專利名稱：一種霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生的方法。
背景技術(shù)：
%^\^%iDendrobium huoshanense C. Ζ. Tang et S. J. Cheng)，又名霍石角斗、 霍斛、米斛，隸屬蘭科石斛屬，具有益精強(qiáng)陰、生津止渴、補(bǔ)虛贏、除胃中虛火之功效，被歷代本草推崇為石斛中的上品，深受現(xiàn)代人們的青睞。但是，霍山石解的生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境要求極其嚴(yán)格，加之歷代藥農(nóng)的采集及近代生態(tài)環(huán)境的改變，野生霍山石解資源瀕臨滅絕，現(xiàn)在只有極少量被移栽在霍山縣長(zhǎng)沖藥材場(chǎng)。霍山石斛雖然開花多，但結(jié)果少，而且霍山石斛的種子胚未分化、無胚乳，導(dǎo)致萌發(fā)率極低。無法滿足規(guī)?；斯ぴ耘嗟男枨蟆Ｖ参锝M織培養(yǎng)技術(shù)中的體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)，能夠提供繁殖數(shù)量大、繁殖速度快、后代遺傳性狀穩(wěn)定的體細(xì)胞胚。 體細(xì)胞胚具有和植株同樣的物質(zhì)代謝和形態(tài)發(fā)育潛能，可用來代替原藥材生產(chǎn)相關(guān)的活性物質(zhì)。因此，體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)受到了廣泛關(guān)注。霍山石斛體細(xì)胞胚的發(fā)生技術(shù)為霍山石斛藥用價(jià)值的持續(xù)利用和種質(zhì)資源的有效保護(hù)提供了一種重要手段。石斛體細(xì)胞胚的發(fā)生是間接方式，即體細(xì)胞胚是從愈傷組織發(fā)育而成的，當(dāng)前， 該發(fā)生方式存在以下不足(1)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)需要添加外源激素，外源激素將通過體細(xì)胞胚富集到完整植株中，克隆植株中殘留的外源激素對(duì)人體健康潛伏著嚴(yán)重的危害； (2)體細(xì)胞胚發(fā)育階段不一致、同步性很小(低于50%)、大小差異較大、再生植株的存活率很低(小于10%)。因此，難以滿足霍山石斛體細(xì)胞胚的規(guī)自動(dòng)化生產(chǎn)及大面積人工栽培種苗的需要。本專利通過控制培養(yǎng)基的氧化還原電位以誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織，胚性愈傷組織在控制一定濕度的環(huán)境中發(fā)生為霍山石斛體細(xì)胞，通過過篩法、饑餓法或后期液體培養(yǎng)法獲得大量同步化的霍山石斛體細(xì)胞胚，這方面的技術(shù)目前尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
霍山石斛是一種傳統(tǒng)而名貴的保健藥材，其野生資源瀕臨滅絕。為了解決現(xiàn)有霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)中存在的愈傷組織的誘導(dǎo)需要外源激素，體細(xì)胞胚發(fā)育階段不一致、同步性很小、大小差異較大導(dǎo)致再生植株的存活率很低等問題，本發(fā)明提供的一種霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生的方法。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)解決方案如下
一種霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生的方法包括以下操作步驟 (1)無菌試管苗的誘導(dǎo)
取霍山石斛成熟果實(shí)，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉水溶液進(jìn)行表面消毒60 min，再用無菌雙蒸餾水沖洗3 5次，然后切開果實(shí)，取出種子，并將種子撒在固體MS培養(yǎng)基上， 于溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2000 3000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下培養(yǎng)6 7個(gè)月，獲得4-6 cm長(zhǎng)的霍山石斛無菌試管苗；(2)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)
取無菌試管苗的帶節(jié)的莖段的形態(tài)學(xué)下端，插入氧化還原電位為-0. 03 -0. 02伏的固體透導(dǎo)培養(yǎng)基中，于溫度22士2°C、黑暗中誘導(dǎo)培養(yǎng)20 25天，得胚性愈傷組織；
(3)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)
將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到固體MS培養(yǎng)基中，在相對(duì)濕度為70 85%、溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2000 3000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，轉(zhuǎn)接到固體MS培養(yǎng)基中，在相對(duì)濕度為70 85%、溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2000 3000勒克斯、每天光照12 小時(shí)的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3周；按本步驟的誘導(dǎo)操作條件連續(xù)轉(zhuǎn)接10 15次，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基為固體MS培養(yǎng)基，得體細(xì)胞胚；
(4)體細(xì)胞胚的同步化增殖
將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到液體MS培養(yǎng)基或固體MS培養(yǎng)基中，在溫度22士2°C、光照強(qiáng)度 2000 3000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下，采用過篩法或饑餓法同步化增殖培養(yǎng)，得霍山石斛體細(xì)胞胚。所述固體透導(dǎo)培養(yǎng)基是在固體MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 100 mg/ L的磷酸鈉。所述過篩法按如下步驟操作將液體培養(yǎng)25天的體細(xì)胞胚先通過10目篩，收集透過的體細(xì)胞胚繼續(xù)培養(yǎng)5天后再通過20目篩，收集截留的體細(xì)胞胚；所述饑餓法按如下步驟操作將體細(xì)胞胚在新鮮MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天后，用無菌的10目篩過濾，透過的體細(xì)胞胚再用20目篩過濾，將截留的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到無鐵鹽的MS培養(yǎng)中饑餓培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)入新鮮的MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5天。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)
(1)本發(fā)明通過取無菌試管苗的帶節(jié)的莖段的形態(tài)學(xué)下端為外殖體，并控制誘導(dǎo)培養(yǎng)基的氧化還原電位，而不需要添加外源激素誘導(dǎo)獲得霍山石斛胚性愈傷組織，避免了外源激素通過體細(xì)胞胚富集到完整植株中而危害人體健康；
(2)本發(fā)明通過控制環(huán)境濕度使胚性愈傷組織發(fā)生為體細(xì)胞胚，達(dá)到球形體細(xì)胞胚一致性90%以上，再生植株存活率85%以上；
(3)本發(fā)明操作工藝簡(jiǎn)單，不受時(shí)間、季節(jié)限制，可在室內(nèi)工廠自動(dòng)化生產(chǎn)霍山石斛體細(xì)胞胚及試管苗以供生產(chǎn)栽培的需要，實(shí)現(xiàn)霍山石斛藥用價(jià)值的持續(xù)利用和種質(zhì)資源的有效保護(hù)。


圖1為步驟1取得的霍山石斛無菌試管苗圖。圖2為步驟2取得的胚性愈傷組織圖。圖3為步驟3取得的體細(xì)胞胚圖。圖4為本發(fā)明培養(yǎng)的霍山石斛體細(xì)胞胚圖。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。實(shí)施例1 一種霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生的方法包括以下操作步驟 步驟1、無菌試管苗的誘導(dǎo)
取產(chǎn)于安徽省霍山縣太平畈鄉(xiāng)的野生霍山石斛成熟果實(shí)，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉水溶液進(jìn)行表面消毒60 min，再用無菌雙蒸餾水沖洗3次，然后切開果實(shí)，取出種子， 并將種子撒在MS固體培養(yǎng)基上，于溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下培養(yǎng)7個(gè)月，獲得4 cm長(zhǎng)的霍山石斛無菌試管苗，見圖1。步驟2、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)
取無菌試管苗的帶節(jié)的莖段的形態(tài)學(xué)下端，插入控制氧化還原電位為-0. 02伏的固體透導(dǎo)培養(yǎng)基中，于溫度22士2°C、黑暗中誘導(dǎo)培養(yǎng)20天，得胚性愈傷組織，見圖2。固體透導(dǎo)培養(yǎng)基是在固體MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 mg/L的磷酸鈉。步驟3、體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)
將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到的新鮮的固體MS培養(yǎng)基中，在相對(duì)濕度為70%、溫度22士2°C、 光照強(qiáng)度3000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到新鮮的固體MS培養(yǎng)基中，在相對(duì)濕度為70%、溫度22士2°C、光照強(qiáng)度3000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3周；按本步驟的誘導(dǎo)操作條件連續(xù)轉(zhuǎn)接10次，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基為固體MS培養(yǎng)基，得體細(xì)胞胚，見圖3。步驟4、體細(xì)胞胚的同步化增殖
將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到新鮮的固體MS培養(yǎng)基中，在溫度22士2°C、光照強(qiáng)度3000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下，采用饑餓法同步化增殖培養(yǎng)，具體操作如下將體細(xì)胞胚在新鮮固體MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天后，用無菌的10目篩過濾，透過的體細(xì)胞胚再用20目篩過濾， 將截留的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到無鐵鹽的固體MS培養(yǎng)中饑餓培養(yǎng)2天后。轉(zhuǎn)入新鮮的固體MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5天，得霍山石斛體細(xì)胞胚，見圖4。實(shí)施例2:
一種霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生的方法包括以下操作步驟
步驟1、無菌試管苗的誘導(dǎo)取產(chǎn)于安徽省霍山縣太平畈鄉(xiāng)的野生霍山石斛成熟果實(shí)， 先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%次氯酸鈉水溶液進(jìn)行表面消毒60 min，再用無菌雙蒸餾水沖洗5次，然后切開果實(shí)，取出種子，并將種子撒在MS固體培養(yǎng)基上，于溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2500勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下培養(yǎng)7個(gè)月，獲得5 cm長(zhǎng)的霍山石斛無菌試管苗。步驟2、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)取無菌試管苗的帶節(jié)的莖段的形態(tài)學(xué)下端，插入控制氧化還原電位為-0. 03伏的固體透導(dǎo)培養(yǎng)基中，于溫度22士2°C、黑暗中誘導(dǎo)培養(yǎng)25天， 得胚性愈傷組織；固體透導(dǎo)培養(yǎng)基是在固體MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg/L的磷酸鈉。步驟3、體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到的新鮮的固體MS培養(yǎng)基中，在相對(duì)濕度為80%、溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到新鮮的固體MS培養(yǎng)基中，在相對(duì)濕度為80%、溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3周；按本步驟的誘導(dǎo)操作條件連續(xù)轉(zhuǎn)接15次，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基為固體MS培養(yǎng)基，得體細(xì)胞胚。步驟4、體細(xì)胞胚的同步化增殖將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到新鮮的液體MS培養(yǎng)基中，在溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下，采用饑餓法同步化增殖培養(yǎng)，具體操作如下將體細(xì)胞胚在新鮮液體MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天后，用無菌的10目篩過濾，透過的體細(xì)胞胚再用20目篩過濾，將截留的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到無鐵鹽的液體MS培養(yǎng)中饑餓培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)入新鮮的液體MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5天，得霍山石斛體細(xì)胞胚。實(shí)施例3
一種霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生的方法包括以下操作步驟
步驟1、無菌試管苗的誘導(dǎo)取產(chǎn)于安徽省霍山縣太平畈鄉(xiāng)的野生霍山石斛成熟果實(shí)， 先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%次氯酸鈉水溶液進(jìn)行表面消毒60 min，再用無菌雙蒸餾水沖洗4次，然后切開果實(shí)，取出種子，并將種子撒在MS固體培養(yǎng)基上，于溫度22士2°C、光照強(qiáng)度3000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下培養(yǎng)6個(gè)月，獲得6 cm長(zhǎng)的霍山石斛無菌試管苗。步驟2、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)取無菌試管苗的帶節(jié)的莖段的形態(tài)學(xué)下端，插入控制氧化還原電位為-0. 02伏的固體透導(dǎo)培養(yǎng)基中，于溫度22士2°C、黑暗中誘導(dǎo)培養(yǎng)22天， 得胚性愈傷組織。固體透導(dǎo)培養(yǎng)基是在固體MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 mg/L 的磷酸鈉。步驟3、體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到的新鮮的固體MS培養(yǎng)基中，在相對(duì)濕度為85%、溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2500勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到新鮮的固體MS培養(yǎng)基中，在相對(duì)濕度為85%、溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2500勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3周；按本步驟的誘導(dǎo)操作條件連續(xù)轉(zhuǎn)接13次，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基為固體MS培養(yǎng)基，得體細(xì)胞胚。步驟4、體細(xì)胞胚的同步化增殖將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到新鮮的液體MS培養(yǎng)基中，在溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2500勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下，采用過篩法同步化增殖培養(yǎng)，具體操作如下體細(xì)胞胚在新鮮液體MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天后，將體細(xì)胞胚通過無菌的 10目篩，收集透過的體細(xì)胞胚在新鮮的液體MS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5天后再通過無菌的20 目篩，收集截留的體細(xì)胞胚，即得霍山石斛體細(xì)胞胚。
權(quán)利要求
1.一種霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生的方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)無菌試管苗的誘導(dǎo)取霍山石斛成熟果實(shí)，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉水溶液進(jìn)行表面消毒60 min，再用無菌雙蒸餾水沖洗3 5次，然后切開果實(shí)，取出種子，并將種子撒在固體MS培養(yǎng)基上， 于溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2000 3000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下培養(yǎng)6 7個(gè)月，獲得4-6 cm長(zhǎng)的霍山石斛無菌試管苗；(2)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)取無菌試管苗的帶節(jié)的莖段的形態(tài)學(xué)下端，插入氧化還原電位為-0. 03 -0. 02伏的固體透導(dǎo)培養(yǎng)基中，于溫度22士2°C、黑暗中誘導(dǎo)培養(yǎng)20 25天，得胚性愈傷組織；(3)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到固體MS培養(yǎng)基中，在相對(duì)濕度為70 85%、溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2000 3000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，轉(zhuǎn)接到固體MS培養(yǎng)基中，在相對(duì)濕度為70 85%、溫度22士2°C、光照強(qiáng)度2000 3000勒克斯、每天光照12 小時(shí)的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3周；按本步驟的誘導(dǎo)操作條件連續(xù)轉(zhuǎn)接10 15次，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基為固體MS培養(yǎng)基，得體細(xì)胞胚；(4)體細(xì)胞胚的同步化增殖將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到液體MS培養(yǎng)基或固體MS培養(yǎng)基中，在溫度22士2°C、光照強(qiáng)度 2000 3000勒克斯、每天光照12小時(shí)的條件下，采用過篩法或饑餓法同步化增殖培養(yǎng)，得霍山石斛體細(xì)胞胚。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生的方法，其特征在于，所述固體透導(dǎo)培養(yǎng)基是在固體MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 100 mg/L的磷酸鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生的方法，其特征在于，所述過篩法按如下步驟操作將液體培養(yǎng)25天的體細(xì)胞胚先通過10目篩，收集透過的體細(xì)胞胚繼續(xù)培養(yǎng)5天后再通過20目篩，收集截留的體細(xì)胞胚；所述饑餓法按如下步驟操作將體細(xì)胞胚在新鮮MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天后，用無菌的10目篩過濾，透過的體細(xì)胞胚再用20目篩過濾，將截留的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到無鐵鹽的MS培養(yǎng)中饑餓培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)入新鮮的MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種霍山石斛體細(xì)胞胚發(fā)生的方法。該方法包括以下操作步驟(1)無菌試管苗的誘導(dǎo)；(2)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)；(3)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)；(4)體細(xì)胞胚的同步化增殖，得到大量霍山石斛體細(xì)胞胚。本發(fā)明通過取無菌試管苗的帶節(jié)的莖段的形態(tài)學(xué)下端為外殖體，并控制誘導(dǎo)培養(yǎng)基的氧化還原電位，而不需要添加外源激素誘導(dǎo)獲得霍山石斛胚性愈傷組織，避免了外源激素通過體細(xì)胞胚富集到完整植株中而危害人體健康。通過控制環(huán)境濕度使胚性愈傷組織發(fā)生為體細(xì)胞胚，達(dá)到球形體細(xì)胞胚一致性90%以上，再生植株存活率85%以上。本發(fā)明操作工藝簡(jiǎn)單，不受時(shí)間、季節(jié)限制，可在室內(nèi)工廠自動(dòng)化生產(chǎn)霍山石斛體細(xì)胞胚及試管苗以供生產(chǎn)栽培的需要。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102246697SQ20111017943
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者朱慧秋 申請(qǐng)人:蕪湖華信生物藥業(yè)股份有限公司