù)。優(yōu)選地，通過使用IO或更少的縫隙進行比對，即導入兩個序列中的縫隙的總數(shù)當加在一起時是10或更少。這種縫隙的長度不是特別重要，但是通常不超過10個氨基酸(優(yōu)選不超過5個氨基酸)或30個堿基(優(yōu)選不超過15個堿基)。術語"遺傳密碼子的簡并性"是指大量功能相同的核酸編碼任何特定蛋白這一事實。例如，密碼子GCA，GCC，GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每一個以密碼子說明丙氨酸的位置，該密碼子能變成描述的相應的密碼子而未改變所編碼的多肽。這種核酸變異是"沉默變異"。通過引用遺傳密碼子，在此處的編碼多肽的每一核酸序列也描述該核酸的每一可能的沉默變異。在"互補鏈"中的術語"互補的"是指核酸鏈有一段核酸序列，該與核酸序列與另一核苷酸序列根據(jù)Watson-Crick堿基互補配對原則通過形成氫鍵而形成雙鏈。例如，5'-AAGGCT-3'的互補堿基序列是3'-TTCCGA-5'。術語"半乳糖基化N-連接的聚糖"是指糖蛋白中的N-連接寡糖單位的通用核心，所述的糖蛋白由殼二糖核心和至少3個甘露糖和至少1個N-乙酰葡糖胺殘基組成，并進一步在其非還原末端上延伸出至少一個N-乙酰葡糖胺上的半乳糖殘基。術語"抗體"包括對抗體(例如Fab，F(xiàn)(ab)2)的抗原結合形式的引用。術語"抗體"經常是指實質上由免疫球蛋白基因或特異性結合并識別被分析物(抗原)免疫球蛋白或其片段編碼的多肽。然而，當各種抗體片段能被一種完整抗體的消化的術語來限定時，本領域技術人員應理解這種片段可化學性地或通過使用重組DNA技術進行重新合成。因此，術語抗體，如在本文所用，也包括抗體片段，如單鏈Fv，嵌合抗體(即包含不同物種的恒定區(qū)和可變區(qū))，人源化抗體(即包含非人來源的互補性決定區(qū)(CDR))和異源偶聯(lián)(heteroconjugate)抗體(例如雙特異性抗體)。術語"抗體重鏈或輕鏈"使用其本領域公認的含義。術語"功能片段"是指蛋白的截短了的版本，其是該蛋白的功能性變體或功能性衍生物。蛋白的"功能性變體"或"功能性衍生物"是蛋白的氨基酸序列，其來源于通過將原始蛋白的氨基酸序列進行取代，缺失和/或添加一個或多個氨基酸殘基而得到的蛋白的氨基酸序列，以這種方式，盡管氨基酸序列發(fā)生了變化，但是功能性變體保留了原始蛋白的至少一種生物活性的至少部分活性，該活性對于本領域技術人員來說是可檢測的。功能性變體通常與其能衍生它的蛋白之間的同源性是至少50%同源(優(yōu)選氨基酸序列至少50%相同)，至少70%同源或至少90%同源。功能性變體也可是蛋白的任何功能部分。在某些具體實施方式中，該功能是半乳糖轉移酶活性。在某些具體實施方式中，區(qū)別于SEQIDNO:2(雞半乳糖轉移酶的蛋白序列)或SEQIDN0:14(斑馬魚半乳糖轉移酶的蛋白序列)的氨基酸序列主要或僅通過保守性取代產生。在某些具體實施方式中，該蛋白包含與SEQIDN0:2或SEQIDNO:14具有65%或更高，75%或更高，85%或更高，90%或更高或95%或更高的序列同一性的氨基酸序列，且在某些具體實施方式中，與這些序列具有100%同一性。本文所用的"功能性的"還包括植物中的功能性。所使用的術語"保守性取代"當用于氨基酸時涉及特定氨基酸被具有相似的生物化學特征的氨基酸取代。因此，在某些具體實施方式中，序列SEQIDN0:2或SEQIDNO:14中的氨基酸具有疏水基團時，保守性取代是其被另一也具有疏水基團的氨基酸取代；其它這種生物化學相似性的氨基酸是那些其特征性基團是疏水、陽離子或陰離子的氨基酸或含有硫醇或硫醚的氨基酸。本領域技術人員已熟知這種取代(即見于美國專利No.5，380，712)。保守性氨基酸取代可在，例如在脂肪族非極性氨基酸組內(Gly，Ala，Pro，Ile，Leu，Val)，極性不帶電氨基酸組內(Cys，Ser，Thr，Met,Asn，Gin)，極性不帶電氨基酸組內(Asp，Glu，Lys，Arg)或芳香族氨基酸組內(His，Phe，Tyr，Trp)進行。術語"選擇標記"是指編碼用于分離轉基因和非轉基因組織的代謝特征的多聚核苷酸序列，并可指提供抗生素抗性。選擇標記例如是編碼卡那霉素抗性標記的aphLl，nptl1基因，編碼潮霉素抗性的基因。其它抗性標記為本領域所熟知。其它選擇標記是，例如報告基因，如氯霉素乙酰基轉移酶，13-半乳糖苷酶，熒光素酶和綠色熒光蛋白。報告基因產物的鑒定方法包括但不限于酶學檢測或熒光檢測。報告基因和測定器產物的檢測被本領域所熟知并見于(例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,eds.Ausubeletal.，GreenePublishingandWiley-Interscience:NewYork(1987)及其定期更新資料)所述。如本文所用，術語"載體"包括引用在轉染宿主細胞中使用的核酸和能被插入多聚核苷酸的核酸。載體經常復制。表達載體可使插入其中的核酸轉錄。如本文所用，術語"可通過操作連接"是指功能性連接或排列，其中所描述成分之間的關系使得它們以其預期的方式發(fā)揮功能。"可通過操作連接"至另一對照序列中和/或連接至編碼序列中的對照序列以該編碼序列在適合于對照序列的條件下達到轉錄或表達的這樣的方式被連接起來。通常，可通過操作連接意味著被連接的核酸序列是連續(xù)的，當有必要連接兩個蛋白編碼區(qū)之間時是連續(xù)的并且位于同一讀碼框內。術語"宿主細胞"是指含有載體并支持載體的復制和/或表達的細胞。宿主細胞可是原核細胞如E.coli，或真核細胞如植物，酵母，昆蟲，兩棲動物或哺乳動物細胞。如本文所使用"異源性"當引用核酸時是指來源于異源物種的核酸，或者如果是來自同一物種，是指其原始形式在成分和/或基因座通過插入修飾的核酸。例如，可通過操作連接至異源性結構基因上啟動子是來源于與結構基因所來源的物種不同的物種，或者，如果來源于同一物種，其中一個或兩個經自它們的原始來源形式修飾。異源蛋白可來源于外來物種或如果來源于同一物種，通過插入將其自欺原始形式進行修飾。本文限定的術語"調節(jié)序列"或"控制序列"包括任何對于編碼序列的表達是必要的或有利的成分。調節(jié)序列可是編碼序列本身或外來的。這種調節(jié)序列包括但不限于引導序列(leader)，多腺苷酸化序列，前肽序列，啟動子，信號序列和轉錄終止子。這種序列為本領域所熟知。最少，調節(jié)序列包括啟動子或某些啟動子元件和轉錄和翻譯終止信號。調節(jié)序列可與為了將特定限制性位點導入的連接子一起提供，以簡化調節(jié)序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)的連接。本文所使用的術語"啟動子"是其本領域公認的含義，是指含有DNA序列的基因的一部分，該部分供RNA聚合酶結合和轉錄起始之用。通常但不總是發(fā)現(xiàn)啟動子序列位于基因的5'非編碼區(qū)。"植物啟動子"是能在植物細胞中起始轉錄的啟動子而不管其是否來源于植物細胞。示例性的植物啟動子包括但不限于那些自植物，植物病毒和包含在植物細胞中表達的基因的細菌(土壤桿菌屬或根瘤菌屬)中獲得的啟動子。合適的啟動子的例子是花椰菜花葉病毒的35S啟動子及其衍生物，鐵氧化還原蛋白啟動子，膽脂堿合酶(nos)，甘露堿合成酶(mas)和章魚肉堿合酶(ocs)啟動子(EP0122791，EP0126546，EP0145338)，泛素啟動子(EP0342926)，木薯脈花葉病毒啟動子和二磷酸核酮糖氧合酶/羧化酶(Rubisco)的短的亞基額菊花啟動子。術語"轉基因植物或植物細胞"包括對基因組內包含異源多聚核苷酸的植物或植18物細胞的引用。通常，異源多聚核苷酸穩(wěn)定整合進基因組中，以至于多聚核苷酸能傳遞至下一代。異源多聚核苷酸可單獨或作為部分重組表達盒整合進入基因組中。而且，有可能是異源多聚核苷酸不整合或不穩(wěn)定整合進入被轉化植物的基因組中。在這種情況下，該基因能瞬時表達，意味著表達一段特定時間，之后被導入的多聚核苷酸從細胞中丟失。為了本發(fā)明的目的，轉基因植物或植物細胞還包括瞬時表達異源多肽的植物或植物細胞。本文所用的"轉基因"包括任何基因型因存在異源核酸而改變的細胞，細胞系，愈傷組織，組織，植物部分或植物，包括那些起始就已改變的轉基因以及起始轉基因通過兩性雜交或無性繁殖創(chuàng)造出來的轉基因。本文所使用的術語"轉基因"不包含(染色體基因組或染色體外基因組)通過常規(guī)植物育種方法或通過天然存在的事件如隨機異體受精，非重組病毒感染，非重組細菌轉化，非重組轉座或自發(fā)性突變而使基因組發(fā)生的改變。在將核酸導入細胞中的上下文中的術語"插入"意味著"轉染"或"轉化"或"轉導"并包括引用使核酸摻入真核或原核細胞中，核酸在這些真核或原核細胞中可摻入細胞的基因組(例如染色體，質粒，質體或線粒體DNA)中，轉化為自主復制或瞬時表達(例如轉染的mRNA)。如本文所使用，術語"植物"包括(引用)整個植物，植物器官(例如葉，莖，根等)，種子和植物細胞以及上述的子代。植物細胞，如本文所使用，包括但不限于種子，胚胎，分生組織區(qū)，愈傷組織，葉，根，芽，配子體，孢子體，花粉和小孢子。在某些具體實施方式中，植物細胞以懸浮培養(yǎng)方式生長。在某些具體實施方式中，植物細胞能夠再生出整個植物。能在本發(fā)明所述的方法中使用的植物的類型通常很廣泛，以至于能接受轉化技術的高等植物都能使用，包括單子葉植物和雙子葉植物。本文中所使用，當指植物時，除非另有說明，是指從藻類到樹的范圍的整個植物譜。優(yōu)選的植物是煙草屬的物種(Nicotianassp.)，優(yōu)選普通煙草(N.tabacum)或本塞姆氏煙草(N.benthamiana)。術語"特異性識別"包括引用抗體和具有被抗體的抗原結合位點識別的表位的蛋白之間的結合反應。這種結合反應由具有被識別的表位的蛋白決定，所述的表位是蛋白或其它生物分子的異質性群體之中存在的表位之一。因此，在特定的免疫檢測條件下，特定的抗體與具有被識別的表位的被檢測物的結合，實質上比與缺乏樣本中存在的表位的所有被檢測物的結合實質上達到更大的程度(例如至少是背景的2倍)。在這種條件下與抗體的特異性結合可需要選擇對特定蛋白是特異性的抗體，例如，能選擇抗本文所述的多肽(例如SEQIDNOS.2，4，7，9，11，14，16，18和20)的抗體以獲得特異性識別這些多肽的抗體。用作免疫原的蛋白或多肽能是天然形式或將其變性以產生線性表位。可使用各種免疫檢測方法來選擇特異性識別特定蛋白(或其它被檢測物)的抗體。例如，常規(guī)使用固相ELISA免疫檢測來選擇與蛋白發(fā)生特異性免疫反應的單克隆抗體。文獻描述了能用于確定選擇性反應性的免疫檢測方法禾口條件(見于HarlowandLane，Antibodies,ALaboratoryMa麗l，ColdSpringHarborPublications,NewYork(1988))。核酸分子和細胞表達系統(tǒng)盡管編碼本發(fā)明所述的多肽的核酸分子能在任何細胞表達系統(tǒng)(如植物，酵母，細菌，非哺乳動物和哺乳動物細胞表達系統(tǒng))中表達，該核酸分子優(yōu)選在可懸浮生長的植物或植物細胞中表達。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供包含能生物合成N-聚糖的功能蛋白的植物或植物細胞，其中該蛋白是非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶，例如是雞或魚起源。在其他具體實施方式中，所述的非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的N-末端延伸出N-末端延伸序列，該序列使其易于定位于高爾基體，以能夠使該酶具有預期的功能。N-末端延伸序列通常構成包含高爾基體_定位信號序列和跨膜結構域的胞漿中的尾部。這種N-末端序列(命名為"CTS")能來源于哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶，哺乳動物唾液酸轉移酶或任何其它定位于高爾基體的蛋白，并與非哺乳動物GalT(例如雞或魚起源)的胞漿結構域融合，并在植物細胞或植物中表達。糖基轉移酶的N-末端胞漿區(qū)，跨膜區(qū)(本文"CTS區(qū)")決定該酶在ER或高爾基體膜上定位。為了產生天然或所需的糖基化，糖基轉移酶能在植物細胞中表達因其出現(xiàn)在哺乳細胞中，但是也能作為兩種不同的糖基轉移酶或兩種不同的糖基轉移酶的部分之間的融合蛋白表達。在這種情況下，定位由一種酶決定，催化活性由第二種決定。作為例子的是，大鼠唾液酸轉移酶的胞漿區(qū)，跨膜區(qū)和莖區(qū)與哺乳動物半乳糖轉移酶的催化結構域之間形成的融合蛋白，如例如在SEQIDN0:10和SEQIDNO:17之間產生的融合蛋白，產生具有半乳糖轉移酶活性和唾液酸轉移酶的定位功能的酶。哺乳動物GalT酶的有用的N-末端延伸序列經鑒定，其長約10_20氨基酸，并在其胞漿尾序列的前IO個氨基末端的氨基酸上含有[K/R]-X-[K/R]基序(其中K/R意味著賴氨酸或精氨酸殘基，并且X能是任何氨基酸)。在某些具體實施方式中，N-末端氨基酸序列延伸序列包含人13-1，4-半乳糖轉移酶多月太1序列前13個氨基酸殘基，即MRLREPLLSGSAA(SEQIDNO:21)(見圖1)。在其他具體實施方式中，非哺乳動物GalT的CTS被置換為來自另一種定位于高爾基體的蛋白的CTS;置換能例如來源于大鼠a2，6_唾液酸轉移酶的CTS(GenbankaccessionM18769)。在某些具體實施方式中，植物細胞或植物表達功能性非哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶，該酶與雞P1，4-半乳糖轉移酶核酸序列(SEQIDN0:1)至少具有85%的同一性。在其他具體實施方式中，功能性非哺乳動物Pl，4-半乳糖轉移酶與雞Pl，4-半乳糖轉移酶核酸序列(SEQIDN0:1)的同一性是90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供該酶的與雞131，4-半乳糖轉移酶核酸序列(SEQIDNO:1)的同一性是85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的核酸和載體。在某些具體實施方式中，植物細胞或植物表達功能性非哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶，該酶與雞P1，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)至少具有65%的同一性。在其他具體實施方式中，功能性非哺乳動物Pl，4-半乳糖轉移酶與雞Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)的同一性是75%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%。在某些具體實施方式中，植物細胞或植物表達功能性非哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶，該酶與雞P1，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)具有至少65%的同一性，并包含帶有哺乳動物延伸序列的N-末端。哺乳動物延伸序列可以包含，例如，人13-1，4_半乳糖轉移酶多肽1序列的前13個氨基酸殘基，即MRLREPLLSGSAA(SEQIDNO:21)，或非哺乳動物GalT的CTS被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS;置換物能例如來源于大鼠a2，6-唾液酸轉移酶的CTS(GenbankaccessionM18769)。在其它具體實施方式中，包含哺乳動物延伸序列的功能性非哺乳動物P1，4-半乳糖轉移酶與雞131，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)的同一性是75%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供核酸及其載體，所述核酸及其載體包含上述的哺乳動物延伸序列或改變的CTS區(qū)，它們僅在與雞131，4_半乳糖轉移酶核酸序列相關的方面與雞P1，4-半乳糖轉移酶核酸序列(SEQIDN0:1)的同一性是85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%;也就是說，序列同一性的確定不通過哺乳動物延伸序列或改變的CTS區(qū)。在某些具體實施方式中，植物細胞或植物表達功能性非哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶，該酶與斑馬魚Pl，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDNO:13)的同一性是至少85%。在其它具體實施方式中，功能性非哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶與斑馬魚131，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDNO:13)的同一性是90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供該酶的與斑馬魚131，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDNO:13)的同一性是85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的核酸和載體。在某些具體實施方式中，植物細胞或植物表達功能性非哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶，該酶與斑馬魚Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)的同一性是至少65%。在其它具體實施方式中，功能性非哺乳動物Pl，4-半乳糖轉移酶與斑馬魚PI,4_半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)的同一性是75%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或99%。在某些具體實施方式中，植物細胞或植物表達非哺乳動物131，4_半乳糖轉移酶，該酶與斑馬魚P1，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)的同一性是至少65%并包含帶有哺乳動物延伸序列的修飾N-末端。在其它具體實施方式中，包含哺乳動物延伸序列的功能性非哺乳動物P1，4-半乳糖轉移酶與斑馬魚131，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)的同一性是75%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%。在某些具體實施方式中，植物細胞或植物表達非哺乳動物131，4_半乳糖轉移酶，該酶與斑馬魚P1，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)的同一性是至少65%，其中斑馬魚131，4-半乳糖轉移酶的CTS被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS。在其它具體實施方式中，包含哺乳動物延伸序列的功能性非哺乳動物P1，4-半乳糖轉移酶與斑馬魚P1，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDN0:14)的同一性是75%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供核酸及其載體，所述核酸及其載體包含上述的哺乳動物延伸序列或改變的CTS區(qū)，它們僅在與斑馬魚131，4-半乳糖轉移酶的核酸序列相關的方面與斑馬魚Pl，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDNO:13)的同一性是85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%;也就是說，序列同一性的確定不通過哺乳動物延伸序列或改變的CTS區(qū)。在某些具體實施方式中，非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶是雞或魚的13-1，4_半乳糖轉移酶，其N-末端延伸序列來自于人13-1，4-半乳糖轉移酶基因或CTS來源于大鼠唾液酸轉移酶。在某些具體實施方式中，雞P-1，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列是SEQIDNO:2，魚的P-l，4-半乳糖轉移酶來源于斑馬魚(Daniorerio)，其氨基酸序列是SEQIDNO:14。在某些具體實施方式中，該酶分別由SEQIDN0:1和SEQIDN0:13核酸序列編碼。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供表達例如來自雞或魚的非哺乳動物PI,4_半乳糖轉移酶的植物細胞或植物。在某些具體實施方式中，植物細胞或植物表達功能性野生型雞Pl，4-半乳糖轉移酶(SEQIDNO:2)。在某些具體實施方式中，上面提到的植物細胞或植物產生至少雜合類型N-連接的聚糖(即至少包含三甘露糖基化的殼二糖核心，一個另外的甘露糖和在N-連接的聚糖的a1，3-臂上的非還原末端的半乳糖基化GlcNAc殘基)，不含Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基。在某些具體實施方式中，不含Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基的雜合類型N-連接的聚糖的總量較表達野生型人的Pl，4-半乳糖轉移酶的植物細胞或植物產生的量增加2倍。在某些具體實施方式中，所述的量增加3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，250，500，1000或10，000倍。在其它具體實施方式中，植物細胞或植物表達包含N-末端的13個氨基酸的雞Pl，4-半乳糖轉移酶(SEQIDNO:9)。在某些具體實施方式中，上面提到的植物細胞或植物至少產生不含Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基的雜合類型N-連接的聚糖。在某些具體實施方式中，不含P1，2-木糖和a1，3-巖藻糖殘基的雜合類型N-連接的聚糖的總量較表達野生型人131，4_半乳糖轉移酶的植物細胞或植物產生的量增加2倍。在其它具體實施方式中，該量增加3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，250，500，1000或10，000倍。在其它具體實施方式中，植物細胞或植物表達在N-末端包含唾液酸轉移酶CTS延伸序列的雞Pl，4-半乳糖轉移酶(SEQIDN0:11)。在某些具體實施方式中，上面提到的植物細胞或植物至少產生不含P1，2-木糖和a1，3-巖藻糖殘基的雜合類型N-連接的聚糖，以及包含至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角N-連接的聚糖(即除三甘露糖基化殼二糖核心外還在非還原末端帶有至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基的N-連接的聚糖)。在某些具體實施方式中，不含P1，2-木糖和a1，3-巖藻糖殘基的雜合類型N-連接的聚糖和/或包含至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角N-連接的聚糖的總量較表達野生型人Pl，4-半乳糖轉移酶的植物細胞或植物產生的量的增加2倍。在其它具體實施方式中，該量增加3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，250，500，1000或10，000倍。在某些具體實施方式中，植物細胞或植物表達野生型斑馬魚Pl，4-半乳糖轉移酶(SEQIDNO:14)。在某些具體實施方式中，上面提到的植物細胞或植物產生至少雙觸角N-連接的聚糖，以及包含至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角N-連接的聚糖。在某些具體實施方式中，雙觸角N-連接的聚糖或包含至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角N-連接的聚糖的總量較表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物細胞或植物產生的量的增加2倍。在其它具體實施方式中，該量增加3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，250，500，1000或10，000倍。在其它具體實施方式中，植物細胞或植物表達N-末端包含13個氨基酸的斑馬魚P1，4-半乳糖轉移酶(SEQIDNO:16)。在某些具體實施方式中，上面提到的植物細胞或植物產生至少雙觸角N-連接的聚糖，以及包含至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角N-連接的聚糖。在某些具體實施方式中，雙觸角N-連接的聚糖和/或包含至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角N-連接的聚糖的總量較表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物細胞或植物產生的量的增加2倍。在其它具體實施方式中，該量增加3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，250，500，1000或10，000倍。在其它具體實施方式中，植物細胞或植物表達N-末端包含唾液酸轉移酶CTS延伸序列的斑馬魚Pl，4-半乳糖轉移酶(SEQIDN0:16)。在某些具體實施方式中，上面提到的植物細胞或植物產生至少雙觸角N-連接的聚糖，以及包含至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角N-連接的聚糖。在某些具體實施方式中，雙觸角N-連接的聚糖和/或包含至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角N-連接的聚糖的總量較表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物細胞或植物產生的量的增加2倍。在其它具體實施方式中，該量增加3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，250，500，1000或10，000倍。在某些具體實施方式中，編碼非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的核酸，該核酸在其N-末端被延伸，延伸的序列為來源于哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶1的N-末端的序列或哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶或唾液酸轉移酶(本文所描述的)的N-末端CTS序列，可替代性地被延伸為任何其它CTS序列，所述其它CTS序列來源于植物，動物或真菌的定位于高爾基體的蛋白，以使非哺乳動物GalT的催化結構域跨高爾基體定位表達到將其在C末端融合的位置。本發(fā)明提供這種核酸。在某些具體實施方式中，植物細胞或植物除了表達非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶(本文所描述的)夕卜，還表達第二種蛋白，優(yōu)選哺乳動物蛋白以產生半乳糖基化的N-連接的聚糖，從而產生異質性糖蛋白，該糖蛋白的N-聚糖的131，4-半乳糖基化，雙觸角或可以雜合形式替代令人感興趣。本發(fā)明還提供在表達非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的植物細胞或植物中產生的這種糖蛋白。在某些具體實施方式中，所述第二蛋白自編碼抗體的重鏈和/或輕鏈或其功能片段的核酸表達。技術人員熟知重組核酸在細胞表達系統(tǒng)中的表達，如例如能產生整個植物的植物細胞。表達載體可用于表達在細胞表達系統(tǒng)中表達重組核酸。在某些具體實施方式中，這種載體包含編碼非哺乳動物P_1，4-半乳糖轉移酶或其酶學活性衍生物或部分的DNA，該DNA可選在N-末端延伸或其本身的CTS被置換為另一種定位于高爾基體的蛋白的N-末端CTS序列，以這種方式，該酶在N-連接的聚糖上具有半乳糖基化活性。合適的載體進一步包含調節(jié)元件，如啟動子，并可選包含至少一種可在所述的細胞表達系統(tǒng)中表達的選擇標記。該表達載體可進一步編碼至少一種編碼能糖基化的哺乳動物糖蛋白的進一步DNA。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供產生功能性非哺乳動物的酶的植物或植物細胞該功能性非哺乳動物的酶可選在N-末端被延伸，延伸的序列為來源于哺乳動物GalT或其內源性CTS被另一種來源于植物的定位于高爾基體的蛋白的CTS置換，該植物或植物細胞能進行正常情況下在植物中不出現(xiàn)的N-聚糖的生物合成從而例如產生加入半乳糖后使N-連接的聚糖延伸的能力。在某些具體實施方式中，表達是瞬時的，而在其它具體實施方式中，表達非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶或其酶學活性衍生物或部分，和可選表達另外的可被糖基化的異源蛋白的植物或植物細胞中轉染是穩(wěn)定轉染。在某些具體實施方式中，植物或植物細胞可另外表達第三種蛋白。這種第三種蛋白可是進一步將所述的半乳糖基化的第二種蛋白糖基化。在某些具體實施方式中，植物細胞或植物可包含兩條核酸，其編碼二聚體或多聚體蛋白的單體。在某些具體實施方式中，各個核酸是抗體的輕鏈和重鏈或其功能片段或是任何其它目的二聚體或多聚體蛋白。當然，不必要表達全長蛋白質。在某些具體實施方式中，本發(fā)明所述的植物細胞或植物僅表達片段，優(yōu)選是所述第二種哺乳動物糖蛋白的功能片段，所述片段具有完整蛋白的至少一種活性并且其進一步特征是例如具有截短的多肽鏈或是未充分延伸的聚糖，例如僅延伸出半乳糖。本發(fā)明也提供這種糖蛋白或其片段。將植物特異性殘基如131，2-木糖和a1，3-巖藻糖殘基加至植物中產生的糖蛋白上使得這種糖蛋白較不適于藥物用途，因為Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基在哺乳動物體內產生非預期的抗原性和免疫原性特征。為了實質上限制131，2-木糖和a1，3-巖藻糖殘基在植物中產生的糖蛋白上的數(shù)目或為了達到完全不含這些殘基，需要以合成顯示人源化火哺乳動物源化特征的糖蛋白的方式修飾植物細胞基因組的策略。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供這樣的植物細胞或植物其中第二種蛋白和優(yōu)選第二種哺乳動物蛋白或其功能片段包含不含木糖和/或巖藻糖延伸出來的N-連接的聚糖。植物來源的半乳糖基化糖蛋白仍然可含有木糖和巖藻糖殘基。在某些具體實施方式中，在本發(fā)明的別處所述的非哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶或其修飾版本因此在植物中以下列方式表達在高爾基體中酶作用于天然底物，也就是在N-乙酰葡糖胺基轉移酶I，高爾基體-甘露糖苷酶II和N-乙酰葡糖胺基轉移酶II的作用后，假如這些酶不在另一中途徑中被抑制，在木糖基轉移酶和巖藻糖基轉移酶作用之后。自植物中獲得的半乳糖基化蛋白本文是指植物來源的。本文也提供這種植物來源的半乳糖基化蛋白。為了在植物中產生定制的糖蛋白，使植物的糖基化作用最大化，可將木糖基轉移酶和巖藻糖基轉移酶敲除或沉默，并且在幾種哺乳動物的糖基轉移酶中至少一種表達。如果木糖基轉移酶和巖藻糖基轉移酶敲除并因此降低植物的非所需的糖基化潛力是可行的選擇，因為例如編碼N-乙酰葡糖胺基轉移酶I的基因發(fā)生突變的擬南芥突變體是完全有活力的。由于N-乙酰葡糖胺基轉移酶I是起始復雜聚糖的形成的酶，該植物完全缺乏含有復雜聚糖的木糖和巖藻糖殘基。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供這樣的植物或植物細胞其中可被糖基化的非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶或其酶學活性衍生物或部分，另外的異源蛋白，和可選另外提供進一步N-聚糖的生物合成的第三種蛋白被表達，并且其中編碼負責添加木糖和/或巖藻糖的酶的基因被敲除，或者其中使用反義鏈或RNAi技術使這些基因沉默表達。在植物中進行基因敲除或通過RNAi使基因沉默的方法為本領域所熟知。RNA干擾(RNAi)是抑制基因在翻譯階段表達或通過阻礙特定基因轉錄的機制。小干擾RNA鏈(siRNA)對于RNAi過程是關鍵的，并具有與耙RNA鏈互補的核酸鏈。特異性RNAi途徑蛋白，如dicer(RISC)，被siRNA導向耙信使RNA(mRNA)，在此處它們將耙序列剪切成為不再能翻譯成蛋白的小的部分。RNA干擾是對病毒和其它異源遺傳物質的免疫應答的重要的部分，尤其是在植物中。RNA干擾已經用于在植物生物技術的應用中，例如在工程化產生較低水平的天然植物毒素的農作物的應用中，在番茄植物降低變應原水平，和在番茄中強化含食用抗氧化劑的植物(SunilkumarG.etal.(2006)ProcNatlAcadSciUSA103(48):18054-9;SiritungaD，SayreR(2003)Planta217(3):367-73丄eL.etal.(2006)PlantBiotechnolJ4(2):231-42;NiggewegR.etal.(2004)NatBiotechnol22(6):746-54)。這種技術具有在植物家系中具有穩(wěn)定的和可遺傳的RNAi表型的優(yōu)勢。在其它具體實施方式中，本發(fā)明提供將包含延伸的不含木糖和/或巖藻糖N-連接的聚糖的糖蛋白特異性分離和純化的方法。有幾種分離技術，如(免疫)親和純化或分子大小排除層析或電泳，以進行所需的純化。這些方法為本領域所熟知(例如見US2008/0003680)。本領域技術人員將理解本發(fā)明不限于植物或植物細胞，還提供其它生物體，像動物，真菌或酵母，或細胞系，像哺乳動物細胞系或昆蟲細胞系，能產生本發(fā)明所述的糖蛋白(基本上是非唾液酸化的)其中所述的N-連接的聚糖包含半乳糖。在某些具體實施方式中，通過接種含有包含如本文所述的編碼N-糖基化修飾的酶的核酸序列和編碼商業(yè)目的異源糖蛋白基因的(二元)載體的帶有土壤桿菌屬品系的植物細胞或組織可建立產生定制的商業(yè)目的糖蛋白的產生瞬時或穩(wěn)定轉化的植物?？商娲?，在某些具體實施方式中，產生定制商業(yè)目的糖蛋白的瞬時或穩(wěn)定轉化的植物可通過同時接種(共轉化)兩種或多種土壤桿菌屬品系，每種帶有包含編碼N-糖基化修飾酶的核酸序列或編碼異源的商業(yè)目的糖蛋白的核酸序列的載體而產生?？商娲?，在某些具體實施方式中，產生定制商業(yè)目的糖蛋白的瞬時或穩(wěn)定轉化的植物能通過將修飾N-糖基化的植物與表達編碼商業(yè)目的蛋白的多聚核苷酸的植物進行(多重)雜交而產生。在所有這些程序中，載體可還包含賦予其抗選擇劑的抗性的核酸序列。如本領域技術人員所知，為了獲得涉及N-糖基化的蛋白和商業(yè)目的糖蛋白或多肽的滿意表達，可使核酸系列適應于宿主植物中的特異性轉錄和翻譯機制。例如，可在編碼區(qū)內導入沉默突變以改進密碼子用法，且可使用特異性啟動子驅動所述基因在相關植物組織中的表達。可被發(fā)育中(developmentally)調節(jié)的或能隨意誘導的啟動子可用于確保在合適的時間表達，例如，僅在植物組織在從田地里收獲后并被送進控制條件下后表達。在所有這些情況下，應選擇在同一細胞中表達以使糖蛋白發(fā)生所需翻譯后修飾的糖基化修飾蛋白的和商業(yè)目的糖蛋白的表達盒。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供煙草植物或與煙草屬物種相關的植物，優(yōu)選是普通煙草(N.tabac咖)或本塞姆氏煙草(N.benthamiana)。在其它具體實施方式中，可使用其它相對容易轉化的植物，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)或玉米(Zeamays),或與其有關的植物。對于重組糖蛋白的產生，使用浮萍具有特別的優(yōu)勢。該植物一般小，并通過營養(yǎng)體的出芽進行無性生殖。大多數(shù)浮萍物種具有大得多的植物的所有的組織和器官，包括根，莖，花，種子和葉。浮萍能在能輕易地將其收獲的滿的容器(containment)中在簡單的液體溶液的表面以自由漂浮的植物廉價和非常快速地生長。在某些具體實施方式中，浮萍是重組的，其產生非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶或其修飾版本(本文中所描述的)和/或編碼商業(yè)上的目的性異源糖蛋白的基因。浮萍植物可包含例如紫萍屬(genusSpirodella)，無根萍屬(genusWolffia)，扁無根萍屬(genusWolffiella)或浮萍屬(genusLemna)，小浮萍(Lemnaminor)，微小浮萍(Lemnaminiscula)禾口圓浮萍(Lemnagibba)。25在某些具體實施方式中，表達在番茄果實中進行。番茄能容易地在含有(contained)和控制條件下在溫室中生長，并且能在全年大量連續(xù)收獲番茄果實生物量。能容易地將含有目的糖蛋白的水樣部分從番茄果實的其余部分中分離以使糖蛋白的純化更容易。在某些具體實施方式中，表達在其它作物的貯藏器官中進行，所述的貯藏器官包括但不限于玉米仁，馬鈴薯根莖和油菜籽或向日葵的種子，其是有吸引力的替代方法可產生巨大的生物量的器官以便于使用收獲和加工技術。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供產生轉基因植物的方法，如轉基因煙草亞種，優(yōu)選普通煙草(N.tabac咖)或本塞姆氏煙草(N.benthamiana)，擬南芥或玉米，馬鈴薯，番茄或浮萍，這些植物能表達能通過半乳糖延伸N-連接的聚糖的重組蛋白，所述方法包含將所述轉基因植物與至少包含一種可選的功能性非哺乳動物蛋白的植物雜交，例如，能進行N-聚糖生物合成的運載體或酶正常不存在于植物中，自所述的雜交中收獲子代并選擇表達所述重組蛋白的子代和表達參與哺乳動物樣N-聚糖的生物合成的功能性非哺乳動物的酶，該酶正常不存在于植物中。在一種具體實施方式中，該方法可進一步包含選擇表達所述的包含延伸的N-連接的至少包含半乳糖的聚糖的重組蛋白的所需子代植物。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供表達包含N-連接的聚糖的所述重組糖蛋白的植物和表達參與哺乳動物樣N-聚糖的生物合成的非哺乳動物的酶的植物。在另外的具體實施方式中，本發(fā)明還提供轉基因植物的產生所需糖蛋白或其功能片段的用途，尤其其中所述的糖蛋白或其功能片段包含延伸的N-連接的至少包含半乳糖的聚糖。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供產生能表達能以半乳糖延伸N-連接的聚糖的重組蛋白的轉基因植物細胞懸浮培養(yǎng)物的方法，所述的轉基因植物細胞懸浮培養(yǎng)物如轉基因煙草物種，優(yōu)選BY2煙草，胡蘿卜或擬南芥細胞懸浮物。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供產生能表達能以半乳糖延伸N-連接的聚糖的重組蛋白的轉基因苔蘚的方法，所述的轉基因苔蘚如轉基因苔蘚植物(Bryophytaea)，優(yōu)選小立碗蘚(Physcomitrellapatens)或葫戸蘚(Funariahygrometrica)，角齒蘚(Ceratodonpurpureus)。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供獲得所需糖蛋白或其功能片段的方法，該方法包含例如至少包含半乳糖的聚糖延伸N-連接的聚糖。所述的方法包含將本發(fā)明所述的植物培養(yǎng)直至所述植物達到收獲階段，例如當長出足夠的生物量時進行有盈利的收獲，接著本領域已建立的已知技術收獲所述的植物并將采用本領域已建立的已知技術分離所述的植物，以獲得各部分植物材料和從所述的各部分植物材料中至少是部分分離所述糖蛋白。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供植物來源的包含以至少包含半乳糖的聚糖延伸N-連接的聚糖的糖蛋白及其片段，例如通過上面解釋的方法獲得的及其片段。這種植物來源的帶有以至少包含半乳糖的聚糖延伸的聚糖的糖蛋白實質上能是任何所需的能在植物中表達的糖蛋白。例如，抗體，疫苗，細胞因子，F(xiàn)SH，TSH和其它激素糖蛋白，其它激素像EP0，酶像抗胰蛋白酶或脂酶，細胞粘附分子像NCAM或膠原能在植物中產生并能產生實質上哺乳動物糖基化模式。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供如上所述的這種植物來源的糖蛋白及其功能片段的用于產生藥物組合物，例如用于產生用于以抗體，激素，細胞因子，疫苗抗原，酶等治療患者的藥物組合物的用途。本發(fā)明還提供這種包含糖蛋白及其功能片段的藥物組合物。植物的轉化能通過使用本領域已知方法表達蛋白，這些蛋白如例如產生N-聚糖的生物合成的非哺乳動物酶，以及糖蛋白，如抗體，細胞因子，疫苗，激素等。例如，通過土壤桿菌屬介導的轉化電穿孔或基因槍的穩(wěn)定表達，或通過使用病毒載體如PVX，例如，或農業(yè)濾過作用或本領域其它已知方法的瞬時表達。本發(fā)明所述的能進行聚糖的生物合成糖基轉移酶，和/或承擔糖基化的糖蛋白可在特異性啟動子的調控下表達，所述的特異性啟動子能易化其在特定組織或器官中的表達。編碼所需非哺乳動物糖基轉移酶和/或本文所述的糖蛋白的多肽的DNA序列，例如編碼蛋白全長的cDNA或基因組序列，可被用于構建能被導入所需植物中的重組表達盒。如本文所述分離的核酸，例如包含如SEQIDN0:l，8，10，13，15和17的序歹lJ，能根據(jù)本領域已知的技術導入植物中。通常，制備上述和適于轉化植物細胞的重組表達盒。本文所述的分離核酸然后能用于轉化。以這種方式，能獲得遺傳修飾植物，植物細胞，植物組織，種子等。轉化流程可依進行轉化的植物細胞的類型，即單子葉植物或雙子葉植物而不同。轉化植物細胞的合適的方法包括顯微注射法(Crosswayetal.(1986)Biotechniques4:320—334)，電穿孑L法(Riggsetal(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606)，土壤桿菌屬介導的轉化(見于例如Zhaoetal.U.S.Patent5，981，840;Hincheeetal.(1988)Biotechnology6:915-921)，直接基因轉移方法(Paszkowskietal(1984)EMB0J.3:27172722)，和基因槍法(見于例如Sanfordetal.U.S.Patent4，945，050;Tomesetal.〃DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment〃InG咖borgandPhillips(Eds.)PlantCell,TissueandOrganCulture-FundamentalMethods,Springer-Verlag，Berlin(1995);andMcCabeetal.(1988)Biotechnology6:923-926)。被轉化的細胞根據(jù)常規(guī)方法在植物中生長。見于文獻(例如McCormicketal.(1986)PlantCellR印orts，5:81-84.)。然后，種植這些植物，并與同一轉化品系或不同品系授粉，且所得雜交品系具有所需鑒定過的表型特征?？煞N植兩代或多代以確保主題表型特征穩(wěn)定保留并遺傳，然后收獲種子以確保所需表型或其它特性可得到。轉基因的再生轉化植物表達載體的植物細胞能再生，例如根據(jù)標準植物組織培養(yǎng)技術從單細胞中，愈傷組織或葉片中再生。本領域熟知，能成功地培養(yǎng)任何植物的幾乎各種細胞，組織和器官以再生整個植物。從培養(yǎng)的原生質體重再生植物見于文獻所述(Evansetal.，ProtoplastsIsolationandCulture,HandbookofPlantCellCulture,MacmillanPublishingCompany,NewYork,pp.124176(1983);andBinding,RegenerationofPlants,PlantProtoplasts,CRCPress,BocaRaton，pp.21-73(1985).)。能實現(xiàn)從葉子分離體中使含有通過土壤桿菌屬導入的異源基因的植物再生，(見Horschetal.，Science,227:1229-1231(1985)所述)。在這個程序中，轉化體生長在選擇劑存在和在誘導被轉化的植物物種的芽再生的培養(yǎng)基中(見Fraleyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，8Q:4803(1983)所述)。該程序通常在兩周至四周的時間內產生芽，并且然后將這些轉化體芽轉移至含有選擇劑和預防細菌生長的抗生素的合適的芽_誘導培養(yǎng)基中。可使本發(fā)明所述的轉基因植物增殖或使其不能增殖。再生也能從植物的愈傷組織，移出物，器官或其部分。這種再生技術通常見文獻所述(Kleeetal.，An皿RevPlantPhys.38:467-486(1987))。本領域熟知，從來自單一植物原生質體或各種移出物進行植物的再生(見，例如MethodsforPlantMolecularBiology,A.WeissbachandH.Weissbach，eds.，AcademicPress,Inc.，SanDiego，Calif.(1988))。這種再生和生長過程包括選擇轉化體細胞和芽，使轉化體芽生根并在土壤中生長成小的植株的步驟。玉米細胞培養(yǎng)和再生通常見文獻(TheMaizeHandbook,FreelingandWalbot，Eds.，Springer,NewYork(1994);CornandCornImprovement,3rdedition,SpragueandDudleyEds.，AmericanSocietyofAgronomy，Madison，Wisconsin(1988))。技術人員意識到重組表達盒穩(wěn)定摻入轉基因植物中并被證實是可操作的之后，其能通過性別雜交導入其它植物中。能使用任何數(shù)量的標準育種技術，這取決于待雜交物種。在營養(yǎng)體繁殖的作物中，成熟的轉基因植物能通過取其切屑或通過組織培養(yǎng)技術繁殖以產生多個同一植物。為商業(yè)用途選擇所需轉基因體，并獲得新的品種并優(yōu)選將其進行營養(yǎng)體繁殖。在種子繁殖作物中，成熟的轉基因植物能自交以產生純合的近親交配植物。該近親交配植物產生含有新導入的異源核酸的種子。這些種子能長成產生所選表型的生產植物。本發(fā)明包括從再生植物獲得的部分，如花，種子，葉，枝條，果實等，如果這些部分包含含有本文所述的分離核酸的細胞。再生植物的子代和變體和突變體也包括在本發(fā)明的范圍內，如果這些部分包含導入的核酸序列。表達選擇標記的轉基因植物能通過例如標準免疫印跡和DNA檢測技術以篩選本文所說述的核酸的傳遞。通常還在異源核酸的表達水平上評價轉基因品種。能在起初確定RNA水平上的表達以鑒定和定量表達陽性植物。能使用RNA分析的標準技術，這些技術包括使用設計用以僅擴增異源RNA模板的寡核苷酸引物的PCR擴增檢測和使用異源核酸特異性探針的溶液雜交檢測。然后能將RNA陽性植物通過Western免疫印跡檢測進行蛋白表分析，該檢測使用本文提供的特異性反應抗體。此外，根據(jù)標準流程，分別使用異源核酸特異性多聚核苷酸探針和抗體能進行原位雜交和免疫細胞化學檢測來定位在轉基因組織中的表達位點。通常，篩選多個轉基因品種的摻入的核酸以鑒定和選擇具有適合的表達譜的植物。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供對于添加的異源核酸是純合的轉基因植物；即含有兩種添加的核酸序列，在每對染色體的每條染色體上同一基因座上各有一個基因的轉基因植物。能通過將含有單添加的異源核酸進行性別交配(自交)，使所產生的種子中的一些發(fā)芽，并分析本文所述的多聚核酸表達相對于對照植物(即天然非轉基因植物)發(fā)生改變所產生的所得植物獲得純合轉基因植物。本發(fā)明也關注與親代植物回交和與非轉基因植物異型雜交。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供轉基因植物或轉基因植物細胞的生產過程，該過程包含(a)將DNA插入植物或植物細胞的基因組中，所述的DNA包含編碼非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(其可選以哺乳動物N-末端序列衍生，如本文所述)或編碼所述GalT的核酸序列(其中它的CTS被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS，如本文所述)或其酶學活性衍生物或部分，且此外優(yōu)選至少一種需將其N-連接的聚糖半乳糖基化的哺乳動物蛋白的核酸序列，該DNA另外編碼至少一種在所述植物或所述植物細胞中表達的選擇標記，(b)選擇已經攝入(a)所述的DNA的植物或植物細胞；和(c)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所需的轉基因植物或所需的轉基因植物細胞。技術人員應理解術語"包含半乳糖基化的N-連接的聚糖的蛋白"與編碼所述蛋白的核酸分子之間的關系，該核酸分子僅編碼多肽，然而半乳糖基化N-連接的聚糖是該蛋白在高爾基體中的加工的結果。在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供生產表達重組GalT蛋白和包含半乳糖基化N-連接的聚糖的蛋白的轉基因植物的另外的方法。這種方法可例如包含將本文所述的轉基因植物與另一種植物雜交，收獲所述雜交的子代，并選擇所需表達重組GalT蛋白和表達重組哺乳動物糖蛋白，尤其是包含半乳糖基化N-聚糖或其功能片段的蛋白的子代植物。蛋白純化在某些具體實施方式中，本發(fā)明提供獲得所需糖蛋白或其功能片段的方法，該方法包含將本文所述的植物培養(yǎng)直到所述植物達到可以收獲的階段，收獲并將植物分割以獲得分割的植物材料，并從所述分割的植物材料中至少部分分離所述糖蛋白。在某些具體實施方式中，獲得所需糖蛋白或其功能片段的方法包括在發(fā)酵罐中在細胞培養(yǎng)中使植物細胞生長直到所述的細胞培養(yǎng)已經達到可以收獲的階段或能從培養(yǎng)基中將所需糖蛋白收集起來。本文所述的糖蛋白，如例如抗體，疫苗，細胞因子和激素，可通過本領域技術人員所熟知的標準技術純化。重組蛋白通過聯(lián)合使用細胞裂解(例如超聲裂解法，法國出版社)和親和層析或其它基于親和力的方法純化。對于融合產物，融合蛋白以合適的蛋白水解酶進行后續(xù)消化，釋放出所需重組蛋白。本文所述蛋白，重組蛋白或合成蛋白，可通過本領域熟知的標準技術將其純化至實質上是純凈的(程度)，這些方法包括去污劑增溶溶解，以如硫酸胺的物質進行選擇沉淀，柱層析，免疫純化方法及其他(見例如R.Scopes,ProteinPurification-PrinciplesandPractice,Springer-Verlag:NewYork(1982);Deutscher，GuidetoProteinPurification,AcademicPress(1990))。例如，可產生抗本文所述的蛋白的抗體。遵循美國專利No.4，511，503所述的程序能達到從E.coli中純化。然后，從表達該蛋白的細胞中分離該蛋白，并通過本文所述的標準蛋白質化學技術將其進一步純化。通過本領域已知的方達到檢測表達蛋白，這些方法包括，例如放射性免疫檢測方法，Western印跡技術活免疫沉淀方法。實施例實施例1:鑒定推定的非哺乳動物131，4GalTP-l，4-半乳糖轉移酶(GalT)家族包含至少七個成員，其中數(shù)個已經被克隆出來但僅有少數(shù)幾個被鑒定出來。人和牛起源的P-l，4-半乳糖轉移酶已經被最佳地鑒定出來，并顯示出能以P-l，4-鍵將半乳糖殘基加至N-聚糖的末端GlcNAc殘基上。非哺乳動物物種基因序列中推定的參與N-糖基化的GalT基因基于同源性而被鑒定。圖1顯示，哺乳動物GalT基因序列(人，小鼠和牛)和非哺乳動物推定的GalT基因序列(雞，斑馬魚和蛙)之間的ClustalW比對。顯著地，哺乳動物的氨基末端(位于實線方框內，位于細胞漿內并與跨膜區(qū)相連(TM，虛線方框內)且推定其參與高爾基體-定位過程)在非哺乳動物起源的如例如雞和斑馬魚(見圖1)的GalT直系同源物中不保守。認為高爾基體-定位過程對于GalT活性是重要的，GalT活性能是"晚期"(可能跨高爾基體)，這意味著GalT的催化活性出現(xiàn)在其它糖基轉移酶的作用之后，這些糖基轉移酶產生雙觸角N-聚糖，如例如植物中的Man-I，GnT-I，Man-II，GnT-II，XylT和FucT，或GalT的催化活性出現(xiàn)在"早期"(順式/中間_高爾基體)，其出現(xiàn)在Man-II，XylT和FucT活性之前，從而預防在不含巖藻糖和木糖的雜合類型N-聚糖的植物中產生的這些酶的活性。非哺乳動物GalT直系同源物，例如來源于雞和斑馬魚的GalT直系同源物，以前未就其將半乳糖殘基以P_1，4-鍵加到N-聚糖的末端GlcNAc殘基上的能力進行鑒定，尤其是沒有就在植物中表達的異源性GalT直系同源物的這種能力進行鑒定。尚未研究當其在植物中與非哺乳動物GalT直系同源物融合表達時，不同哺乳動物氨基末端對雙觸角或雜合類型的N-聚糖的產生的影響(其可影響細胞內的定位)和對在N-聚糖上添加植物特異性巖藻糖和木糖殘基的效應?？寺『蜋z測了雞和斑馬魚中每一種的三個GalT構建體的N_糖基化活性a)野生型非哺乳動物雞和斑馬魚P-l，4-GalTl;b)將有13個氨基酸的保守的哺乳動物(人)氨基末端(見圖1)延伸序列與非哺乳動物雞和斑馬魚P-l，4-GalTl融合；和c)哺乳動物胞漿尾和大鼠唾液酸轉移酶基因來源的跨膜結構域(CTS)與非哺乳動物雞和斑馬魚13-1，4-GalTl形成的融合蛋白，置換帶有大鼠唾液酸轉移酶的CTS的雞和斑馬魚P-l，4_GalTl的氨基末端(見實施例2和3).實施例2:編碼全長雞13l，4-GalTl酶及其變體的基因的克隆和表達推定的雞P1，4-GalTl(GGal;GenBankaccessionU19890;SEQGgal，SEQIDNO:2)克隆得較早，盡管未顯示能將N-聚糖半乳糖基化(Sh即eretal.，JBiolChem272，31389-31399，1997)。在我們實驗室，以引物GgalLEEVAST和GgGaldw用RT-PCR將包含114至362殘基的cDNA片段(SEQGgGal114-362，SEQIDNO:3)從雞脾臟總RNA中擴增出來(見表1)。所得的含有C-末端的片段用Xhol和BamHI進行消化，請然后將其克隆進質粒pCASeco中，后者是pUC19衍生物，其中多克隆位點兩翼的HindIII和EcoRI位點用于插入序列SEQCASeco，同時將骨架中的這兩個位點和Eco311-位點刪除。該質粒pCASeco用Xhol和BamHI消化以適應于產生C_末端GGal片段的克隆GgGalC。含有GGal的N_末端的cDNA片段和包含1至113殘基的cDNA片段使用基于PCR的方法從長寡核苷酸中合成性產生。天然cDNA片段的富含GC的特性阻礙了直接RT-PCR克隆的進行，并且該片段的與野生型序列相比無氨基酸改變的密碼子優(yōu)化版本(SEQGgGalsyn，SEQIDNO:6)與編碼SEQGgGal114-362的克隆GgGalC以產生編碼野生型GGal氨基酸序列(SEQGgal，SEQIDNO:2)的基因(SEQGgGalhybr，SEQIDN0:1)的方式合并。然后將文中稱為SEQGgGalhybr的基因用作起始材料以產生兩種變體，一種變體是其N_末端以編碼全長人P1，4-GalTl(GenBankaccessionNM—001497)的13個氨基酸殘基的序列延伸，且另一種是其編碼包含GGal的催化結構域的40至362殘基的片段與N_末端結構域包含1-53殘基的大鼠a2，6-唾液酸轉移酶的C-末端融合，因此包括胞漿尾，跨膜結構域和部分莖區(qū)。大鼠SialT-來源序列包含相對于野生型序列的一個沉默突變。30帶有13個氨基酸的N-末端延伸序列的GGal使用PCR以寡核苷酸HsGgGalstart和M13上游引物從編碼GGal的雜合克隆中制備出來(表l)。所得PCR片段用BpiI和XbaI消化并克隆進進行同樣消化的GGal克隆。所得的克隆含有帶SEQHsGGal(SEQIDNO:8)的基因。帶有大鼠SialTN-末端結構域的變體使用PCR以寡核苷酸GgGall42和M13上游引物從編碼完整GGal的克隆(SEQGgGalhybr，SEQIDN0:1)中制備出來(表1)。所得的片段用Eco311和BamHI消化，并克隆進經NcoI和BamHI消化的含有大鼠序列的pCASeco質粒。所得的克隆含有帶SEQsialGGal(SEQIDNO:10)的基因。含有三種不同GGal基因的植物轉化載體的制備過程如下首先將用Eco311和BamHI消化的基因克隆進用NcoI和BamHI消化的pRAP40載體中，使該基因位于增強的CaMV35S啟動子和AMV翻譯增強子的下游。pRAP40是pUC19衍生物，其含有增強的CaMV35S啟動子和兩翼的nos終止子，其借助AscI位點位于該啟動子的上游，借助PacI位點位于該終止子的下游；包括兩翼的限制性位點的完整盒被稱作SEQRAP40(SEQIDNO:12)。然后將這三個包含啟動子，三個基因中的一個基因和終止子的盒中的每一個盒分別轉移至二元載體pM0G22的修飾版本中，所述版本中多克隆位點中的EcoRI和HindIII位點已分別被PacI和AscI置換(Goddijnetal.，1993，PlantJ4:863-873)。為了達到這個目的，pRAP來源克隆用PacI和AscI消化，然后克隆進Asc-Pac消化的雙元載體中，假使三種不同載體適于進行植物轉化。在根瘤土壤桿菌介導轉化煙草之后，表達GGal及其變體的轉基因植物通過分析通過轉化體合成的N-聚糖進行選擇，使用的方法如前所述(例如Bakkeretal.ProcNatlAcadSciUSA98:2899_904，2001andProcNatlAcadSciUSA103:7577-82,2006)。從表達雞的基因的轉基因植物中純化的N-聚糖的MALDI-TOF分析結果(見圖2，并在圖4右欄和表3中總結)顯示僅雞的帶有13個氨基酸延伸序列(HsGGal，SEQIDNO:8)或SialT-CTS(sialGGal，SEQIDNO:10)的基因序列的表達導致帶有半乳糖殘基的全部雙觸角N-聚糖的產生。野生型雞GalT基因的表達僅導致雜合類型的N-聚糖的產生。雞GalT的13個氨基酸延伸序列(HsGGal，SEQIDNO:8)或SialT-CTS(sialGGal，SEQIDNO:10)也都有某些雜合類型半乳糖基化N-聚糖。顯著地，三種不同GGal基因的表達導致幾乎完全不含末端是兩個GlcNAc殘基的雙觸角N-聚糖(見表3和圖4，上行，右欄)占優(yōu)勢，而不是帶有一個半乳糖切不含木糖和巖藻糖的雜合類型半乳糖基化的N-聚糖，尤其是對于表達野生型雞GalT(見圖4，中行，右欄)。這個N-聚糖產生模式顯著不同于以人GalT或斑馬魚GalT轉化的植物中獲得的模式(分別見表3和圖4，左和中欄，且見下文)。植物特異性木糖和巖藻糖殘基減少或完全不含，如當在植物中表達野生型雞GalT時，見于雜合類型半乳糖基化N-聚糖，當產生例如異源性治療性糖蛋白時，由于Pl，2-木糖和131，3-巖藻糖殘基不連接至哺乳動物的糖蛋白上而作為變應原，是所需的。實施例3:編碼全長斑馬魚13l，4-GalTl酶及其變體的基因的克隆和表達。已經鑒定了推定的斑馬魚P1，4-GalTl(Machingoetal.，DevBiol297，471-82,2006;NM_001017730)，但其功能尚未證實，且本發(fā)明人相信，鑒定是不正確的。從整體斑馬魚總RNA開始，全長DGal基因(SEQDgal，SEQIDNO:13)使用RT-PCR以引物DrGalup和DrGaldw(見表2)進行擴增。所得的片段用XbaI和BamHI消化，然后克隆進同樣消化的質粒pCASeco(見上文)中。序列測定顯示，其事實上與未鑒定的Genbank登錄號為001077259相同，盡管有三個突變如此處所示(自+1開始，且非沉默突變下劃線)T126C，T230G,G862C。Dgal(SEQDgal，SEQIDNO:14)與推定的斑馬魚P1，4-GalTl之間的氨基酸序列比較(如已發(fā)表于Machingoetal.，DevBiol297，471-82，2006;NM_001017730)顯示在氨基酸水平上有少數(shù)序列同源性，尤其是在N-末端，假設N-末端參與高爾基體_定位過程，且在我們的克隆中的C-末端顯著延長(見圖5)。帶有13個氨基酸的N-末端延伸序列的DGal從編碼DGal的克隆(SEQDgal，SEQIDNO:13)中使用PCR以寡核苷酸HsDrup和DrGaldw(表2)制備出來。所得PCR片段用AccI和BpiI消化，并克隆進同樣消化的DGal克隆中。所得的克隆含有帶SEQHsDGal(SEQIDNO:15)的基因。帶有大鼠SialTN-末端結構域的變體從編碼完整DGal的克隆(SEQDgal，SEQIDNO:13)中使用PCR以寡核苷酸DrGal160和DrGaldw(見表2)制備出來。所得片段用BpiI和BamHI消化，并克隆進含有大鼠序列的用NcoI和BamHI消化的pCASeco質粒中。所得克隆含有與大鼠的SialT基因(SEQsialDGal，SEQIDNO:17)的N_末端融合的DGal催化結構域。含有三個不同DGal基因的植物轉化載體的制備過程如下首先將用Eco311和BamHI消化的該基因克隆進用消化的pRAP40載體中，造成該基因在增強的CaMV35S啟動子的下游。然后這三個包含啟動子，這三個基因之一和終止子的盒中每一個盒分別轉移至二元載體PM0G22的修飾版本中，其中多克隆位點中的EcoRI和Hindl11位點被分別置換為PacI和AscI(Goddijnetal.，1993，PlantJ4:863-873)。為了達到這個目的，pRAP來源克隆用PacI和AscI消化，然后克隆進用Asc-Pac消化的二元載體中，加入三中不同載體適于進行植物轉化。在根瘤土壤桿菌介導下轉化煙草后，表達DGal或其變體的轉基因植物通過分析由轉化體合成的N-聚糖進行選擇，所用的方法見前所述(例如Bakkeretal.，ProcNatlAcadSciUSA98:2899-904，2001andProcNatlAcadSciUSA103:7577-82，2006)。表達斑馬魚GalT基因序列的轉基因植物中純化的N-聚糖的MALDI-TOF分析結果(見圖3，并總結于圖4的中欄和表3)顯示，野生型斑馬魚GalT基因序列的表達產生某些雜合類型的半乳糖基化N-聚糖，和完全的帶有兩個半乳糖的雙觸角N-聚糖。取決于植物，某些植物表達野生型斑馬魚GalT基因序列后僅有半乳糖基化雙觸角N-聚糖(見圖3，最上端與從頂端行數(shù)第二行進行比較)。雙半乳糖基化雙觸角N-聚糖能顯著地通過13個氨基酸N-末端人GalT(HsDGal，SEQIDNO:15)或SialT-CTS-GalT(sialDGal，SEQIDNO:17)而增加，后者具有最高的量的半乳糖基化雙觸角N-聚糖(見表3和圖4的底端行中間欄)。顯著地，通過在煙草中表達Sial-CTS-斑馬魚GalT而獲得的雙_半乳糖基化雙觸角N-聚糖的半乳糖基化在SialT-CTS-斑馬魚GalT中較SialT-CTS-人GalT增加50%(分別見表3和圖4的底端行，中間欄和左欄)。Sial-CTS-斑馬魚GalT產生高達有一個或多個半乳糖殘基的總的N-聚糖的45%(見表3)。當生產例如異源性治療性糖蛋白時，高產量的有一個或多個半乳糖殘基的總的N-聚糖是需要的，如在當Sial-CTS-斑馬魚GalT在植物中表達時產生的雙觸角N_聚糖中所見。表1.實施例1中使用的寡核苷酸(5'至3')表1.實施例1中使用的寡核苷酸(5'至3')<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>數(shù)字是3_5欄的總峰面積的％;總的半乳糖是帶有一個或多個半乳糖殘基的總N-聚糖的X(6欄)。SEQGgGalhybr(SEQIDN0:1):ATGAAGGAGCCAGCCCTCCCAGGTACATCACTTCAGAGGGCTTGCAGGCTCAGGTAGTTCTCTCACGCCACCTAGAAGTCCTGAACCTCCACCTAGACGACCGCACGTCCACGACCTGGACCTGTTTCAGCACAACCACGTAACCTCCCAGACTTAGAGTTGAGTTCTCTCAGCCTGTGAACCTCGAGGAGGTGGCGAGCACAAACCCTGAGGTCAGGGAGGGAGGTCGTTTTGCTCCAAAGGACTGCAAGGCGCTGCAGAAAGTAGCAATCATCATCCCGTTCCGAAACCGAGAGGAGCATCTGATGGAGTGTATGTCATCAACCAGGATGGAGACGAAGAATTTAACCGTGCTAAACTGCTGAATGTAGGATTCACGGAAGCTTTGAAGGAGTATGACTATGACTGCTTTGTGTTTAGTGATGTAGACCTGATCCCAATGGATGACAGGAACACCTACACAATTCACGAAGATCAATGGGTTCCCAAACAATTACTGGGGCTGGGGAGGCGGCCAGATGCTGTCATTGGGAAATGCAGAATGATTCGCCACTCGCGTGATCGGAAGAACGAGCCCAACCCGGAGAGGTTTGACCGTATTGCTCACACCAGGGAGACGATGAGCTCTGATGGCTTGAACTCGCTCTCCTACGAGGTGCTAAGGACTGACAGGTTCCCTCTGTACACGAGGATCACAGTGGATATCGGAGCGCCCGGCAGCTGASEQGgal(SEQIDNO:2):MKEPALPGTSLQRACRLLVAFCALHLSATLLYYLAGSSLTPPRSPEPPPRRPPPANLSLPPSRPPPPPAARPRPGPVSAQPRNLPDSAPSGLCPDPSPLLVGPLRVEFSQPVNLEEVASTNPEVREGGRFAPKDCKALQKVAIIIPFRNREEHLKYWLY預HPILQRQQLDYGVYVINQDGDEEFNRAKLLNVGFTEALKEYDYDCFVFSDVDLIPMDDRNTYKCYSQPRHLSVSMDKFGFRLPYNQYFGGVSALSKEQFTKINGFPNNYWGWGGEDDDIYNRLVFKGMGISRPDAVIGKCRMIRHSRDRKNEPNPERFDRIAHTRETMSSDGLNSLSYEVLRTDRFPLYTRITVDIGAPGSSEQGgGall14-362(SEQIDNO:3):CTCGAGGAGGTGGCGAGCACAAACCCTGAGGTCAGGGAGGGAGGTCGTTTTGCTCCAAAGGACTGCAAGGCGCTGCAGAAAGTAGCAATCATCATCCCGTTCTTCAAAGGCAGCAGCTAGATTATGGAGTGTATGTCATCAACCAGGATGGAGACGAAGAATTTAACCGTGCTAAACTGCTGAATGTAGGATTCACGGAAGCTTTATGGATGACAGGAACACCTACAAGTGCTACAGCCAACCAAGGCACCTTTCT3527/32頁TGTGTCTGCCTTGAGCAAAGAACAATTCACGAAGATCAATGGGTTTCCAAACAATTACTGGGGCTGGGGAGGCGAAGATGATGACATCTACAACAGGCTGGTGTTCAAAGGCATGGGCATATCTCGGCCAGATGCTGTCATTGGGAAATGCAGAATGATTCGCCACTCGCGTGATCGGAAGAACGAGCCCAACCCGGAGAGGTTTGACCGTATTGCTCACACCAGGGAGACGATGAGCTCTGATGGCTTGAACTCGCTCTCCTACGAGGTGCTAAGGACTGACAGGTTCCCTCTGTACACGAGGATCACAGTGGATATCGGAGCGCCCGGCAGCTGASEQGgGal114-362(SEQIDNO:4):LEEVASTNPEVREGGRFAPKDCKALQKVAIIIPFRNREEHLKYWLY預HPILQRQQLDYGVYVINQDGDEEFNRAKLLNVGFTEALKEYDYDCFVFSDVDLIPMDDRNTYKCYSQPRHLSVSMDKFGFRLPYNQYFGGVSALSKEQFTKINGFPNNYWGWGGEDDDIYNRLVFKGMGISRPDAVIGKCRMIRHSRDRKNEPNPERFDRIAHTRETMSSDGLNSLSYEVLRTDRFPLYTRITVDIGAPGSSEQCASeco(SEQIDNO:5):AGAGACCTCTTAATTAASEQGgGalsyn(SEQIDNO:6):CTCGAGGAGACCGAAGACAACATGAAGGAGCCAGCCCTCCCAGGTACATCTCGAGSEQGgGalsyn(SEQIDNO:7):MKEPALPGTSLQRACRLLVAFCALHLSATLLYYLAGSSLTPPRSPEPPPRRPPPANLSLPPSRPPPPPAARPRPGPVSAQPRNLPDSAPSGLCPDPSPLLVGPLRVEFSQPVNLESEQHsGGal(SEQIDNO:8):ATGAGGCTTCGGGAGCCTCTCCTCAGCGGCAGCGCCGCTATGAAGGAGCCACACGCCACCTAGAAGTCCTGAACCTCCACCTAGACGACCACCTCCAGCTAACTCTCAGCCTGTGAACCTCGAGGAGGTGGCGAGCACAAACCCTGAGGTCAGGGAGGGAGGTCGTTTTGCTCCAAAGGACTGCAAGGCGCTGCAGAAAGTAGCAATCATCATCCCGTTCCGAAACCGAGAGGAGCATCTGAAGTACTGGCTCTCATCAACCAGGATGGAGACGAAGAATTTAACCGTGCTAAACTGCTGAATGTGATGTAGACCTGATCCCAATGGATGACAGGAACACCTACAAGTGCTACAGCCAATCAGTATTTTGGAGGTGTGTCTGCCTTGAGCAAAGAACAATTCACGAAGATCAATGGGTTCCCAAACAATTACTGGGGCTGGGGAGGCGAAGATGATGAGTCATTGGGAAATGCAGAATGATTCGCCACTCGCGTGATCGGAAGAACGAGCCCAACCCGGAGAGGTTTGACCGTATTGCTCACACCAGGGAGACGATGAGCCTCTGTACACGAGGATCACAGTGGATATCGGAGCGCCCGGCAGCTGASEQHsGgGal(SEQIDNO:9):MRLREPLLSGSAAMKEPALPGTSLQRACRLLVAFCALHLSATLLYYLAGSSLTPPRSPEPPPRRPPPANLSLPPSRPPPPPAARPRPGPVSAQPRNLPDSAPSGLCPDPSPLLVGPLRVEFSQPVNLEEVASTNPEVREGGRFAPKDCKALQKVAIIIPFRNREEHLKYWLY預HPILQRQQLDYGVYVINQDGDEEFNRAKLLNVGFTEALKEYDYDCFVFSDVDLIPMDDRNTYKCYSQPRHLSVSMDKFGFRLPYNQYFGGVSALSKEQFTKINGFPNNYWGWGGEDDDIYNRLVFKGMGISRPDAVIGKCRMIRHSRDRKNEPNPERFDRIAHTRETMSSDGLNSLSYEVLRTDRFPLYTRITVDIGAPGSSEQsialGGal(SEQIDNO:10):TCCTGTTCGCAGTCATCTGTGTTTGGAAGAAAGGGAGCGACTATGAGGCCCTTACACTGCAAGCCAAGGAGTTCCAGATGCCCAAGAGCCAGGAGAAAGTGGCCATGACGCCACCTAGAAGTCCTGAACCTCCACCTAGACGACCACCTCCACACGACCTGGACCTGTTTCAGCACAACCACGTAACCTCCCAGACTCTGCTCTGAGTTCTCTCAGCCTGTGAACCTCGAGGAGGTGGCGAGCACAAACCCTGAGGTCAGGGAGGGAGGTCGTTTTGCTCCAAAGGACTGCAAGGCGCTGCAGAAAGTAGCAATCATCATCCCGTTCCGAAACCGAGAGGAGCATCTGAAGTACTGTATGTCATCAACCAGGATGGAGACGAAGAATTTAACCGTGCTAAACTGCTGCGAAGATCAATGGGTTTCCAAACAATTACTGGGGCTGGGGAGGCGAAGATGTGCTGTCATTGGGAAATGCAGAATGATTCGCCACTCGCGTGATCGGAAGAACGAGCCCAACCCGGAGAGGTTTGACCGTATTGCTCACACCAGGGAGACGATGAGCTCTGATGGCTTGAACTCGCTCTCCTACGAGGTGCTAAGGACTGACAGGTTCCCTCTGTACACGAGGATCACAGTGGATATCGGAGCGCCCGGCAGCTGASEQsialGGal(SEQIDNO:11):MIHTNLKKKFSLFILVFLLFAVICVWKKGSDYEALTLQAKEFQMPKSQEKVAMTPPRSPEPPPRRPPPANLSLPPSRPPPPPAARPRPGPVSAQPRNLPDSAPSGLCPDPHLKYWLY預HPILQRQQLDYGVYVINQDGDEEFNRAKLLNVGFTEALKEYDYDCFVFSDVDLIPMDDRNTYKCYSQPRHLSVSMDKFGFRLPYNQYFGGVSALSKEQFTKINGFPNNYWGWGGEDDDIYNRLVFKGMGISRPDAVIGKCRMIRHSRDRKNEPNPERFDRIAHTRETMSSDGLNSLSYEVLRTDRFPLYTRITVDIGAPGSSEQRAP40(SEQIDNO:12):CAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAATTCCGCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTAGATCGGGAATTCCAGATCTGCGGCCGCTTAATTAASEQDgal(SEQIDNO:13):TCTAGAAGACAACATGCCGGACTCCACCGGGAACTTCAGCCTCCTGCAGCGTTTACTACATGAGGAACTCGGACTCTCGGCCAGCCTTCGCCCAGAACCAGCAGCAGAGACCGACGATACACAGGAAACTGGCGGAGCAGAGGGGCACCACTGAGGACAGCAGACCCGCGGCCAACGCCTCGAGCAACGGCCAGGAGCTGCAGATCTGCCCAGAGGAGCCGCCGCGCCTGGTGGGTCCTCTGCGTGTGGAGTTCTCAGACCCGATCACGTTAGAAATGGTGCGGACAGAGAACAGTGTTCTGCAAGAGGGCGGACGCTTCAGACCCCCAGACTGCATAGCTCGGCAGAAGGTGGATCAACCAGGATGGCGAGGACACGTTTAATCGAGCTAAACTCCTGAACATCGGCTATGCGGAGGCGCTGAAGGAGTACGATTACGACTGTTTTGTGTTCAGCAGCCCAGACACCTGGCCGTCTCCATGGACAAGTTCGGCTTCAGGCTGCCGTACACACAGTATTTCGGTGGCGTTTCGTCGCTCAGCAAAGAGCAGTTCCTGAAGATCAACGGATTCCCCAACAACTACTGGGGCTGGGGCGGAGAGGACGACGACTCCTGGGTCGCTGTAGGATGATCCGGCATGAGAGAGACAAGCAGAACGACCCAAACCCTCAAAGATTTGACCGAATCGCGCACACAAGGGAAACCATGGCAACTGATGGGATCAATTCGCTAAAATATAACGTGGTAAAAATCGAGAAAGACCTGCTCTTCACCAAAATCACAGTGGACGTGGGCAAACCCTGASEQDgal(SEQIDNO:14):MPDSTGNFSLLQRTCSLVVLLCFLHIFVTVIY預RNSDSRPAFAQNQQQRPTIHRKLAEQRGTTEDSRPAANASSNGQELQICPEEPPRLVGPLRVEFSDPITLEMVRTENSVLQEGGRFRPPDCIARQKVAMIIPFRNRDEHLKFWLYYLHPILQRQQLDYGVYVINQDGEDTFNRAKLLNIGYAEALKEYDYDCFVFSDVDLIPMDDRNIYKCYNQPRHLAVSMDKFGFRLPYTQYFGGVSSLSKEQFLKINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRISSRGMSISRPDGLLGRCRMIRHERDKQNDPNPQRFDRIAHTRETMATDGINSLKYNVVKIEKDLLFTKITVDVGKPSEQHsDGal(SEQIDNO:15):TCTAGAAGACAACATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAGCGGCAGCGCCGCGATGCCGGACTCCACCGGGAACTTCAGCCTCCTGCAGCGGACCTGCTCTCTGGAACTCGGACTCTCGGCCAGCCTTCGCCCAGAACCAGCAGCAGAGACCGACGATACACAGGAAACTGGCGGAGCAGAGGGGCACCACTGAGGACAGCAGACCCGCGGCCAACGCCTCGAGCAACGGCCAGGAGCTGCAGATCTGCCCAGAGGAGCCGCCGCGCCTGGTGGGTCCTCTGCGTGTGGAGTTCTCAGACCCGATCACGTTAGAAATGGTGCGGACAGAGAACAGTGTTCTGCAAGAGGGCGGACGCTTCAGACCCCCAGACTGCATAGCTCGGCAGAAGGTGGCCATGATCATCCCCTTCCGGAACCGAGACGAGCACCTGAAGTTCTGGCTCTATTACCTGCACCCCATCCTGCAGCGCCAACAGCTCGACTACGGCGTCTACGTCATCAACCAGGATGGCGAGGACACGTTTAATCGAGCTAAACTCCTGAACATCGGCTATGCGGAGGCGCTGAAGGAGTACGATTACGACTGTTTTGTGTTCAGCGACGTGGACCTGATCCCGATGGATGACCGCAACATCTACAAGTGCTACAATCAGCCCAGACACCTGGCCGTCTCCATGGACAAGTTCGGCTTCAGGCTGCCGTACACACAGTATTTCGGTGGCGTTTCGTCGCTCAGCAAAGAGCAGTTCCTGAAGATCAACGGATTCCCCAACAACTACTGGGGCTGGGGCGGAGAGGACGACGACATCTTCAACGCTGTAGGATGATCCGGCATGAGAGAGACAAGCAGAACGACCCAAACCCTCAAAGATTTGACCGAATCGCGCACACAAGGGAAACCATGGCAACTGATGGGATCAATTCGCTAAAATATAACGTGGTAAAAATCGAGAAAGACCTGCTCTTCACCAAAATCACAGTGGACGTGGGCAAACCCTGASEQHsDGal(SEQIDNO:16):MRLREPLLSGSAAMPDSTGNFSLLQRTCSLVVLLCFLHIFVTVIY預RNSDSRPAFAQNQQQRPTIHRKLAEQRGTTEDSRPAANASSNGQELQICPEEPPRLVGPLRVEFSDPITLEMVRTENSVLQEGGRFRPPDCIARQKVAMIIPFRNRDEHLKFWLYYLHPILQRQQLDYGVYVINQDGEDTFNRAKLLNIGYAEALKEYDYDCFVFSDVDLIPMDDRNIYKCYNQPRHLAVSMDKFGFRLPYTQYFGGVSSLSKEQFLKINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRISSRGMSISRPDGLLGRCRMIRHERDKQNDPNPQRFDRIAHTRETMATDGINSLKYNVVKIEKDLLFTKITVDVGKPSEQsialDGal(SEQIDNO:17):TCCTGTTCGCAGTCATCTGTGTTTGGAAGAAAGGGAGCGACTATGAGGCCCTTACACTGCAAGCCAAGGAGTTCCAGATGCCCAAGAGCCAGGAGAAAGTGGCCATGCACAGGAAACTGGCGGAGCAGAGGGGCACCACTGAGGACAGCAGACCCGCGGCCAACGCCTCGAGCAACGGCCAGGAGCTGCAGATCTGCCCAGAGGAGCCGCCGCGCCTGGTGGGTCCTCTGCGTGTGGAGTTCTCAGACCCGATCACGTTAGAAATGGTGCGGACAGAGAACAGTGTTCTGCAAGAGGGCGGACGCTTCAGACCCCCAGACTGCATAGCTCGGCAGAAGGTGGCCATGATCATCCCCTTCCGGAACCGAGACGAGCACCTGAAGTTCTGGCTCTATTACCTGCACCCCATCCTGCAGCGCCAACAGCTCGACTACGGCGTCTACGTCATCAACCAGGATGGCGAGGACACGTTTAATCGAGCTAAACTCCTGAACATCGGCTATGCGGAGGCGCTGAAGGAGTACGATTACGACTGTTTTGTGTTCAGCGACGTGGACCTGATCCCGATGGATGACCGCAACATCTACAAGTGCTACAATCAGCCCAGACACCTGGCCGTCTCCATGGACAAGTTCGGCTTCAGGCTGCCGTACACACAGTATTTCGGTGGCGTTTCGTCGCTCAGCAAAGAGCAGTTCCTGAAGATCAACGGA40TTCCCCAACAACTACTGGGGCTGGGGCGGAGAGGACGACGACATCTTCAACGCTGTAGGATGATCCGGCATGAGAGAGACAAGCAGAACGACCCAAACCCTCAAAGATTTGACCGAATCGCGCACACAAGGGAAACCATGGCAACTGATGGGATCAATTCGCTAAAATATAACGTGGTAAAAATCGAGAAAGACCTGCTCTTCACCAAAATCACAGTGGACGTGGGCAAACCCTGASEQsialDGal(SEQIDNO:18):MIHTNLKKKFSLFILVFLLFAVICVWKKGSDYEALTLQAKEFQMPKSQEKVAMHRKLAEQRGTTEDSRPAANASSNGQELQICPEEPPRLVGPLRVEFSDPITLEMVRTENSVLQEGGRFRPPDCIARQKVAMIIPFRNRDEHLKFWLYYLHPILQRQQLDYGVYVINQDGEDTFNRAKLLNIGYAEALKEYDYDCFVFSDVDLIPMDDRNIYKCYNQPRHLAVSMDKFGFRLPYTQYFGGVSSLSKEQFLKINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRISSRGMSISRPDGLLGRCRMIRHERDKQNDPNPQRFDRIAHTRETMATDGINSLKYNVVKIEKDLLFTKITVDVGKPSEQCTSsialT(SEQIDNO:19):TCCTGTTCGCAGTCATCTGTGTTTGGAAGAAAGGGAGCGACTATGAGGCCCTTACACTGCAAGCCAAGGAATTCCAGATGCCCAAGAGCCAGGAGAAAGTGGCCATGSEQCTSsialT(SEQIDNO:20):MIHTNLKKKFSLFILVFLLFAVICVWKKGSDYEALTLQAKEFQMPKSQEKVAMN-末端的13個氨基酸殘基，人P-l，4-半乳糖轉移酶l(SEQIDNO:21)MRLREPLLSGSAA權利要求一種產生能將半乳糖以β-1，4-鍵加至N-連接的聚糖上的轉基因植物或轉基因植物細胞的方法，該方法包含(a)將編碼非哺乳動物β-1，4-半乳糖轉移酶的核酸分子插入植物或植物細胞中；并且(b)選擇攝入(a)中所述核酸分子并表達所述核酸分子的轉基因植物或轉基因植物細胞，從而產生出能將半乳糖殘基以β-1，4-鍵加至N-連接的聚糖上的轉基因植物或轉基因植物細胞。2.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶包含雞13-1，4-半乳糖轉移酶l。3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中雞P-l，4-半乳糖轉移酶l包含SEQIDNO:2。4.根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶被延伸，延伸的序列為能指導非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶在高爾基體中定位的氨基酸序列。5.根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶在其N-末端被延伸，延伸的序列為對應于哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶1的N-末端的氨基酸序列的氨基酸序列。6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中N-末端的氨基酸序列在前10個N-末端氨基酸上至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中[K/R]代表賴氨酸或精氨酸殘基，并且X能是任何氨基酸。7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中氨基酸序列是MRLREPLLSGSAA(SEQIDN0:21)。8.根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的胞漿-跨膜-莖區(qū)(CTS)被另一定位于高爾基體的蛋白的CTS置換。9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中CTS來源于哺乳動物的定位于高爾基體的蛋白。10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中CTS來源于哺乳動物唾液酸轉移酶。11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中CTS來源于大鼠a2，6-唾液酸轉移酶。12.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中CTS來源于植物的定位于高爾基體的蛋白。13.—種產生包含一種或多種半乳糖基化N-連接的聚糖的異源糖蛋白的方法，該方法包含(a)將編碼非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的核酸分子和編碼異源糖蛋白的核酸分子插入植物或植物細胞中，從而產生轉基因植物或轉基因植物細胞；并且(b)在適合所述的核酸分子表達的條件下維持所述的轉基因植物或轉基因植物細胞從而產生出包含一種或多種半乳糖基化的N-連接的聚糖的異源糖蛋白。14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其進一步包含從轉基因植物或轉基因植物細胞中至少部分地分離異源糖蛋白。15.根據(jù)權利要求13或14所述的方法，其中所述糖蛋白在其一個或多個N-聚糖上包含一個或多個半乳糖殘基。16.根據(jù)權利要求13至15中任一項所述的方法，其中糖蛋白中的N-聚糖基本上不含木糖殘基。17.根據(jù)權利要求13至15中任一項所述的方法，其中糖蛋白中的N-聚糖基本上不含巖藻糖殘基。18.根據(jù)權利要求13至15中任一項所述的方法，其中所述的糖蛋白中的N-聚糖基本上不含木糖殘基和巖藻糖殘基。19.根據(jù)權利要求13至18中任一項所述的方法，其中所述編碼異源糖蛋白的核酸分子編碼激素；細胞因子，疫苗；粘附分子，或抗體或其功能片段。20.根據(jù)權利要求1至19中任一項所述的方法，其中所述的植物或植物細胞另外包含編碼至少一種能在植物或植物細胞中表達的選擇標記的核酸分子。21.根據(jù)權利要求1至20中任一項所述的方法，其中所述的植物或植物細胞是煙草屬的物種(Nicotianassp.)或來源于煙草屬的物種(Nicotianassp.)。22.根據(jù)權利要求1至21中任一項所述的方法，其中所述核酸分子經顯微注射法、PEG轉化法、土壤桿菌屬介導的轉化法、電穿孔法、基因槍法、直接基因轉移法、脂質體融合法、植物活體轉化法、磷酸鈣沉淀法、農桿菌浸潤法或病毒感染法插入。23.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶由與雞P1，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDN0:1)至少有85%同一性的核酸編碼。24.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶由與雞P1，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDN0:1)至少有90%同一性的核酸編碼。25.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶由與雞P1，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDN0:1)至少有95%同一性的核酸編碼。26.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶由與雞P1，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDN0:1)至少有98%同一性的核酸編碼。27.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞P1，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列(SEQIDNO:2)至少具有85%的同一性。28.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞Pl，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列(SEQIDNO:2)至少具有90%的同一性。29.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞Pl，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列(SEQIDNO:2)至少具有95%的同一性。30.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞Pl，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列(SEQIDNO:2)至少具有98%的同一性。31.根據(jù)權利要求27至30中任一項所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列另外包含哺乳動物延伸序列。32.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中所述哺乳動物延伸序列是MRLREPLLSGSAA(SEQIDNO:21)。33.根據(jù)權利要求27至30中任一項所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的CTS被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS，并且其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞P1，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)至少具有85%的同一性。34.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)至少具有90%的同一性。35.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)至少具有95%的同一性。36.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中所述非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)至少具有98%的同一性。37.根據(jù)權利要求33至36中任一項所述的方法，其中所述另一定位于高爾基體的蛋白的CTS是大鼠a2，6_唾液酸轉移酶CTS。38.根據(jù)權利要求23至37中任一項所述的方法，其中所述植物或植物細胞產生包含不含Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基的雜合類型的N-連接的聚糖的糖蛋白。39.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中產生的不含Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基的雜合類型的N-連接的聚糖的量是表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物細胞或植物產生的量的兩倍。40.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中產生的不含Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基的雜合類型的N-連接的聚糖的量是表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物細胞或植物產生的量的五倍。41.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中產生的不含Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基的雜合類型的N-連接的聚糖的量是表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物細胞或植物產生的量的十倍。42.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中產生的不含Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基的雜合類型的N-連接的聚糖的量是表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物細胞或植物產生的量的五十倍。43.根據(jù)權利要求38至42中任一項所述的方法，其中植物或植物細胞產生包含雙觸角N-聚糖的糖蛋白，所述的雙觸角N-聚糖包含至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基。44.一種如權利要求13至22中任一項所述的方法產生的糖蛋白。45.—種如權利要求1至12或19至43中任一項所述的方法產生的植物或這種植物的部分。46.根據(jù)權利要求45所述的植物，其中植物是選自種子、胚芽、愈傷組織、葉、根、芽、花粉或小孢子的植物部分。47.—種如權利要求1至12或19至43中任一項所述的方法產生的植物細胞。48.根據(jù)權利要求47所述的植物細胞，其中所述的植物細胞以懸浮培養(yǎng)生長。49.一種編碼包含雞P-l，4-半乳糖轉移酶l的氨基酸序列(SEQIDNO:2)和其N-末端延伸序列的多肽的核酸，其中所述延伸序列是對應于哺乳動物的P1，4-半乳糖轉移酶1的N-末端氨基酸序列的氨基酸序列，其中所述的N-末端氨基酸序列在其前10個N-末端氨基酸上至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中所述[K/R]代表賴氨酸或精氨酸殘基，并且X能是任何氨基酸。50.根據(jù)權利要求49所述的核酸，其中所述的氨基酸序列是MRLREPLLSGSAA(SEQIDNO:21)。51.根據(jù)權利要求49所述的核酸，其中所述的氨基酸序列包含SEQIDNO:8。52.—種編碼包含雞P-l，4-半乳糖轉移酶l的氨基酸序列(SEQIDNO:2)的多肽的核酸，其中雞P_1，4-半乳糖轉移酶的CTS被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS。53.根據(jù)權利要求52所述的核酸，其中所述CTS來源于哺乳動物的定位于高爾基體的蛋白。54.根據(jù)權利要求53所述的核酸，其中所述CTS來源于哺乳動物唾液酸轉移酶。55.根據(jù)權利要求54所述的核酸，其中所述CTS來源于大鼠a2，6-唾液酸轉移酶。56.根據(jù)權利要求55所述的核酸，其中氨基酸序列包含SEQIDNO:11。57.根據(jù)權利要求52所述的核酸，其中所述CTS來源于植物的定位于高爾基體的蛋白。58.—種編碼包含非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列的多肽的核酸，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與雞P-l，4-半乳糖轉移酶1(SEQIDN0:2)的酶活性結構域的氨基酸序列和其N-末端延伸序列的同一性至少是90%，其中該延伸序列是對應于哺乳動物13-1，4-半乳糖轉移酶1的N-末端氨基酸序列的氨基酸序列，其中所述N-末端氨基酸序列在前10個N-末端氨基酸序列中至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中[K/R]代表賴氨酸或精氨酸殘基，且X能是任何氨基酸。59.根據(jù)權利要求58所述的核酸，其中所述的序列同一性至少是95%。60.根據(jù)權利要求58所述的核酸，其中所述的序列同一性至少是98%。61.—種包含如權利要求49至60中任一項所述的核酸的表達載體。62.根據(jù)權利要求61所述的載體，其中核酸分子連接至足以使該核酸分子在真核或原核細胞內轉錄的調節(jié)元件上。63.—種宿主細胞，其包含如權利要求49至60中任一項所述的連接至足以在植物細胞內轉錄的異源調節(jié)元件上的核酸分子或包含如權利要求61或62所述的載體。64.—種如權利要求48所述的植物細胞，其中以懸浮培養(yǎng)生長的植物細胞選自BY2煙草N.taba固BY2、胡蘿卜Da腦scarota或擬南芥Arabidopsisthaliana懸浮細胞。65.—種如權利要求48所述的植物細胞，其中植物細胞是選自苔蘚植物Bryophytaea、小立碗蘚Physcomitrellapatens、葫戸蘚Funariahygrometrica或角齒蘚的苔蘚Ceratodonpurpureus的苔蘚的部分。66.—種如權利要求l所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶包含斑馬魚P-l，4-半乳糖轉移酶l。67.—種如權利要求66所述的方法，其中斑馬魚P-1，4-半乳糖轉移酶1包含SEQIDNO:14。68.—種如權利要求66或67所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶被延伸，延伸的序列為能指導非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶在高爾基體內定位的氨基酸序列。69.根據(jù)權利要求68所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶在其N-末端被延伸，延伸的序列為對應于哺乳動物P1，4-半乳糖轉移酶1的N-末端氨基酸序列的氨基酸序列。70.根據(jù)權利要求69所述的方法，其中N-末端氨基酸序列在前10個N-末端氨基酸的至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中[K/R]代表賴氨酸或精氨酸殘基，且X能是任何氨基酸。71.根據(jù)權利要求70所述的方法，其中氨基酸序列是MRLREPLLSGSAA(SEQIDNO:21)。72.根據(jù)權利要求66或67所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的胞漿-跨膜-莖區(qū)(CTS)被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS。73.根據(jù)權利要求72所述的方法，其中CTS來源于哺乳動物的定位于高爾基體的蛋白。74.根據(jù)權利要求73所述的方法，其中CTS來源于哺乳動物唾液酸轉移酶。75.根據(jù)權利要求74所述的方法，其中CTS來源于大鼠a2，6_唾液酸轉移酶。76.根據(jù)權利要求72所述的方法，其中CTS來源于植物的定位于高爾基體的蛋白。77.根據(jù)權利要求66至76中任一項所述的方法，其中植物或植物細胞另外包含編碼至少一種在植物或植物細胞中表達的標記的核酸分子。78.根據(jù)權利要求66至77中任一項所述的方法，其中植物或植物細胞是或來源于煙草屬的物種。79.根據(jù)權利要求66至78中任一項所述的方法，其中核酸分子經顯微注射法、PEG轉化法、土壤桿菌屬介導的轉化法、電穿孔法、基因槍法、直接基因轉移法、脂質體融合法、植物活體轉化法、磷酸鈣沉淀法、農桿菌浸潤法或病毒感染法插入。80.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中編碼非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的核酸與斑馬魚P1，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDNO:13)至少有85%的同一性。81.根據(jù)權利要求80所述的方法，其中編碼非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的核酸與斑馬魚P1，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDNO:13)至少有90%的同一性。82.根據(jù)權利要求80所述的方法，其中編碼非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的核酸與斑馬魚P1，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDNO:13)至少有95%的同一性。83.根據(jù)權利要求80所述的方法，其中編碼非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的核酸與斑馬魚P1，4-半乳糖轉移酶的核酸序列(SEQIDNO:13)至少有98%的同一性。84.根據(jù)權利要求l所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列的酶活性結構域與斑馬魚P1，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)的酶活性結構域具有至少85%的同一性。85.根據(jù)權利要求84所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列的酶活性結構域與斑馬魚P1，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)的酶活性結構域具有至少90%的同一性。86.根據(jù)權利要求84所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列的酶活性結構域與斑馬魚P1，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)的酶活性結構域具有至少95%的同一性。87.根據(jù)權利要求84所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列的酶活性結構域與斑馬魚P1，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)的酶活性結構域具有至少98%的同一性。88.根據(jù)權利要求84至87中任一項所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列另外包含哺乳動物延伸序列。89.根據(jù)權利要求88所述的方法，其中哺乳動物延伸序列是MRLREPLLSGSAA(SEQIDNO:21)。90.根據(jù)權利要求84至87中任一項所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的CTS被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS，且其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與斑馬魚Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)有至少85%的同一性。91.根據(jù)權利要求90所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與斑馬魚Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDN0:14)有至少90%的同一性。92.根據(jù)權利要求90所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與斑馬魚Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDN0:14)有至少95%的同一性。93.根據(jù)權利要求90所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與斑馬魚Pl，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列(SEQIDNO:14)有至少98%的同一性。94.根據(jù)權利要求90至93中任一項所述的方法，其中另一定位于高爾基體的蛋白的CTS是大鼠a2，6_唾液酸轉移酶的CTS。95.根據(jù)權利要求80至94中任一項所述的方法，其中植物或植物細胞產生包含不含131，2-木糖和a1，3-巖藻糖殘基的雜合類型的N-連接的聚糖的糖蛋白。96.根據(jù)權利要求95所述的方法，其中所產生的不含Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基的雜合類型的N-連接的聚糖的量是表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物或植物細胞產生的量的兩倍。97.根據(jù)權利要求95所述的方法，其中所產生的不含Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基的雜合類型的N-連接的聚糖的量是表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物或植物細胞產生的量的五倍。98.根據(jù)權利要求95所述的方法，其中所產生的不含Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基的雜合類型的N-連接的聚糖的量是表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物或植物細胞產生的量的十倍。99.根據(jù)權利要求95所述的方法，其中所產生的不含Pl，2-木糖和al，3-巖藻糖殘基的雜合類型的N-連接的聚糖的量是表達野生型人131，4-半乳糖轉移酶的植物或植物細胞產生的量的五十倍。100.根據(jù)權利要求95至99中任一項所述的方法，其中植物或植物細胞產生包含含有至少一個半乳糖基化GlcNAc殘基的雙觸角N-聚糖的糖蛋白。101.—種如權利要求66至100中任一項所述的方法產生的植物或這種植物的部分。102.根據(jù)權利要求101所述的植物，其中該植物是選自種子、胚胎、愈傷組織、葉、根、芽、花粉或小孢子的植物部分。103.—種如權利要求66至100中任一項所述的方法產生的植物細胞。104.根據(jù)權利要求103所述的植物細胞，其中該植物細胞是懸浮培養(yǎng)生長。105.—種編碼包含斑馬魚P-l，4-半乳糖轉移酶l的氨基酸序列(SEQIDNO:14)及其N-末端延伸序列的多肽的核酸，其中所述延伸序列是對應于哺乳動物131，4-半乳糖轉移酶1的N-末端氨基酸序列，其中所述N-末端氨基酸序列在前10個N-末端氨基酸上至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中[K/R]代表賴氨酸或精氨酸殘基，且X能是任何氨基酸。106.根據(jù)權利要求105所述的核酸，其中所述的氨基酸序列是MRLREPLLSGSAA(SEQIDNO:21)。107.根據(jù)權利要求105所述的核酸，其中該氨基酸序列包含SEQIDNO:15。108.—種編碼包含斑馬魚P-l，4-半乳糖轉移酶l的氨基酸序列(SEQIDNO:14)的多肽的核酸，其中斑馬魚P-1，4-半乳糖轉移酶的CTS被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS。109.根據(jù)權利要求108所述的核酸，其中CTS來源于哺乳動物定位于高爾基體的蛋白。110.根據(jù)權利要求109所述的核酸，其中CTS來源于哺乳動物唾液酸轉移酶。111.根據(jù)權利要求110所述的核酸，其中CTS來源于大鼠a2，6-唾液酸轉移酶。112.根據(jù)權利要求111所述的核酸，其中氨基酸序列包含SEQIDNO:18。113.根據(jù)權利要求108所述的核酸，其中CTS來源于植物的定位于高爾基體的蛋白。114.一種編碼包含非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的氨基酸序列的多肽的核酸，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶的酶活性結構域的氨基酸序列與斑馬魚P-l，4-半乳糖轉移酶l(SEQIDN0:14)及其N-末端延伸序列的氨基酸序列至少有90X的同一性，其中所述延伸序列是對應于哺乳動物P1，4-半乳糖轉移酶1的N-末端氨基酸序列的氨基酸序列，其中該N-末端氨基酸序列在前10個N-末端氨基酸上至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中[K/R]代表賴氨酸或精氨酸殘基，且X能是任何氨基酸。115.根據(jù)權利要求114所述的核酸，其中所述的序列同一性至少是95%。116.根據(jù)權利要求114所述的核酸，其中所述的序列同一性至少是98%。117.—種包含如權利要求105至106中任一項所述的核酸的表達載體。118.根據(jù)權利要求117所述的載體，其中核酸分子連接至足以使該核酸分子在真核或原核細胞內轉錄的調節(jié)元件。119.一種宿主細胞，其包含如權利要求105至106中任一項所述的連接至足以在植物細胞內轉錄的異源調節(jié)元件上的核酸分子或包含如權利要求117或118所述的載體。120.根據(jù)權利要求104所述的植物細胞，其中懸浮培養(yǎng)生長的植物細胞選自BY2煙草N.taba固BY2、胡蘿卜Da腦scarota或擬南芥Arabidopsisthaliana懸浮細胞。121.根據(jù)權利要求104所述的植物細胞，其中該植物細胞是選自苔蘚植物Bryophytaea、小立碗蘚Physcomitrellapatens、葫戸蘚F皿ariahygrometrica或角齒蘚的苔蘚Ceratodonpurpureus的苔蘚的部分。122.根據(jù)權利要求13至19中任一項所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶是雞P-l，4-半乳糖轉移酶。123.根據(jù)權利要求122所述的方法，其中雞P-l，4-半乳糖轉移酶的N-末端被延伸，延伸的序列為對應于哺乳動物P_1，4-半乳糖轉移酶1的N-末端氨基酸序列的氨基酸序列。124.根據(jù)權利要求122所述的方法，其中雞P-1，4-半乳糖轉移酶的CTS被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS。125.根據(jù)權利要求13至19中任一項所述的方法，其中非哺乳動物P-l，4-半乳糖轉移酶是斑馬魚P-l，4-半乳糖轉移酶。126.根據(jù)權利要求122所述的方法，其中斑馬魚P-l，4-半乳糖轉移酶在N-末端被延伸，延伸的序列為對應于哺乳動物P-1，4-半乳糖轉移酶1的N-末端氨基酸序列的氨基酸序列。127.根據(jù)權利要求122所述的方法，其中斑馬魚P-1，4-半乳糖轉移酶的CTS被置換為另一定位于高爾基體的蛋白的CTS。全文摘要本發(fā)明涉及能以其野生型或修飾形式使用的非哺乳動物β-1，4-半乳糖轉移酶。本發(fā)明進一步涉及表達非哺乳動物β-1，4-半乳糖轉移酶的轉化的植物和植物細胞，和產生糖基化作用改變的并優(yōu)選是哺乳動物類型的糖基化作用的糖蛋白的方法。本發(fā)明另外還提供非哺乳動物β-1，4-半乳糖轉移酶的核酸分子和表達載體。文檔編號A01H5/00GK101702919SQ200880016408公開日2010年5月5日申請日期2008年4月17日優(yōu)先權日2007年4月17日發(fā)明者D·E·A·弗洛拉克,G·J·A·勞溫德,H·J·博斯申請人:國際植物研究所