專利名稱：胡楊PeCBL10基因的功能分析與利用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明設計涉及來自胡楊(Populus euphratica Olive)的PeCBLlO基因功能分
析與應用。
背景技術：
胡楊(Populus euphratica Olive)是唯一能在干旱鹽堿和溫差劇烈變化的干旱沙漠地區(qū)生長的喬木建群樹種。作為天然的抗逆性極強的典型植物，胡楊已引起國際學術界的重視。研究、開發(fā)和利用胡楊抗逆性基因資源，對于深入林木抗逆性機理以及定向培育抗逆林木新品種具有重要的價值。鈣離子作為細胞內的第二信使在信號轉導過程中起著重要作用。鈣離子作為細胞內的第二信使在信號轉導過程中起著重要作用。鈣調素B蛋白家族，它是類似于酵母和動物體內的鈣調磷酸酶B的一類蛋白，簡稱CBUCalcineurin B-Iike Proteins)，CBL雖然能結合Ca2+，但自身沒有激酶域，必須和其靶蛋白作用才能發(fā)揮其功能。研究表明，CBL在植物逆境脅迫及信號傳導過程中起到重要作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供胡楊中的一種與逆境相關的CBL基因，該基因在胡楊中克隆，在抗鹽反應中具有重要作用。本發(fā)明所提供的CBL基因來源于胡楊，是CBL基因家族中的一個，命名為PeCBLlO。序列表中序列氨基酸殘基序列是由258個氨基酸殘基組成的蛋白質。逆境相關基因PeCBLlO是下列核苷酸序列之一序列表中序列1的DNA序列。與序列中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的 DNA序列。序列表中序列1的DNA序列由777個堿基組成，為該基因的開放讀碼框序列，其表達受到鹽的誘導。本發(fā)明所提供的逆境相關基因PeCBLlO，使用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的表達載體(包括雙元農桿菌載體以及用于單子葉植物微彈轟擊的載體)轉化植株，可獲得對高鹽脅迫抗性增強的轉基因植株。本發(fā)明的基因在構建到植物表達載體中時， 在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種強啟動子或誘導型啟動子。本發(fā)明的基因在構建到植物表達載體中時，可以使用增強子，但是必須與編碼序列的閱讀框相同，要保證整個序列的翻譯。為了便于對轉基因植物細胞或植株進行鑒定及篩選，可以在構建載體時對載體進行加工，例如加入可選擇性標記，通常使用的可選擇性標記可以是編碼對抗生素(包括慶大霉素、卡那霉素、潮霉素)抗性酶的基因和生物安全標記(甘露糖)，也可以是⑶S、GFP等可以產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因等。攜帶有本發(fā)明的逆境相關基因PeCBLlO基因的表達載體可以通過多種方法轉化植物宿主，以培育抗鹽的植物品種，例如Ti質粒、Ri質粒、電穿孔、微注射、植物病毒載體、 直接DNA轉化或植物病毒載體等，所轉化的植物宿主可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物。下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖一是通過RT-PCR技術克隆得到的基因全長電泳圖，圖中M為markerIII，1為與逆境相關的基因PeCBLlO ；圖二為PeCBLlO基因在高鹽條件下RT-PCR檢測結果。
具體實施例方式實施例1，胡楊總RNA的提取用CTAB (薩姆布魯克，分子克隆實驗指南，第三版)的方法從鹽處理的胡楊中提取總 RNA。實施例2，胡楊PeCBLlO cDNA序列的克隆總RNA用逆轉錄酶反轉錄合成cDNA，然后用引物PCBL10-1 (GGATCCATGGATTTCAAC AACAACAACAG)和 PCBL10-2 (GGATCCAAATCCTCAACCTCAGTGTTGAA)對該 cDNA 進行 PCR。PCR 程序為(1) 940C，變性5分鐘。(2) PCR擴增，33個循環(huán)-MV，變性45秒；59°C退火45秒； 72 0C，延伸45秒；(3) 72 0C，延伸10分鐘。將PCR產物用瓊脂糖進行電泳分離，然后用天根的瓊脂糖DNA分離試劑盒回收目的片斷并與TaKaRa公司的pMD18載體進行連接，連接的反應體系為目的片斷4μ 1，1μ 1 pMD18vector,5y 1 Solution I，于160C過夜連接，再將連接產物轉化進感受態(tài)的大腸桿菌ToplO，用PCR的方法檢測陽性菌株，最后取轉化成功的菌株在上海生工進行DNA序列測定。實施例3，胡楊PeCBLlO基因在逆境中的表達特性對于從新疆取得的兩年生胡楊植株，分別進行鹽處理，根據實驗設計的時間取葉片，經液氮速凍，提取RNA作RT-PCR分析，RT-PCR反應以胡楊的Actin2為對照，以控制PCR 反應中模板cDNA的濃度一致，結果如圖2所示。實施例4、胡楊PeCBLlO基因表達載體的構建用兩頭加有BamH I酶切位點接頭的引物從含有其cDNA序列的克隆載體上進行PCR，得到的產物連接到克隆載體上，菌落鑒定后將得到的陽性克隆搖菌、提質粒，并用 BamH I酶切3小時，同時提取pBI121質粒，也用BamH I酶切3小時將得到的酶切產物用 T4連接酶16°C過夜連接，分別轉化大腸桿菌ToplO，得到的正向和反向的陽性產物進一步轉化農桿菌EH105A。序列表序列表1ATGCTTGCTACCTCCACGGATTTCAACAACAACAACATCAGCAGATCACCTAGATTGAGT序列表2 MLATSTDFNNNNISRSPRLS61TCTTTGACGATTGGGGAGCGGATCTGTGCCTCGTGTATACCATTTGCGGCCATCACTGAG21SLTIGERICASCIPFAAITE121ATTTTCATTCTGGCTGTTGGTAATTGCTTTGAGTGCCGGCCATGTGTTAAAAGAAATCGA
41IFILAVGNCFECRPCVKRNR181TGTGGTTTCCTAGATATAGCTCGCCTTGCCGATGGATCTCGATTTACTGTTAATGAAGTG61CGFLDIARLADGSRFTVNEV241GAGGCCTTGTACGAGCTGTATAAGAAGTTGAGTAACTCGATAATCAAAGATGGCTTGATT81EALYELYKKLSNSIIKDGLI301CATAAGGAAGAGCTTCAATTAGCACTATTCCGAGCTCCTCATGGCGAGAATCTTTTTCTA101HKEELQLALFRAPHGENLFL361GACAGGCTTTTTGATCTTTTTGATGAAAAGAGAAATGGTGTAATCGAATTTGAGGAATTT121DRLFDLFDEKRNGVIEFEEF421GTCCGTGCACTCAATGTGTTCCATCCCTACGCACCCATGGAAGAAAAAATTGATTTTGCA141VRALNVFHPYAPMEEKIDFA481TTCAGGCTGTACGACCTGAGACAAACTGGGTTCATTGAACGAGAGGAAGTTAAGCAAATG161FRLYDLRQTGFIEREEVKQM541GTGATTGCCATTTTATTGGAATCTGATGTGAAATTGCCAGAAGATCTTTTGGAGGCTATC181VIAILLESDVKLPEDLLEAI601ATAGACAAGACATTTGCTTATGCCGATGCCGACAAGGATGGTAAAATCAACAAAGAAGAA201IDKTFAYADADKDGKINKEE661TGGAAGGCTTTTGTGGTTCGACATCCAAATCTATTGAACAACATGACTCTTCCTTATCTG221WKAFVVRHPNLLNNMTLPYL721AAGGACATAAGCACTGTCTTTCCAAGCTTTATTTTCAACACTGGGGTTGAGGATTGA241KDISTVFPSFIFNTGVED*
權利要求
1.胡楊的逆境相關基因PeCBLlO，它具有與序列表中序列2的氨基酸殘基序列獲將序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的基因，其特征在于它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
3.胡楊抗逆境相關基因PeCBLlO，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列。2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的 DNA序列。
4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于所述胡楊抗逆基因PeCBLlO的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.權利要求4所述的基因，其開放閱讀框是自5’端第1到第777位堿基。
6.含有權利要求3所述的基因的表達載體。
7.含有權利要求3所述的基因的細胞系。
8.權利要求3所述的基因在培育抗鹽植物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個胡楊(Populus euphratica Olive)的逆境相關基因CBL基因，該基因在植物抗鹽中有重要作用，本發(fā)明將提供的CBL基因命名為PeCBL10，具有與序列表2的氨基酸序列或將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。逆境相關基因PeCBL10，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。本發(fā)明的PeCBL10基因在培育抗鹽植物品種中具有重要作用。
文檔編號A01H5/00GK102382842SQ201010272659
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月6日 優(yōu)先權日2010年9月6日
發(fā)明者夏新莉, 尹偉倫, 李旦旦 申請人:夏新莉, 尹偉倫, 李旦旦