專利名稱：Nf-ya9蛋白及其編碼基因在培育脂肪酸含量提高的植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及ー種NF-YA9蛋白及其編碼基因在培育脂肪酸含量提高的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪酸是生物體內(nèi)主要的能量?jī)?chǔ)存形式，其主要衍生物甘油三脂 (triacylglycerol,TAG)可在動(dòng)物的脂肪組織、植物種子或果實(shí)中大量?jī)?chǔ)藏。其中，植物油作為食用油和ー種重要的可再生能源物質(zhì)而備受關(guān)注。甘油三脂是脂肪酸和甘油化合而成的天然高分子化合物。甘油三脂合成的過(guò)程包括脂肪酸在質(zhì)體中的從頭合成過(guò)程、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的修飾過(guò)程和甘油三脂的組裝過(guò)程。在植物體內(nèi)，脂肪酸的從頭合成(FAQ是在質(zhì)體內(nèi)進(jìn)行的。脂肪酸合成的前體是乙酰CoA(acetyl-CoA)。它首先在乙酰CoA羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase, ACCase)作用下合成丙ニ酰 CoA(malonyl-CoA)，然后脂肪酸合成酶以丙ニ酰CoA為底物進(jìn)行連續(xù)的聚合反應(yīng)，以每次循環(huán)增加兩個(gè)碳的頻率合成?；兼?，最后合成16至18碳的飽和脂肪酸。在質(zhì)體內(nèi)合成的游離脂肪酸被活化后運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)行進(jìn)ー步的修飾(去飽和，脫氫，延長(zhǎng)等)，最后形成甘油脂和膜脂。植物種子中TAG 的生物合成是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行的。TAG合成的前體是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成的過(guò)程共需要三種?；D(zhuǎn)移酶和一種磷酸水解酶，分別是甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)，溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAT)，ニ脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase) (Barron等，Biochim Biophys Acta,60 :329-337)。TAG的極性很低，因此能夠使油脂在脂肪體內(nèi)不斷積累。目前，已發(fā)現(xiàn)的參與植物脂肪酸代謝調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子有WRI1、LECU FUS3和 LEC2 等(Focks 等，1998，Plant Physiology, 18 :91-101 ；Santos Mendoza 等，2005， FEBS Letter,579 :4666-4670 ；Wang 等，2007，Planta，226:773-783 ；Mu 等，2008，Plant Physiology, 148 :1042-1054) 其中，WRIl編碼ー個(gè)AP2/EREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白，它可能是植物體內(nèi)由蔗糖向TAG轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子(Cernac等，2004，Plant Journal, 40 575-585)。LECl屬于能結(jié)合啟動(dòng)子中順式作用元件CCAAT盒的ー類轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控胚胎的發(fā)生與種子成熟，同時(shí)可能對(duì)胚胎形成過(guò)程中胚胎儲(chǔ)存物的積累進(jìn)行調(diào)控(Lotan等， 1998，Cell,1998,93(7) :1195-1205 ；To 等，2006，The Plant Cell,18(7) :1642-1651)。 過(guò)量表達(dá)LECl能大幅度增加轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗中的脂肪酸含量(Mu等，2008，Plant Physiology, 148 :1042-1054)。FUS3和LEC2都是編碼了ー個(gè)B3家族的轉(zhuǎn)錄因子，它們都是胚胎發(fā)育過(guò)程中的重要調(diào)控基因(Reidt等，2000，Plant Journal, 21 :401-408 ;Stone等， 2001,Proc Natl Acad Sci 98:11806-11811)。fus3 和 lec2 突變體的種子中，油脂含量都顯著降低(Wang2007,Planta, 226 :773-783 ；Santos Mendoza等，2008，Plant Journal, 54 :608-620)；過(guò)量表達(dá)FUS3和LEC2，都能使轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的油脂含量増加(Santos Mendoza 等，2005，F(xiàn)EBS Letter, 579 :4666-4670 ；Wang 等，2007，Planta，226 :773-783)。上述研究表明，在植物種子成熟過(guò)程中油脂積累的調(diào)控很大程度上是依賴胚胎發(fā)生過(guò)程中的重要調(diào)控因子來(lái)調(diào)控的。在擬南芥基因組中，編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因占了很大一部分，至少有1500個(gè)，占整個(gè)基因組的5%以上(Riechmann等，2000，Science，290 :2110-2113)。這些轉(zhuǎn)錄因子大多屬于大的基因家族，有的基因家族又包括許多亞族，而且有些轉(zhuǎn)錄因子家族是植物所特有的。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果表明，一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)ー類相關(guān)性狀的很多基因?qū)嵤┱{(diào)節(jié)控制，從而有效改變植物的相關(guān)特性。CCAAT盒是ー個(gè)廣泛存在于基因啟動(dòng)子上的順式作用元件，與CCAAT序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子又稱為nuclear factor Y (NF-Y)或CCAAT binding factor (CBF)。NF-Y是ー個(gè)由三種不同亞基構(gòu)成的異源三聚體復(fù)合物，它特異性地識(shí)別DNA 上的CCAAT序列，并與之結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。NF-Y的三種不同亞基分別屬于3個(gè)亞族NF-YA (又稱為 HAP2 或 CBF-B)，NF-YB (又稱為 HAP3 或 CBF-A)和 NF-YC (又稱為 HAP5 或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心結(jié)構(gòu)域在序列上與組蛋白H2A和H2B有很高的同源性。 NF-YB/NF-YC形成一個(gè)緊密結(jié)合的異源ニ聚體復(fù)合物，NF-YA再結(jié)合在這個(gè)復(fù)合物的表面， 形成異源三聚體復(fù)合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個(gè)目的是提供ー種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，為將NF-YA9蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏校玫睫D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下1)-5)中的任一一種特征1)所述轉(zhuǎn)基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物、所述轉(zhuǎn)基因植物植株的根部或下胚軸均形成胚性細(xì)胞、所述轉(zhuǎn)基因植物植株生長(zhǎng)受到抑制和所述轉(zhuǎn)基因植物的與脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)水平高于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物；3)所述轉(zhuǎn)基因植物植株生長(zhǎng)受到抑制；4)所述轉(zhuǎn)基因植物植株的根部或下胚軸均形成胚性細(xì)胞；5)所述轉(zhuǎn)基因植物的與脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)水平高于所述目的植物；所述NF-YA9蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1。在上述方法中，所述NF-YA9蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2或序列表中的序列3 ；所述脂肪酸為C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3和/或C20:l。在上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物植株生長(zhǎng)受到抑制體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物的株高或子葉大小均小于所述目的植物；所述轉(zhuǎn)基因植物植株的根部或下胚軸均有胚性細(xì)胞體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物植株的根部或下胚軸均大于所述目的植物；所述與脂肪酸合成相關(guān)基因?yàn)镕AB2、FAD2、FAD3或FAEl基因。在上述方法中，上述NF-YA9蛋白的編碼基因通過(guò)重組載體導(dǎo)入目的植物；上述重組載體為如下1)或2)1)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入PERlO的BioI和SpeI位點(diǎn)間得到的載體；2)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入pBA002的BioI和SpeI位點(diǎn)間得到的載體。在上述方法中，上述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。在上述方法中，所述雙子葉植物為擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或煙草；所述單子葉植物為水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、黒麥、高梁或草坪草。在本發(fā)明的實(shí)施例中具體用的是擬南芥。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供ー種重組載體。本發(fā)明提供了ー種重組載體，為如下1)或2)1)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入PERlO的BioI和SpeI位點(diǎn)間得到的載體；2)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入pBA002的BioI和SpeI位點(diǎn)間得到的載體。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了將ー個(gè)調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子NF-YA9 及其編碼基因?qū)霐M南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型中，得到轉(zhuǎn)基因植物， 發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子可用于調(diào)控植物體內(nèi)脂肪酸代謝，實(shí)驗(yàn)證明，NF-YA9轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)，不僅脂肪酸含量得到顯著提高，而且參與脂肪酸合成的酶FAEl和參與脂肪酸修飾的酶FAB2， FAD2以及FAD3的相應(yīng)基因的表達(dá)也都受其調(diào)控。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因?qū)τ谥参镏舅岽x分子機(jī)制的研究，以及通過(guò)生物技術(shù)來(lái)提高植物(特別是油料作物)的脂肪酸含量及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。本發(fā)明在研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了 NF-YA9在植物種子發(fā)育過(guò)程中對(duì)油脂積累的調(diào)控作用。通過(guò)以NF-YA9為靶點(diǎn)基因的遺傳操作可以有效地提高轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的脂肪酸含量。


圖1為NF-YA9的基因結(jié)構(gòu)框架圖其中，黒色方框表示外顯子，灰色方框表示5 ‘和3’非編碼區(qū)，直線表示內(nèi)含子。 ATG和TAA分別表示基因的起始密碼和終止密碼。圖2為pER10-NF-YA9轉(zhuǎn)基因植物萌發(fā)一周后的表型圖3為pBA-NF-YA9轉(zhuǎn)基因植物萌發(fā)10天后的表型圖4為pER10-NF-YA9轉(zhuǎn)基因植物萌發(fā)一周后的蘇丹紅染色圖5為pBA-NF-YA9轉(zhuǎn)基因植物萌發(fā)10天后的蘇丹紅染色圖6為GS-MS檢測(cè)脂肪酸含量圖7為脂肪酸合成相關(guān)基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥的獲得及表型鑒定一、轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥的獲得1、調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子基因NF-YA9的克隆設(shè)計(jì)引物序列如下P1 (上游引物)5，-CCCTCGAGATGGGAATTGAAGACATGCA-3，
5
P2 (下游引物)5，-AACCCGGGTTTAATGGCTAGACGAGCTT-3，用植物總RNA提取試劑盒(購(gòu)自天根生物公司，目錄號(hào)DP432)并參照試劑盒說(shuō)明書提取野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana, Columbia生態(tài)型，購(gòu)自美國(guó)擬南芥生物資源中心，The Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC，產(chǎn)品編號(hào)為 CS28166.以下簡(jiǎn)稱為野生型擬南芥)2周幼苗的總RNA，然后用superscript II Reverse Transcriptase試劑盒(購(gòu)自全式金生物公司，目錄號(hào)ΑΗ301_02)并參照試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成其第一鏈cDNA，再以所合成的cDNA為模板，在引物Pl和P2的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收長(zhǎng)度約912bp的目的片段并對(duì)其進(jìn)行純化，將其與經(jīng)過(guò)同樣酶切得到的pBluescript SK載體片段(可購(gòu)自默克公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為ST212205)連接，再將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli) DH5a感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自全式金生物公司，目錄號(hào)⑶201-03)，篩選陽(yáng)性克隆，將其接種于含50mg/L氨芐青霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12小吋，提質(zhì)粒， 得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，命名為SK-NF-YA9，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的基因具有序列表中的序列2的核苷酸序列，由912個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第 1-912位堿基，其編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2自5’端第507-567位堿基編碼蛋白_蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，自5’端第603-663位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。上述基因?qū)?yīng)的基因組序列具有序列表中序列3的核苷酸序列，由2195個(gè)堿基組成，自5'端第114-116位堿基為該基因組基因的第一個(gè)外顯子，自5'端第117-440位堿基為該基因組基因的第一個(gè)內(nèi)含子，自5'端第441-705位堿基為該基因組基因的第二個(gè)外顯子，自5'端第706-784位堿基為該基因組基因的第二個(gè)內(nèi)含子，自5'端第785-873 位堿基為該基因組基因的第三個(gè)外顯子，自5'端第874-975位堿基為該基因組基因的第三個(gè)內(nèi)含子，自5'端第976-1050位堿基為該基因組基因的第四個(gè)外顯子，自5'端第 1051-1402位堿基為該基因組基因的第四個(gè)內(nèi)含子，自5'端第1403-1567位堿基為該基因組基因的第五個(gè)外顯子，自5'端第1568-1673位堿基為該基因組基因的第五個(gè)內(nèi)含子，自 5'端第1674-1988位堿基為該基因組基因的第六個(gè)外顯子自5'端第1_113位堿基為該基因組基因的5’非編碼區(qū)(UTR)，自5'端第1989-2195位堿基為該基因組基因的3’非編碼區(qū)。該基因的框架結(jié)構(gòu)見圖1，將該基因命名為Nuclear Factor YA9 (簡(jiǎn)稱NF-YA9)，將其編碼蛋白命名為Nuclear Factor YA9 (簡(jiǎn)稱NF-YA9)。2、含NF-YA9的植物誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶)(ho I和Spe I對(duì)上述1構(gòu)建的含有NF-YA9的質(zhì)粒SK_NF_YA9 進(jìn)行雙酶切，對(duì)雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收長(zhǎng)度約912bp的NF-YA9基因片段并對(duì)其進(jìn)行純化，然后連接到與經(jīng)相同酶雙酶切的載體PER10連接，得到連接產(chǎn)物。PER10是ー個(gè)有雌ニ醇誘導(dǎo)的植物表達(dá)載體，記載在Applications οι Cnemicai — Inducible Expression systems in Functional Lrenomics ana Biotechnology,Nam-Hai Chua,Methods in Molecular Biology，323(III)，329—342，2006， 公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，將其接種于含50mg/L潮霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)16小吋，提質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Bio I和Spe I進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果經(jīng)酶切獲得了 912bp DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，再用引物Pl和P2做進(jìn)ー步的PCR鑒定，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了 912bp的DNA片段，也與預(yù)期結(jié)果一致，再將該質(zhì)粒送去測(cè)序，結(jié)果為將序列表中的序列2插入PERlO的)(ho I和Spe I酶切位點(diǎn)間得到的載體，表明得到了插入序列及位置正確的含有的植物表達(dá)載體，命名為PER10-NF-YA9。3、轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥的獲得將步驟2構(gòu)建的植物表達(dá)載體PER10-NF-YA9用電激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自BI0VECT0R CO.，LTD，產(chǎn)品貨號(hào)BI0VECT0R_375)，將其涂布于含50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的LB抗性平板上在觀で、150rpm下培養(yǎng)16小吋，挑取長(zhǎng)出的農(nóng)桿菌單菌落經(jīng)過(guò)用引物Pl和P2的PCR鑒定，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了 912bp的DNA片段，說(shuō)明為陽(yáng)性重組農(nóng)桿菌，命名為GV3101/PER10-NF-YA9。再將GV3101/PER10-NF-YA9接種于含50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的20mLLB 液體培養(yǎng)基中在^°C、150rpm下振蕩培養(yǎng)2天，然后，再按2%的接種量菌將菌液接種于含 50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的300mL LB液體培養(yǎng)基中在28°C、150rpm下振蕩培養(yǎng) 18小吋。培養(yǎng)結(jié)束后，5000rpm離心20分鐘收集菌體，再將菌體溶于250mL含有5%蔗糖的侵染液中，慢慢搖勻。最后，將菌液轉(zhuǎn)于250mL燒杯中，將已去掉花和果莢的野生型擬南芥倒置于燒杯中5分鐘，得到TO代轉(zhuǎn)NF-YA9植物。將上述陽(yáng)性TO代轉(zhuǎn)NF-YA9植物進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，收獲種子，所得種子經(jīng)50mg/L卡那霉素篩選后得到20株Tl代轉(zhuǎn)NF-YA9植物。經(jīng)過(guò)自交，得到大約500株T2代轉(zhuǎn)NF-YA9 植物。ニ、轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥的表型鑒定1、轉(zhuǎn) PER10-NF-YA9 植物的鑒定將步驟一獲得的編號(hào)為#1和#2的T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥(PER10-NF-YA9)的T2 代種子播在含ΙΟμΜ雌激素(17-β-Estradiol，Sigma，產(chǎn)品貨號(hào)E8875)的MS培養(yǎng)基上 (1/2MS，1%蔗糖，0.8%瓊脂)培養(yǎng)10天的幼苗提取全苗的RNA，以野生型擬南芥作為對(duì)照。 反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，用 Pl (上游引物):5，-CCCTCGAGATGCAATCAAAACCGGGAAG-3，P2 (下游引物)5，-AACCCGGGTGGTGCACCAGAAGAATTCA-3，進(jìn)行 RT-PCR，檢測(cè)了 NF-YA9 基因在 T2 代轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平，以野生型擬南芥為對(duì)照，以Actin7為內(nèi)參，內(nèi)參的引物為ACTIN7F 5 ‘-GGAACTGGAATGGTGAAGGCTG-3，和 ACTIN7B :5 ‘-CGATTGGATACTTCAGAGTGAGGA-3，。結(jié)果如圖2A所示，為RT-PCR技術(shù)檢測(cè)NF-YA9基因的表達(dá)水平，從圖中看出，與野生型擬南芥相比，編號(hào)為#1和#2的T2代轉(zhuǎn)PER10-NF-YA9擬南芥中NF-YA9基因的表達(dá)水平均具有不同程度地升高，說(shuō)明編號(hào)為#1和#2的T2代轉(zhuǎn)PER10-NF-YA9擬南芥為陽(yáng)性的過(guò)表達(dá)擬南芥。2.轉(zhuǎn)PER10-NF-YA9植物的表型分析將上述鑒定為陽(yáng)性的編號(hào)為#1和#2的T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥(PER10-NF-YA9) 的種子播在含ΙΟμΜ雌激素(17-β-Estradiol，Sigma，產(chǎn)品貨號(hào)E8875)的MS培養(yǎng)基上 (1/2MS，1 %蔗糖，0. 8 %瓊脂)(其中，MS鹽、瓊脂和蔗糖購(gòu)自北京西美杰科技有限公司，產(chǎn)品貨號(hào)M531、A7848和S391，)置于溫室中在22°C、光照強(qiáng)度80-120 μ E-2S-1條件下培養(yǎng) 16小吋，以野生型擬南芥作為對(duì)照。
10天后，觀察T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥和野生型植株的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖2B所示， 可以看出，T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10天時(shí)有明顯的生長(zhǎng)抑制表型，具體表現(xiàn)為NF-YA9過(guò)表達(dá)植株矮小、子葉變小或不能正常發(fā)育、頂端分生組織的發(fā)育完全受阻，根的生長(zhǎng)發(fā)育異常。同吋，在T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥的下胚軸和根部形成明顯的胚性組織，主要表現(xiàn)為根部和下胚軸顏色變綠，明顯膨大變粗。三、NF-YA9組成型表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得1、構(gòu)建NF-YA9基因組成型過(guò)量表達(dá)的重組表達(dá)載體將上述一得到的SK-NF-YA9經(jīng)過(guò)BioI和SpeI酶切得到酶切產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)同樣酶切
pBA002 ( idici A GFP-mouse talin fusion protein labels plant actin filaments in vivo and visualizes the actin cytoskeleton in growing pollen tubes, Benedikt Kost, Pius Spielhofer, Nam-Hai Chua, The Plant Journal,16 (3), 393-401，1998，公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到克隆，在含有50毫克/升壯觀酶素的LB平板上37度培養(yǎng)16小吋，最后篩選得到具有抗壯觀酶素抗性的克隆，提取該克隆的質(zhì)粒，送去測(cè)序，結(jié)果為將序列2插入 PBA002的BioI和SpeI酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pBA_NF_YA9。2、轉(zhuǎn)pBA-NF-YA9擬南芥的獲得將上述獲得的pBA-NF-YA9轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 (購(gòu)自Biovector Co.，LTD,產(chǎn)品貨號(hào)Bi0Vect0r-375)，然后用花侵染轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-O (購(gòu)自美國(guó)擬南芥生物資源中心，The Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC，產(chǎn)品編號(hào)為 CS28166,以下簡(jiǎn)稱野生型擬南芥)的花序，通過(guò)除草劑Basta(50mg/L)篩選出12株Tl代轉(zhuǎn)pBA-NF-YA9擬南芥，經(jīng)過(guò)擴(kuò)繁，得到約300株T2代轉(zhuǎn)pBA_NF_YA9擬南芥。3、轉(zhuǎn)pBA-NF-YA9擬南芥的表型分析分別將編號(hào)為#2和#6的T2代轉(zhuǎn)pBA-NF-YA9擬南芥的種子播種后在MS培養(yǎng)基 (1/2MS，1 %蔗糖，0. 8 %瓊脂)(其中，MS鹽、瓊脂和蔗糖購(gòu)自北京西美杰科技有限公司，產(chǎn)品貨號(hào)M531、A7848和S391，)上22度M小時(shí)光照培養(yǎng)7天，觀察植物的生長(zhǎng)發(fā)育表型。結(jié)果表明，用組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)NF-YA9過(guò)量表達(dá)，對(duì)于苗期植物的生長(zhǎng)沒有明顯影響，但在幼苗的下胚軸處有明顯的胚性組織形成，具體表現(xiàn)為下胚軸明顯膨大變粗，顔色更綠(圖 3)。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥的脂肪酸代謝檢測(cè)及其機(jī)制研究一、蘇丹紅染色指示轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥體內(nèi)脂肪酸含量的變化蘇丹紅是ー種能夠與種子特有的中性脂特異結(jié)合的染料，植物材料著色的深淺可以指示植物體內(nèi)中性脂的含量高低。將由實(shí)施例1的一得到T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥 (PER10-NF-YA9)與野生型擬南芥分別浸泡于1 %蘇丹紅(Fat Red 7B) (Sigma，產(chǎn)品貨號(hào) 201161-8)，室溫(25°C )染色6小吋，用去離子水清洗3遍，每遍30s，染色結(jié)果如圖4所示， 在編號(hào)為#1和#2的T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥的根部和下胚軸處，蘇丹紅著色的程度明顯高于野生型植物，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)形成胚性細(xì)胞，且胚性細(xì)胞中的種子特異的脂肪酸的積累量明顯高于野生型。按照上述方法將由實(shí)施例1的一得到T2代轉(zhuǎn)pBA-NF-YA9擬南芥進(jìn)行蘇丹紅染色，結(jié)果如圖5所示，在T2代轉(zhuǎn)pBA-NF-YA9擬南芥的根部和下胚軸處，蘇丹紅的著色程度明顯高于野生型的下胚軸，說(shuō)明由于NF-YA9基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致種子特異的中性脂肪酸在下胚軸部位積累。ニ、GC-MS方法檢測(cè)轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥經(jīng)誘導(dǎo)后體內(nèi)各種脂肪酸組分的含量變化情況分別取由實(shí)施例1的一得到編號(hào)為1 (#1)和2 (#2)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10 μ M雌激素，17-β -Estradiol，Sigma，產(chǎn)品貨號(hào)E8875，的 MS培養(yǎng)基上(配方為1/2MS，1 %蔗糖，0. 8 %瓊脂))中萌發(fā)后生長(zhǎng)10天，各取0. 1克植物整株幼苗，在液氮中研磨成干粉，然后轉(zhuǎn)移到帶密封蓋的試管中，加入3mL甲醇(含2. 5% (V/V)濃硫酸)，在80°C水浴加熱90分鐘，再加入4. 5mL 0.9% NaCl水溶液和ImL正己烷， 混勻，4000rpm離心10分鐘，收集正己烷相。真空抽干，用IOOul乙酸乙酯溶解，取Iul上樣，用PerkinElmer公司的TurboMass GC/MS儀分析各種脂肪酸組分的含量變化情況，所用 GC柱為30mX0. 25mmBPX-70柱，GC升溫程序?yàn)槌跏紲囟?20°C，保持1分鐘，再以每分鐘 IO0C的速率升至150°C，然后以每分鐘4°C的速率升溫至230°C，保持10分鐘，以C17 0的三酯酰甘油(Sigma，貨號(hào)201161-8)作內(nèi)標(biāo)。根據(jù)樣品質(zhì)譜出現(xiàn)的時(shí)間和分子量可以確定組分，根據(jù)質(zhì)譜峰圖的面積與內(nèi)標(biāo)的面積相比，可以計(jì)算含量。脂肪酸含量的計(jì)算公式是樣品含量=(樣品峰圖面積/內(nèi)標(biāo)峰圖面積)χ內(nèi)標(biāo)含量/樣品重量。結(jié)果如圖6所示，編號(hào)為1 (#1)、2(#2)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥的 C16:0 的含量分別為 0. 56 μ g/mg、l. 13 μ g/mg、0. 80 μ g/mg ；編號(hào)為1 (#1)、2 (#2)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥的C18:0的含量分別為 0. 14 μ g/mg、0. 50 μ g/mg、0· 20 μ g/mg ；編號(hào)為1 (#1)、2(#2)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥的C18:1的含量分別為 0. 12 μ g/mg、1. 21 μ g/mg、0. 54 μ g/mg ；編號(hào)為1(#1)、2(#2)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥的C18:2的含量分別為 0. 55 μ g/mg,2. 12 μ g/mg、1· 27 μ g/mg ；編號(hào)為1(#1)、2(#2)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥的C18:3的含量分別為 1. 0 μ g/mg,2. 48 μ g/mg、1· 24 μ g/mg ；編號(hào)為1 (#1)、2 (#2)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥和野生型擬南芥的C20:1的含量分別為 0 μ g/mg、1. 90 μ g/mg、0· 32 μ g/mg。從上述可以看出，與野生型擬南芥相比，編號(hào)為1(#1)和2(#2)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA9 擬南芥經(jīng)誘導(dǎo)后脂肪酸的各個(gè)組分含量都明顯上升，其中，C16:0分別升高了 100. 4%和 42% ；C18:0 分別升高了 266. 8%和 43. 2% ；C18:l 分別升高了 913. 3%和 353. 4% ；C18:2 分別升高了 286. 5%和131. 5%;C18:3分別升高了 148. 7%和24. 5% 0尤其值得注意的是， 種子油脂中特有的C20:l在10天的野生型幼苗中是檢測(cè)不到的，但在轉(zhuǎn)基因植物中，該組分的含量分別達(dá)到了 1.90 μ g/mg和0. 32 μ g/mg。上述結(jié)果表明，NF-YA9是脂肪酸合成的正向調(diào)控因子，過(guò)量表達(dá)該基因可以顯著提高植物體內(nèi)的脂肪酸含量。三、NF-YA9調(diào)控脂肪酸合成的分子機(jī)制研究分別由實(shí)施例1的一得到的編號(hào)為#1 T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥(PER10-NF-YA9)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中萌發(fā)后生長(zhǎng)10天的提取全苗的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，分別用如下引物進(jìn)行擴(kuò)增，以野生型擬南芥(Col-O)為對(duì)照。FAD2Fl (5‘-ATGGGTGCAGGTGGAAGAAT--3，
FAD2Bl (5‘-CCAGGAGAAGTAAGGGACGA--3，
FAD3Fl (5‘-CATAAGCGGCGTGCATTTTG--3，
FAD3Bl (5‘-ACGAAAGCAGCTAAACATGT--3，
FAB2Fl (5‘-CGCTGTGCATAAGCATTCTC--3，
FAB2Bl (5‘-TTGGGGCCGGAGCTGAGAGC--3，
FAElFl (5‘-CGTTAAGCTCCTTTACCGTT--3，
FAElBl (5‘-TCTGTCTCTTCACGTGACGC--3，
UBQ5Fl (5‘-CTTCAGCAGCCGTTGCCTCA--3，
UBQ5Bl (5‘-CTGGTAAACGTAGGTGAGTCC-3‘
進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)了與脂肪酸合成相關(guān)基
表達(dá)水平，以UBQ5為內(nèi)參。 結(jié)果如圖7所示，從圖中看出，與野生型擬南芥相比，在編號(hào)為#1 T2代轉(zhuǎn)NF-YA9擬南芥(PER10-NF-YA9)中與脂肪酸合成相關(guān)基因，包括FAB2 (At2g43710)，F(xiàn)AD2(At3gl2120), FAD3 (At2g29980)和 FAEl (At4g34520)的表達(dá)水平均有明顯地升高，說(shuō)明NF-YA9調(diào)控脂肪酸的合成與積累是通過(guò)誘導(dǎo)脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
權(quán)利要求
1.ー種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將NF-YA9蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下1)-5)中的任一一種特征1)所述轉(zhuǎn)基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物、所述轉(zhuǎn)基因植物植株的根部或下胚軸均形成胚性細(xì)胞、所述轉(zhuǎn)基因植物植株生長(zhǎng)受到抑制和所述轉(zhuǎn)基因植物的與脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)水平高于所述目的植物；2)所述轉(zhuǎn)基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物；3)所述轉(zhuǎn)基因植物植株生長(zhǎng)受到抑制；4)所述轉(zhuǎn)基因植物植株的根部或下胚軸均形成胚性細(xì)胞；5)所述轉(zhuǎn)基因植物的與脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)水平高于所述目的植物； 所述NF-YA9蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述NF-YA9蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2或序列表中的序列3 ； 所述脂肪酸為 C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3和/或C20:l。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物植株生長(zhǎng)受到抑制體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物的株高或子葉大小均小于所述目的植物；所述轉(zhuǎn)基因植物植株的根部或下胚軸均有胚性細(xì)胞體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物植株的根部或下胚軸均大于所述目的植物；所述與脂肪酸合成相關(guān)基因?yàn)镕AB2，F(xiàn)AD2，F(xiàn)AD3和FAEl基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 所述NF-YA9蛋白的編碼基因通過(guò)重組載體導(dǎo)入目的植物； 所述重組載體為如下1)或2):1)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入PERlO中得到的載體；2)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入PBA002中得到的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或煙草；所述單子葉植物為水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、黒麥、高梁或草坪草。
7.—種重組載體，所述重組載體為如下1)或2)1)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入PERlO中得到的載體；2)將所述NF-YA9蛋白的編碼基因插入PBA002中得到的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種NF-YA9蛋白及其編碼基因在培育脂肪酸含量提高的植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將NF-YA9蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物具有如下等特征1)所述轉(zhuǎn)基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了將一個(gè)調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子NF-YA9及其編碼基因?qū)霐M南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型中，得到轉(zhuǎn)基因植物，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子可用于調(diào)控植物體內(nèi)脂肪酸代謝。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102558324SQ201210005549
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者左建儒, 牟金葉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所