專利名稱：冷休克誘導(dǎo)天然四倍體泥鰍雄核發(fā)育的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多倍體魚類雄核發(fā)育的方法，尤其是一種無需卵子失活及不經(jīng)染色體加倍處理，可快速、高效生產(chǎn)雄核發(fā)育二倍體泥鰍且孵化率高的冷休克誘導(dǎo)天然四倍體泥鰍雄核發(fā)育的方法。
背景技術(shù)：
雄核發(fā)育(Androgenesis)是指用精子生產(chǎn)只帶父系遺傳物質(zhì)個體的繁殖方式。由于雄核發(fā)育的遺傳物質(zhì)完全來自父方，沒有雌性原核的參與，可用于純系的建立，同時可冷藏瀕危物種的精子，對物種的保護(hù)具有特殊的意義。另外，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上，由于很多重要經(jīng)濟(jì)魚類不同性別往往表現(xiàn)出不同的生產(chǎn)性能，如體型和體色的差異，生長速度的快慢，性成熟時間的不同等。所以，通過雄核發(fā)育控制魚類的性別，選擇具有最佳生長性能的雄性進(jìn)行單性養(yǎng)殖，具有極為重要的應(yīng)用價值。 目前，人工誘導(dǎo)魚類雄核發(fā)育的方法有兩種一種是用正常精子使經(jīng)過遺傳失活的卵受精，得到雄核發(fā)育單倍體胚胎(η)，然后通過抑制第I次卵裂的發(fā)生誘導(dǎo)核內(nèi)有絲分裂，由此使單倍體胚胎的染色體加倍發(fā)育成為純合二倍體個體。另一種方法是用四倍體個體的精子(2η)使遺傳失活的卵子“受精”，可以直接得到正常發(fā)育的二倍體雄核發(fā)育后代。即按照上述兩種方法獲得魚類雄核發(fā)育后代，必需解決卵子染色體遺傳失活或染色體加倍的問題?，F(xiàn)有使卵子染色體遺傳失活最常用的方法有電離輻射或紫外線(UV)照射等，應(yīng)用輻射的方法對卵子的遺傳物質(zhì)進(jìn)行滅活雖然簡便易行，但是射線在破壞卵子細(xì)胞核的同時，對細(xì)胞質(zhì)和其它細(xì)胞器也造成不同程度的破壞，此卵子受精后，單倍體雖能較好地通過胚胎發(fā)育，但到孵化期或孵化后數(shù)天，就會因“單倍體綜合癥”而陸續(xù)死亡?，F(xiàn)有染色體加倍的主要方法為利用溫度、壓力刺激或化學(xué)誘變劑阻止第一次卵裂，但是，所獲得二倍體的存活率極低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種無需卵子失活及不經(jīng)染色體加倍處理，可快速、高效生產(chǎn)雄核發(fā)育二倍體泥鰍且孵化率高的冷休克誘導(dǎo)天然四倍體泥鰍雄核發(fā)育的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種冷休克誘導(dǎo)天然四倍體泥鰍雄核發(fā)育的方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行
a.取天然雄性四倍體泥鰍及雌性二倍體泥鰍進(jìn)行催產(chǎn)，分別取雄性四倍體泥鰍的精液及雌性二倍體泥鰍的卵子，所得精液用Kurokura’ s solution溶液100倍稀釋待用；
b.將稀釋后的精液與卵子混合形成受精卵，將受精卵置于3°C冰水中，浸泡60min，然后置于常溫水中進(jìn)行孵化。本發(fā)明是取雄性四倍體泥鰍的精液及雌性二倍體泥鰍的卵子形成受精卵，用冷休克處理(3°C冰水，浸泡60min)，受精卵即可快速、高效生產(chǎn)雄核發(fā)育二倍體泥鰍，無需卵子遺傳失活及染色體加倍處理，避免了繁瑣的操作程序，廉價、易操作，縮短了獲得純系泥鰍育種時間，解決了現(xiàn)有理化誘導(dǎo)對受精卵造成傷害的問題，提高了雄核發(fā)育二倍體泥鰍孵化率和成活率，有利于大規(guī)模生產(chǎn)使用。


圖I是本發(fā)明實施例所制備的雄核發(fā)育二倍體泥鰍染色體(2n=50)的圖片。圖2是對照組(2n早X 4n ￠)泥鰍染色體(3n=75)的圖片。
具體實施例方式實施例依次按如下步驟進(jìn)行
a.取發(fā)育良好的天然雄性四倍體泥鰍(4n=100)及雌性二倍體泥鰍(2n=50)，用現(xiàn)有技術(shù)的催產(chǎn)方法進(jìn)行催產(chǎn)，水溫24± I °C,效應(yīng)時間1(Γ 2小時后，確認(rèn)排卵后，輕壓腹部采集雌性二倍體泥鰍的卵子，并用毛細(xì)管采集雄性四倍體泥鰍的精液，所得精液用Kurokura’ s solution溶液100倍稀釋待用；Kurokura’ s solution溶液的配制方法是現(xiàn)有技術(shù)，即 NaCl 750 mg, CaCl2 20 mg, NaHCO3 20 mg, KCl 20 mg 溶于 100 ml 蒸餾水中；
b.按現(xiàn)有技術(shù)的方法將稀釋后的精液與卵子混合形成受精卵，與現(xiàn)有技術(shù)所不同的是將受精卵置于3°C冰水中，浸泡60min，然后置于常溫水中進(jìn)行孵化。孵化時按照現(xiàn)有技術(shù)的孵化方法經(jīng)常更換曝氣的水，保持室內(nèi)空氣新鮮和流通，及時用吸管吸出死卵,孵化出的魚苗放入水槽中飼養(yǎng)。實驗
I.倍性檢測
通過早期混合胚胎制片法對本發(fā)明實施例及對照組的泥鰍體細(xì)胞染色體數(shù)目進(jìn)行檢測，對照組與本發(fā)明實施例的區(qū)別是受精卵未經(jīng)冷休克處理。早期混合胚胎制片法為取本發(fā)明實施例及對照組發(fā)育眼胞期的胚胎3(Γ50個，用鑷子剖去卵膜和卵黃后放入盛有0. 0025%的秋水仙素中處理45min，0. 8%的檸檬酸低滲20min,再用預(yù)冷的卡諾固定液(甲醇冰醋酸=3 :1)固定3次，每次15 201^11，最后_20°C冷凍過夜。冷滴片，10%吉姆薩染色，鏡檢，拍照。本發(fā)明實施例照片如圖I所示結(jié)果表明雄核發(fā)育泥鰍染色體為二倍體(2n=50)。對照組照片如圖2所示結(jié)果表明染色體為三倍體(3n=75)。
權(quán)利要求
1.一種冷休克誘導(dǎo)天然四倍體泥鰍雄核發(fā)育的方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行 a.取天然雄性四倍體泥鰍及雌性二倍體泥鰍進(jìn)行催產(chǎn)，分別取雄性四倍體泥鰍的精液及雌性二倍體泥鰍的卵子，所得精液用Kurokura’ s solution溶液100倍稀釋待用； b.將稀釋后的精液與卵子混合形成受精卵，將受精卵置于3°C冰水中，浸泡60min，然后置于常溫水中進(jìn)行孵化。
全文摘要
本發(fā)明公開一種無需卵子失活及不經(jīng)染色體加倍處理，可快速、高效生產(chǎn)雄核發(fā)育二倍體泥鰍且孵化率高的冷休克誘導(dǎo)天然四倍體泥鰍雄核發(fā)育的方法，依次按如下步驟進(jìn)行取天然雄性四倍體泥鰍及雌性二倍體泥鰍進(jìn)行催產(chǎn)，分別取雄性四倍體泥鰍的精液及雌性二倍體泥鰍的卵子，所得精液用Kurokura’ssolution溶液100倍稀釋待用；將稀釋后的精液與卵子混合形成受精卵，將受精卵置于3℃冰水中，浸泡60min，然后置于常溫水中進(jìn)行孵化。
文檔編號A01K61/00GK102835338SQ20121034526
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者李雅娟, 姜志強(qiáng), 王玉生, 高養(yǎng)春, 劉博 申請人:大連海洋大學(xué), 李雅娟