專利名稱：一種控制水稻谷粒粒寬和粒重的主效基因gs5的克隆與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及到一個(gè)位于水稻第五染色體短臂上 控制谷粒粒寬和粒重的主效QTL (GS5)的基因克隆與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻谷粒大小是一個(gè)重大的農(nóng)藝性狀(1)谷粒大小由粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚三個(gè)子性 狀控制，是千粒重的主要決定因素，而粒重又是水稻產(chǎn)量的三個(gè)主要構(gòu)成因子之一。因此， 谷粒大小是一個(gè)重要的產(chǎn)量性狀；(2)粒重和粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚等性狀呈極顯著正相關(guān)(邢 永忠等，2001，植物學(xué)報(bào)43:840-845)，所以谷粒大小還是一個(gè)重要的稻米外觀品質(zhì)性狀。 稻谷品質(zhì)越來越被世人所關(guān)注，人們對(duì)稻米米質(zhì)的要求不僅是口味的舒適，還要求外型的 美觀，因此稻米外觀品質(zhì)的好壞直接關(guān)系稻米商品性的好壞，而在我國(guó)國(guó)家優(yōu)質(zhì)稻谷標(biāo)準(zhǔn) 中還對(duì)稻米粒長(zhǎng)與粒寬的比值作了具體規(guī)定，認(rèn)為優(yōu)質(zhì)的秈稻品種的稻米長(zhǎng)寬比不能低于 2.8。(3)谷粒大小在作物的進(jìn)化研究中具有重要的意義。一般認(rèn)為野生種具有小而圓的谷 粒粒形以適應(yīng)自然選擇，經(jīng)過人類長(zhǎng)期的馴化和選擇，現(xiàn)有栽培種的谷粒粒形明顯變大。因 此，闡明谷粒大小的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)理有利于同時(shí)改良水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，還可為禾本 科的進(jìn)化研究提供線索。谷粒大小的遺傳基礎(chǔ)比較復(fù)雜，是典型的數(shù)量性狀。利用分子標(biāo)記技術(shù)可以對(duì) 控制數(shù)量性狀的QTL(Quantitative Trait Loci)進(jìn)行定位和分解，將復(fù)雜的數(shù)量性狀分 解為簡(jiǎn)單的孟德爾因子來進(jìn)行研究。利用這種方法，近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多控制谷粒大小 的QTLs。其中位于水稻第五染色體短臂上控制谷粒粒寬和粒重的主效QTL，(該QTL在本 發(fā)明中被命名為GS5)在許多研究中都能檢測(cè)到(林鴻宣等，1995，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)28 :1_7 ； Wan 等，2005，Theor. Appl. Genet. 110 1334-1346)。本實(shí)驗(yàn)室利用珍汕 97/ 明恢 63 衍生的 F2_3和重組自交系群體也多次檢測(cè)到GS5區(qū)域存在一個(gè)主效QTL同時(shí)控制著谷粒粒寬和粒 重，并且可以揭示粒寬總變異的30%以上以及粒重總變異的10%以上(Yu等，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :9226_9231 ；Li 等，2000，Theor. Appl. Genet. 101 :248_254 ；Tan 等， 2000, Theor. Appl. Genet. 101 823-829 ；Xing 等，2001, Acta. Bot. Sin. 43 721-726 ；Xing 等，2002，Theor. Appl. Genet. 105 :248_257 ；Hua 等，2002，Genetics 162 :1885_1895)。這 些結(jié)果表明GS5基因可以在不同的遺傳背景以及不同環(huán)境下都能穩(wěn)定表達(dá)，因此GS5對(duì)于 水稻產(chǎn)量和品種性狀的改良具有巨大的應(yīng)用潛力和前景，對(duì)GS5基因進(jìn)行克隆可以為水稻 的產(chǎn)量和品質(zhì)育種提供新的重要的基因資源。在遺傳上，QTL與控制質(zhì)量性狀的基因一樣會(huì)通過遺傳重組進(jìn)行分離，差異只是 遺傳效應(yīng)的大小方面，因此QTL同樣可以進(jìn)行精細(xì)定位。但在初級(jí)群體中QTL與其它許多 非QTL位點(diǎn)一起同時(shí)發(fā)生分離，這些非QTL位點(diǎn)和環(huán)境因素一樣都會(huì)對(duì)QTL的表型性狀產(chǎn) 生極大的干擾作用。因此，在利用初級(jí)群體進(jìn)行QTL定位時(shí)，QTL的置信區(qū)間通常在IOcM 以上(Darvasi 等，1992，Theor. Appl. Genet. 85 :353_359)，很難確定檢測(cè)到的一個(gè)主效QTL 到底是一個(gè)還是多個(gè)微效 QTL(Yano and Sasaki, 1997, Plant MolecularBiology 35 145-153)。因此有必要在初級(jí)定位的基礎(chǔ)上，對(duì)QTL進(jìn)行高分辨率的精細(xì)定位(< IcM)。通 常，用于QTL精細(xì)定位的最好辦法就是構(gòu)建含有目標(biāo)QTL的染色體片段替代系(Chromosome segmentsubstitution line, CSSL)或近等基因系(Nearly isogenic line, NIL)等次級(jí) 定位群體(Secondary population)，使群體中只有單個(gè)的QTL位點(diǎn)發(fā)生分離，極大限度地 減少了個(gè)體間由于遺傳背景和環(huán)境不同造成的對(duì)目標(biāo)性狀產(chǎn)生的干擾，使該位點(diǎn)表現(xiàn)為簡(jiǎn) 單的孟德爾因子遺傳，從遺傳和統(tǒng)計(jì)上為QTL的精細(xì)定位創(chuàng)造便利條件。這種方法已經(jīng)在 許多QTL的精細(xì)定位和基因克隆研究中發(fā)揮了重要的作用(Yano等，2000，PlantCell, 12 2473-2484 ;Frary等，2000，Science 289:85-88)。這些方法為采用圖位克隆的策略分離、 克隆GS5的基因提供了依據(jù)。本發(fā)明利用圖位克隆的方法分離克隆一個(gè)控制水稻谷粒粒寬和粒重的主效基因 GS5，為水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)育種提供新的基因資源，也為作物的進(jìn)化研究提供線索。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從水稻中分離克隆一個(gè)同時(shí)控制谷粒粒寬和粒重的主效基因的 完整編碼區(qū)段DNA片段，利用這個(gè)基因改良水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的能力。申請(qǐng)人將克隆的這個(gè) 基因命名為GS5。本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一個(gè)水稻粒形和千粒重的基因GS5，其中，所述片 段如序列表SEQ ID N0:1-6所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO 1_6所示的高度同源DNA 序列。具體地，本發(fā)明分離克隆的基因或等位基因以及調(diào)控上述基因或等位基因的啟動(dòng) 子的核苷酸序列的信息如下所示一種控制水稻谷粒粒寬和粒重性狀的主效基因GS5，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1 所示。上述主效基因GS5的編碼序列如序列表SEQ ID NO 1中第2001-3449位對(duì)應(yīng)的核 苷酸所示。與此同時(shí)，申請(qǐng)人得到一種控制水稻谷粒粒寬和粒重性狀的主效基因GS5的等位 基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:3所示。上述等位基因的編碼序列如序列表SEQ ID NO :3中第2004-3446位對(duì)應(yīng)的核苷酸 所示。其中調(diào)控主效基因GS5的啟動(dòng)子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1中 1-1834位對(duì)應(yīng)的核苷酸所示。其中調(diào)控主效基因GS5的等位基因的啟動(dòng)子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3中1-1837位對(duì)應(yīng)的核苷酸所示。本發(fā)明從珍汕97B和H94組合衍生的雙單倍體群體里選擇含有GS5基因且55% 遺傳背景與珍汕97B —致的材料，與珍汕97B回交三代，自交，構(gòu)建GS5的近等基因系(圖 2)。利用近等基因系群體分析，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)α捄土Ｖ囟加泻艽蟮男?yīng)(表1)，后代測(cè)驗(yàn) 表明，該基因呈現(xiàn)孟德爾基因分離比(圖3)。利用GS5近等基因系的遺傳大群體和圖位克 隆的方法，將GS5精細(xì)定位到8. Okb的染色體區(qū)段內(nèi)(圖4)，然后結(jié)合該區(qū)段內(nèi)的一個(gè)全長(zhǎng) cDNA的序列信息，對(duì)GS5的基因結(jié)構(gòu)和編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)該基因包
4含10個(gè)外顯子，共編碼481個(gè)氨基酸，通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)具有PF00450保 守結(jié)構(gòu)域。Real-Time PCR表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該基因全生育期在各個(gè)組織表達(dá)，并且在穎殼胚 乳中寬粒品種(珍汕97B)比小粒(H94)的表達(dá)量高(圖5)。預(yù)測(cè)表達(dá)量起重要作用，于是 利用RT-PCR獲得H94的cDNA陽性克隆，亞克隆后，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因超表達(dá)驗(yàn)證，將該基因轉(zhuǎn)入 水稻寬粒品種中花11中，轉(zhuǎn)基因TO代陽性超表達(dá)單株均表現(xiàn)出更寬的粒形(圖7)，并且 其Tl代共分離檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，粒寬和表達(dá)量正相關(guān)(表2)。此外，利用水稻兩個(gè)大粒品種(珍 汕97和特青)和兩個(gè)小粒品種(H94和明恢63)進(jìn)行比較測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在3. 9kb的啟動(dòng)子和 cDNA范圍內(nèi)大小粒品種間存在22個(gè)共同的SNP和InDel差異，其中18個(gè)突變位于啟動(dòng)子 區(qū)，4個(gè)突變位于編碼區(qū)的第1、第2和第9個(gè)外顯子，導(dǎo)致了 5個(gè)氨基酸替換(圖8)。由于 超表達(dá)窄粒的等位基因可以使寬粒變得更寬，所以編碼區(qū)的5個(gè)氨基酸替換不是等位基因 變異的原因，進(jìn)而說明了啟動(dòng)子區(qū)的變異是導(dǎo)致表達(dá)量變化的原因，進(jìn)而導(dǎo)致粒寬變異，同 時(shí)說明GS5是一個(gè)正調(diào)控種子大小和粒重的基因。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明首次在水稻中克隆了一個(gè)對(duì)粒寬和粒重具有很大正調(diào)控效應(yīng)的基因， 為水稻等禾谷類作物的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種提供了新的基因資源，也為其它作物中克隆相關(guān)基因 提供了技術(shù)借鑒；(2)本發(fā)明中克隆的基因也可以為水稻等禾谷類作物以及油菜等雙子葉作物的分 子進(jìn)化研究提供證據(jù)。


序列表SEQ ID NO 1顯示的是本發(fā)明分離克隆的來源珍汕97B的GS5等位基因的 DNA序列(其中包含其啟動(dòng)子序列、5，UTR、不包含內(nèi)含子的⑶S、3，UTR)。序列表SEQ ID NO :2顯示的是本發(fā)明分離克隆的來源珍汕97B的GS5蛋白的氨基酸序列。序列表SEQ ID NO 3顯示的是本發(fā)明分離克隆的來源H94的GS5等位基因的DNA序列(其中包含其啟動(dòng) 子序列、5，UTR、不包含內(nèi)含子的CDS、3，UTR)。序列表SEQID NO :4顯示的是本發(fā)明分離克 隆的來源H94的GS5蛋白的氨基酸序列。圖1.是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2.是本發(fā)明的近等基因系構(gòu)建流程圖?；亟粫r(shí)，以珍汕97作為母本。圖3. BC3F2隨機(jī)群體中谷粒粒寬的頻率分布。圖中黃色、灰色和白色棒分別表示 GS5位點(diǎn)珍汕97基因型，雜合基因型和H94基因型，GS5的三種基因型是通過分子標(biāo)記檢測(cè) 得到的。圖4.是本發(fā)明的近等基因系的粒型表現(xiàn)以及GS5基因的圖位克隆。標(biāo)記間的數(shù) 字代表各標(biāo)記與GS5位點(diǎn)間發(fā)生的重組次數(shù)。圖5.GS5基因在水稻全生育期不同組織中表達(dá)水平示意圖。使用材料是 NIL(ZS97)和NIL(H94)GS5基因純合材料。圖6.是本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因所用的功能性載體圖PCAMBIA1301骨架。圖7.是本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因單株的粒型和粒重的表現(xiàn)和表型統(tǒng)計(jì)分析。A圖左為中花 11陰性單株粒型，右為陽性單株粒型；B圖為陰性與陽性轉(zhuǎn)基因單株的粒寬統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C和 D圖為陰性與陽性轉(zhuǎn)基因單株的粒寬和千粒重統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
圖8.本發(fā)明克隆的GS5基因的結(jié)構(gòu)示意圖和其自然變異分析。黑色的方框代表 外顯子，細(xì)線代表內(nèi)含子，“ATG”和“TGA”分別是翻譯起始密碼和終止密碼，ATG前的粗線 代表2000bp的啟動(dòng)子，大小粒型形品種間的22個(gè)SNP和InDel變異位于GS5基因的啟動(dòng) 子和編碼區(qū)(SNP替換均用相應(yīng)的堿基代表，InDel缺失均用相應(yīng)的圓點(diǎn)代表)，編碼區(qū)有5 個(gè)氨基酸變異，內(nèi)含子有4個(gè)SNP變異。
具體實(shí)施例方式根據(jù)圖1的技術(shù)路線，從水稻品種珍汕97B(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院顏龍安院士選育和 惠贈(zèng))和H94(上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心的羅利軍研究員惠贈(zèng))組合衍生的雙單倍體群體 里選擇含有GS5基因且55 %遺傳背景與珍汕97B —致的家系(DH27)，與珍汕97B雜交，珍汕 97B為輪回親本，連續(xù)回交3代，自交，構(gòu)建了水稻GS5基因的近等基因系BC3F1。利用一個(gè)含 有288個(gè)BC3F2單株的隨機(jī)群體對(duì)GS5進(jìn)行了定位和遺傳效應(yīng)分析；利用目標(biāo)區(qū)間公共SSR 標(biāo)記對(duì)來自于9639個(gè)單株的大遺傳群體篩選重組單株，最終將GS5定位到C62和C63區(qū)間， 兩者物理距離為8. Okb (圖4)；然后結(jié)合該區(qū)段內(nèi)的一個(gè)全長(zhǎng)cDNA的序列信息，對(duì)GS5的基 因結(jié)構(gòu)和編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)該基因包含10個(gè)外顯子，共編碼481個(gè) 氨基酸，通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)具有PF00450保守結(jié)構(gòu)域。Real-Time PCR表達(dá) 分析發(fā)現(xiàn)，該基因全生育期在各個(gè)組織表達(dá)，并且在穎殼胚乳中寬粒品種(珍汕97B)比小 粒(H94)的表達(dá)量高。預(yù)測(cè)表達(dá)量起重要作用，于是利用RT-PCR獲得H94的cDNA陽性克 隆，亞克隆后，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因超表達(dá)驗(yàn)證，將該基因轉(zhuǎn)入水稻寬粒品種中花11中，轉(zhuǎn)基因Ttl代 陽性超表達(dá)單株均表現(xiàn)出寬的粒形(圖7)，并且其T1代共分離檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，粒寬和表達(dá)量正 相關(guān)。此外，利用水稻兩個(gè)大粒品種(珍汕97B和特青)和兩個(gè)小粒品種(H94和明恢63) 進(jìn)行比較測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在3. 9kb的啟動(dòng)子和cDNA范圍內(nèi)大小粒品種間存在22個(gè)共同的SNP 和InDel差異，其中18個(gè)突變位于啟動(dòng)子區(qū)，4個(gè)突變位于編碼區(qū)的第1、第2和第9個(gè)外 顯子，導(dǎo)致了 5個(gè)氨基酸替換(圖8)。由于超表達(dá)窄粒的等位基因可以使寬粒變得更寬，所 以編碼區(qū)的5個(gè)氨基酸替換不是等位基因變異的原因，進(jìn)而說明了啟動(dòng)子區(qū)的變異是導(dǎo)致 表達(dá)量變化的原因，進(jìn)而導(dǎo)致粒寬變異。以下實(shí)施例進(jìn)一步定義本發(fā)明，并描述了分離克隆GS5基因，遺傳轉(zhuǎn)化，比較測(cè)序 驗(yàn)證GS5等位基因之間序列差異的方法和該基因時(shí)空表達(dá)譜。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施 例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明本質(zhì)和范圍的情況 下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實(shí)施例1 構(gòu)建GS5近等基因系1回交與選擇如附圖2所示，從寬粒水稻品種珍汕97B和窄粒品種H94組合衍生的雙單倍體群 體里選擇含有GS5基因且55%遺傳背景與珍汕97B —致的家系，與珍汕97B雜交，珍汕97B 為輪回親本，連續(xù)回交3代，在BC1F1以及BC2F1代對(duì)GS5只進(jìn)行正向選擇，即選擇目標(biāo)區(qū)段 為珍汕97B/H94雜合基因型的單株用于下一輪的回交。目標(biāo)區(qū)段參照前人的QTL定位結(jié) 果確定在兩個(gè) SSR(Simple Sequence Repeat)標(biāo)記 RM593 和 RM574(參見(http //www, gramene. org/)所界定的區(qū)間內(nèi)。存BC3F1代，除進(jìn)行正向洗擇外，還對(duì)目標(biāo)區(qū)段以外的遺 傳背景進(jìn)行掃描，從中選擇遺傳背景與珍汕97B最為相近的單株的后代(BC3F2，NIL (H94)用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。該近等基因系材料NIL (H94)于2010年5月27日送交湖北省武漢市武漢 大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號(hào)為CCTCC P201007。2微衛(wèi)星標(biāo)記基因型鑒定方法(SSR技術(shù))PCR標(biāo)準(zhǔn)程序參見參見J.薩姆布魯克等，2002,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬 雁等(譯)，科學(xué)出版社介紹的方法。PCR 采用 20 μ 1 的反應(yīng)體系，包含20-50ng DNA 模板，IOmM Tris-HCl, 50mM KCl, 0. 1% Triton X-100,1. 8mM MgCl2,0. ImM dNTP，0.2ym 引物(如上所述的 RM593 和 RM574 的引物，參見 http ://www. gramene. org/)禾口 IU Taq DNA polymerase。PCR 擴(kuò)增的條件為 94°C預(yù)變性 4min ;94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，34 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0 PCR 產(chǎn)物 在6%的聚丙烯酰胺膠上分離后進(jìn)行銀染(Bassam等，1991，Anal. Biochem. 196 80-83)。實(shí)施例2 :GS5的精細(xì)定位和圖位克隆1粒寬的表型測(cè)量谷粒自然干燥后置于室溫下至少放置3個(gè)月以上以保證谷粒的干燥和各株系間 含水量的相對(duì)一致。從每單株中隨機(jī)選取飽滿谷粒10粒，按照同一個(gè)方向肩并肩，不重疊、 不留隙的方式，緊靠擺成一行，用游標(biāo)卡尺讀出寬度，求其平均值即為谷粒寬度。谷粒千粒 重根據(jù)隨機(jī)挑選的200粒飽滿谷粒的重量來估算。從BC3F1單株衍生的BC3F2群體中隨機(jī)挑選了 288單株構(gòu)成一個(gè)隨機(jī)群體?？疾煺?汕97B、H94以及隨機(jī)群體中每個(gè)單株的谷粒寬度等性狀，并用兩端分子標(biāo)記RM593和RM574 確定各株基因型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該性狀在兩親本間都具有顯著差異。在隨機(jī)群體中，谷粒寬度表 現(xiàn)為半不連續(xù)分布(圖3)。以3. 14mm的谷粒寬度為分界線，可分為兩類，即大粒和小粒類 型(表1和圖3)，且對(duì)粒重和單株產(chǎn)量均有顯著影響。本發(fā)明中將寬而重的谷粒稱之為大 粒，另外一種短而輕的谷粒類型稱之為小粒?？ǚ綔y(cè)驗(yàn)表明三種類型符合單個(gè)孟德爾因子 的1 2 1分離比窄粒寬粒=222 66，X2 = 0. 51 < X2qq5i1),表明在此BC3F2群體中， 粒大小是由一個(gè)主效基因控制的，并且小粒等位基因?qū)Υ罅５任换虮憩F(xiàn)為半顯性作用。表1近等基因系中GS5的對(duì)產(chǎn)量性狀的影響分析 2分子標(biāo)記的開發(fā)本發(fā)明中所用到的SSR標(biāo)記信息全部來自于Gramene網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. gramene. org/).此外，還根據(jù)網(wǎng)上公布的粳稻品種Nipponbare的基因組序列(http:// rgp. dna. affrc. ro. jp)以及秈稻品種 93-11 的基因組序列(http //rise, genomics, org. cn/)設(shè)計(jì)和鑒定多態(tài)性標(biāo)記，設(shè)計(jì)原則是在兩者間有2-6bp缺失的、PCR片段大約 有100-200bp長(zhǎng)度、目標(biāo)片段上平均分布了，用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增珍汕97B和H94模板DNA， 4% PAGE膠電泳檢測(cè)，最終設(shè)計(jì)了 13對(duì)在珍汕97B和H94間具有多態(tài)性的Indel (Insert/Deletion)標(biāo)記，用于GS5的精細(xì)定位分析。這些標(biāo)記的序列信息見表4。3重組單株的后代測(cè)驗(yàn)分析和GS5的精細(xì)定位及候選基因確定為進(jìn)一步縮小GS5的定位區(qū)間，從9639株由BC3F1單株衍生的BC3F2大群體中挑選 出重組單株。首先用SSR標(biāo)記RM593和RM574標(biāo)記進(jìn)行篩選，從4374個(gè)單株中共找到94個(gè)重 組單株，這些單株經(jīng)過后代測(cè)驗(yàn)確認(rèn)其上一代的表型每個(gè)重組單株種植24株后代作為一 個(gè)家系，性狀分離的家系說明上一代表型是雜合的，后代性狀不分離且是高值性狀的說明 上一代表型是來至珍汕97B純合的，低值說明上一代表型是來至H94純合的。然后，利用發(fā) 展的13個(gè)InDel標(biāo)記分析這94個(gè)重組單株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在RM574和GS5間存在4個(gè)重組單 株，在RM593和GS5存在90個(gè)重組單株，特別是在C53和GS5間只發(fā)生1次重組，在C62和 GS5間只存在2次重組，而且在C53和C62之間還存在ClO和C23兩個(gè)標(biāo)記與GS5共分離 (圖4)。因此，GS5最終被定位于C53和C62間，該區(qū)間對(duì)應(yīng)于Nipponbare和93-11的基因 組序列上的約8. Okb的物理范圍(圖4)。在C53和C62間(由申請(qǐng)人自己設(shè)計(jì)，參見表4) 所界定的8. Ο-kb范圍內(nèi)找到一條全長(zhǎng)cDNA，編號(hào)為AK106800，來自于日本晴的小花組織， 本發(fā)明克隆的GS5基因的cDNA序列全長(zhǎng)1449bp，與8. Ο-kb范圍內(nèi)的0. 3kb至6. 9kb區(qū)段 完全匹配，因此該cDNA是GS5的唯一可靠候選基因。實(shí)施例3 :GS5的轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)試驗(yàn)1 GS5轉(zhuǎn)基因技術(shù)路線Real-Time PCR表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，該基因全生育期在各個(gè)組織表達(dá)，并且在穎殼胚 乳中寬粒品種(珍汕97B)比小粒(H94)的表達(dá)量高(圖5)，預(yù)測(cè)表達(dá)量起重要作用，于是 根據(jù)預(yù)測(cè)的候選基因全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)帶有限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和PstI接頭 的RT-PCR特異引物(表4)擴(kuò)增H94的cDNA片段，連接到TA克隆Promega T載體上，挑選 出含有候選基因的無突變的正確克隆，利用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI and PstI酶切陽性 克隆，進(jìn)行亞克隆，再連接到雙元超表達(dá)載體PCAMBIA1301S) (pCAMBIA1301多克隆位點(diǎn)旁 加一 35S強(qiáng)啟動(dòng)子)上；另外，用同樣的方法將珍汕97B啟動(dòng)子融合H94編碼區(qū)的轉(zhuǎn)基因 (ZpHc)連接到雙元超表達(dá)載體pCAMBIA1301(圖6)上。采用轉(zhuǎn)基因的方法，將得到的正確 克隆的質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入到水稻品種中花11中，經(jīng)過誘導(dǎo)、繼 代、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因的水稻小 植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(粳稻亞種)遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人報(bào)道的方法(參見 Efficient transformation of rice, Oryza sativaL，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA,1994, PlantJournal 6 271-282) 基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制的方法如下所述(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下 6-BA(6-BenzyIaminoPurine,6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧節(jié)青霉素)； KT (Kinetin,激動(dòng)素) ；NAA (Napthalene acetic acid, ΜΖλΜ) ； IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)； AS(Acetosringone, ZilitT#Sll ) ；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜)；N6max (N6 大量元素 成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS微量 元素成分溶液)鉬酸鈉(Na2Mo04· 2H20)硫酸銅(CuSO4· 5H20)氯化鈷(CoCl2· 6H20)
0. 025 克 0. 0025 克 0. 0025 克將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升，室溫儲(chǔ)存。7)2，4_D貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取2，4_D 100毫克，用1毫升IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶 解完全后定容至100毫升，于室溫下保存。8) 6-BA貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取6-BA 100毫克，用1毫升IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶 解完全后定容至100毫升，室溫保存。9)萘乙酸(NAA)貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取NAA 100毫克，用1毫升IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解 完全后定容至100毫升，4°c避光保存。10)吲哚乙酸(IAA)貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取IAA 100毫克，用1毫升IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解 完全后定容至100毫升，4°c避光保存。11)葡萄糖貯存液(0. 5克/毫升)的配制秤取葡萄糖125克，然后用蒸餾水溶解定容至250毫升，滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?2) AS貯存液的配制秤取AS 0. 392克，加入DMSO 10毫升溶解，分裝至1. 5毫升離心管內(nèi)，_20°C保存13) IN氫氧化鉀貯存液配制秤取氫氧化鉀5. 6克，用蒸餾水溶解定容至100毫升，室溫保存?zhèn)溆谩?3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(取已經(jīng)制備好的IOX濃縮液，下同)100毫升N6mix母液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)10毫升Fe2+EDTA貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)10毫升維生素貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)10毫升2，4_D貯存液(取上述制備好的)2. 5毫升脯氨酸(Proline)0. 3 克CH0.6 克蔗糖(Sucrose)30 克Phytagel(分開加，需加熱溶解，下同)3克加蒸餾水至900毫升，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分 裝到50毫升三角瓶(30毫升/瓶)，封口后按常規(guī)方法滅菌(例如121°C下滅菌15分鐘， 下述的培養(yǎng)基滅菌方法與本培養(yǎng)基的滅菌方法相同)。2)繼代培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)100 毫升
N6mix 母液(100X)10毫升
Fe2+EDTA 貯存液(100X)10 1■升
維生素貯存液(100X)10 _升
2，4-D貯存液2. 0 _升
脯氨酸0· 5克
CH0.6克
蔗糖30克
Phytagel3克0128] 加蒸餾水至900毫升，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分 裝到50毫升三角瓶(30毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
0137]
0138]
0139]
3)預(yù)培養(yǎng)基(粳稻可以不做這-
涉) 12. 5毫升 1. 25毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 75毫升
CH0. 15 克
蔗糖5克
瓊脂粉(Agar)1. 75克
加蒸餾水至250毫升，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口，按上述方法滅菌。 使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒
N6fflax 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 貯存液(100X) 維生素貯存液(100X) 2，4-D貯存液
入培養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。
0140]
0141]
0142]
0143]
0144]
4)懸浮培養(yǎng)基 N6fflax 母液(IOX) N6mix 母液(100X)
5毫升 0.5毫升 0.5毫升 1毫升 0. 2毫升 0. 08 克 2克
0148] 加蒸餾水至100毫升，調(diào)節(jié)pH值到5. 4，分裝到兩個(gè)100毫升的三角瓶中，封口，按 上述方法滅菌。
Fe2+EDTA 貯存液(100X) 維生素貯存液(100X)
0145]2，4_D 貯存液
0146]CH
0147]蔗糖
0149]
0150]
0151]
0152]
0153]
0154]
0155]
使用前加入1毫升無菌葡萄糖貯存液和100微升AS貯存液。 5)共培養(yǎng)基
N6fflax 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 貯存液(100X) 維生素貯存液(100X) 2，4-D貯存液
12. 5毫升 1. 25毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 75毫升
110156]CH0.2 克
0157]蔗糖5克
0158]瓊脂粉1.75克
0159]加蒸餾水至250毫升，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口，按上述方法滅菌。
0160]使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒
入培養(yǎng)皿中(25毫升/每皿)。
6)篩選培養(yǎng)基
N6fflax 母液(IOX)25毫升
N6mix 母液(100X)2. 5毫升
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2. 5毫升
維生素貯存液(100X)2. 5毫升
2，4-D貯存液0. 625毫升
CH0. 15 克
蔗糖7. 5克
瓊脂粉1. 75 克
加蒸餾水至250毫升，調(diào)節(jié)pH值到6. 0，封口，按上述方法滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250微升HN (50毫克/毫升)和400微升CN (10克CN/36毫升水)分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升,/皿)。(注第一次選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為400毫克/升，第二次及以后選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為250毫克/升)。
7)預(yù)分化培養(yǎng)基(粳稻可以不做這一步)
N6fflax 母液(IOX)25毫升
N6mix 母液(100X)2. 5毫升
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2. 5毫升
維生素貯存液(100X)2. 5毫升
6-BA貯存液0.5毫升
KT貯存液0.5毫升
NAA貯存液50微升
IAA貯存液50微升
CH0. 15 克
蔗糖7. 5克
瓊脂粉1. 75 克
加蒸餾水至250毫升，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封口，按上述方法滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，250微升HN (50毫克/毫升)250微升CN (250毫克/毫升)，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/皿)。
8)分化培養(yǎng)基
N6fflax 母液(IOX)100毫升
N6mix 母液(100X)10毫升
Fe2+EDTA 貯存液(100X)10毫升
維生素貯存液(100X)10毫升
6-BA 貯存液KT貯存液NAA貯存液IAA貯存液CH
1克 30克 3克
0.2毫升 0.2毫升
2毫升 2毫升蔗糖Phytagel加蒸餾水至900毫升，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. 0。煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到100毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口， 按上述方法滅菌。9)生根培養(yǎng)基加蒸餾水至900毫升，用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述 方法滅菌。(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟3. 1愈傷誘導(dǎo)1)將成熟的中花11水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯 化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；2)用滅菌水洗種子4-5次；3)將8-10粒種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；4)將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4-5周，溫度26士 1°C。3. 2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫 度 25 士 1°C。3. 3 預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度 26 士 1°C。3. 4農(nóng)桿菌培養(yǎng)1)在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基(LA培養(yǎng)基的配制參照J(rèn).薩姆布魯克等，分 子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，2002，北京)上劃線預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌 EHA105(該菌株來自CAMBIA公司公開使用的農(nóng)桿菌菌株)兩大，溫度28°C ；2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。3. 5農(nóng)桿菌侵染1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅好菌的瓶子內(nèi)；MSmax 母液(IOX)MSmix 母液(100X)Fe2+EDTA 貯存液(100X)維生素貯存液(100X)蔗糖Phytagel
50毫升 5毫升 5毫升 5毫升 20克 3克
2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至0D6000. 8-1. 0 ；3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度 19-20 "C。3. 6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；2)浸泡在含400毫克/L羧芐青霉素(CN)的滅菌水中搖30分鐘；3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次2周至長(zhǎng)出好的抗性愈傷。3. 7 分化1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上于黑暗處培養(yǎng)5-7天；2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，每瓶平均分布三個(gè)獨(dú)立的愈傷，光照 下培養(yǎng)5周-6周至長(zhǎng)出大的苗子，溫度26°C。3. 8生根與煉苗1)剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的老根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周至長(zhǎng)出大的苗子后去掉封口膜 加部分自來水煉苗一周再移栽，溫度26°C。3. 9 移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保 持水分濕潤(rùn)，等長(zhǎng)勢(shì)很壯再移栽至大田。本發(fā)明共獲得獨(dú)立轉(zhuǎn)基因Over-expression T0代水稻植株37株，包括18株陽性 單株和19株陰性單株。所獲得的T1代水稻植株以Z3-22家系為例；珍汕97啟動(dòng)子融合 H94編碼區(qū)(ZpHc)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因Ttl代水稻植株28株，包括18株陽性單株和10株陰性單株。 兩種轉(zhuǎn)基因水稻陽性和陰性植株的粒寬和粒重(圖7)有差異顯著(P < 0. 001)。根據(jù)轉(zhuǎn) 基因Ttl代陽性超表達(dá)單株均表現(xiàn)出更寬的粒形(圖6)，并且其T1代共分離檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，粒寬 和表達(dá)量正相關(guān)(表2)，證明了該唯一的候選基因就是GS5 QTL.另外，珍汕97B啟動(dòng)子融 合H94編碼區(qū)的轉(zhuǎn)基因和上述結(jié)果一致，均能增加粒寬和粒重這一表型(圖7)，互補(bǔ)成功， 該QTL基因被成功克隆，并且說明啟動(dòng)子區(qū)是GS5遺傳變異的原因。由于該基因超標(biāo)達(dá)使 得種子變大，說明GS5是一個(gè)粒形和粒重的正調(diào)控因子，這和其控制粒形的基因(GS3，GW2， qSW5)不同，它們多是負(fù)調(diào)控種子大小(Fan 等，2006，Theor. Appl. Genet. 112 :1164_1171 ； Takano-Kai ^,2009, Genetics 182 1323-34 ；Song φ,2007, Nature Genetics 39 623-630 ；Shomura 等，2008，Nature Genetics 40 1023-1028 ；Weng 等，2008，CellRes. 18 1199-209)。同時(shí)也證明了這個(gè)基因可以通過遺傳轉(zhuǎn)化來改良水稻品種。2 GS5功能預(yù)測(cè)根據(jù) InterProScan(http//www. ebi. ac. uk/InterProScan/)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行 預(yù)測(cè)，GS5基因(H94)編碼的蛋白質(zhì)由480個(gè)氨基酸組成，包含一個(gè)大的保守的PF00450 結(jié)構(gòu)域。利用BLASTp對(duì)GS5基因編碼的由480個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行搜索，發(fā) 現(xiàn)該基因編碼一絲氨酸羧肽酶，屬于SlO蛋白家族，，以前的研究表明該酶家族參與種子的 萌發(fā)和發(fā)育、植株的生長(zhǎng)與發(fā)育、植株次級(jí)代謝以及植物的生物和非生物脅迫反應(yīng)(Degan等，1994，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :8209_8213 ；Washio 等，1994，Plant Physiol. 105 1275-1280 ；Li 等，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,5916-5921 ；Shirley 等，2003， J. Biol. Chem. 278 19870-19877 ；Mehta 等，1996，Plant Physiol. 110 ；883-892)。實(shí)施例5 比較測(cè)序確定GS5等位基因間的自然變異1序列測(cè)定兩個(gè)大粒品種(珍汕97B和特青)和兩個(gè)小粒品種(明恢63和H94)進(jìn)行目標(biāo) 區(qū)段的測(cè)序。利用10對(duì)PCR產(chǎn)物相互部分重疊的引物(表3)，采用高保真度的LA-Taq和 rTag (購(gòu)自日本TakaRa公司)從這些品種的基因組中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后按照美國(guó)Perkin Elmer公司的測(cè)序試劑盒(Big Dye Kit)進(jìn)行PCR測(cè)序。使用Sequencher 4. 5軟件(美 國(guó)Gene Codes Corporation)拼接序列。該兩個(gè)等位基因的DNA序列如SEQ ID N0:1(珍 汕 97B)和 SEQ ID NO :3(H94)所示。表2GS5轉(zhuǎn)基因T1代共分離檢測(cè)分析 2發(fā)生自然變異的序列比較目標(biāo)區(qū)段間的序列比較分析在兩個(gè)大粒品種(珍汕97B和特青)和兩個(gè)小粒品種 (明恢63和H94)間進(jìn)行(圖8)，發(fā)現(xiàn)在3. 9kb的啟動(dòng)子和cDNA范圍內(nèi)大小粒品種間存在 20個(gè)共同的SNP和InDel差異，其中18個(gè)突變位于啟動(dòng)子區(qū)，4個(gè)突變位于編碼區(qū)的第1、 第2和第9個(gè)外顯子，導(dǎo)致了 5個(gè)氨基酸變異(圖8)，還有4個(gè)突變位于內(nèi)含子區(qū)。由于超 表達(dá)窄粒的等位基因可以使寬粒變得更寬，所以編碼區(qū)的5個(gè)氨基酸替換不是等位基因變 異的原因，ZcHp轉(zhuǎn)化片段進(jìn)而說明了啟動(dòng)子區(qū)的變異是導(dǎo)致表達(dá)量變化的原因，進(jìn)而導(dǎo)致 粒寬和千粒重的變異。表3用于本發(fā)明比較測(cè)序的引物 表4用于本發(fā)明圖位克隆和基因功能分析的引物
權(quán)利要求
一種控制水稻谷粒粒寬和粒重性狀的主效基因GS5，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的基因GS5，它的編碼序列如序列表SEQID NO 1中第2001-3449 位對(duì)應(yīng)的核苷酸所示。
3.如權(quán)利要求1所述的基因GS5的等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO 3 所示。
4.如權(quán)利要求3所述的等位基因，它的編碼序列如序列表SEQID NO :3中第2004-3446 位對(duì)應(yīng)的核苷酸所示。
5.適用于權(quán)利要求1所述基因的啟動(dòng)子，它的核苷酸序列如序列表SEQID N0:1中 1-1834位對(duì)應(yīng)的核苷酸所示。
6.適用于權(quán)利要求3所述基因的啟動(dòng)子，它的核苷酸序列如序列表SEQID N0:3中 1-1837位對(duì)應(yīng)的核苷酸所示。
7.權(quán)利要求1或2所述的基因在作物遺傳改良中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求3或4所述的基因在作物遺傳改良中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求5所述的啟動(dòng)子在作物遺傳改良中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求6所述的啟動(dòng)子在作物遺傳改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。公開了分離克隆的控制水稻谷粒粒寬和粒重性狀的主效基因GS5，以及它的等位基因的DNA序列，所述序列如SEQ ID NO1(珍汕97B)和SEQ ID NO3(H94)所示，包含10個(gè)外顯子。它們的氨基酸序列如SEQ ID NO2和SEQ IDNO4所示。利用水稻兩個(gè)大粒品種和兩個(gè)小粒品種比較測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在約6.1kb范圍內(nèi)大、小粒品種間存在22個(gè)共同的堿基差異，其中18個(gè)突變位于啟動(dòng)子區(qū)，4個(gè)突變位于編碼區(qū)，導(dǎo)致5個(gè)氨基酸變化。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)GS5基因的水稻植株，轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)出比對(duì)照粒寬和粒重顯著提高。這些性狀變化與珍汕97的GS5近等基因系兩基因型的表現(xiàn)非常吻合。本發(fā)明還公開了近等基因系選育、基因克隆和轉(zhuǎn)基因的方法即應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101880671SQ201010188458
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者何予卿, 張啟發(fā), 李一博, 范楚川, 邢永忠 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)