專利名稱：一種美人蕉莖尖組織培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)、植物莖尖培養(yǎng)技術(shù)，主要是一種美人蕉莖尖組織培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
美人蕉(Canna indica)，別名蘭蕉、曇華，為美人蕉科、美人蕉屬植物，多年生球根草本花丼，原產(chǎn)于美洲熱帶和非洲等地。美人蕉株高可達(dá)100 180cm,叢生,葉片大、葉片顏色豐富，花大，花色艷麗、顏色多樣，花期長(zhǎng)，是一種非常優(yōu)良的園林綠化、景觀美化植物。美人蕉葉片可吸收二氧化硫、氯化氫等有害物質(zhì)，葉片雖易受害，但可重新長(zhǎng)出新葉，很快恢復(fù)生長(zhǎng)，也因此可作為監(jiān)視有害氣體污染指示植物，具有凈化空氣、保護(hù)環(huán)境作用。另外，美人蕉還可以用作藥物治療瘡瘍腫毒、子宮出血、白帶、急性黃膽等疾病?，F(xiàn)在已有一些城市將美人蕉作為主要綠化植物進(jìn)行種植，但是由于傳統(tǒng)繁殖方式種苗生產(chǎn)速度慢，嚴(yán)重限制了美人蕉大規(guī)模的應(yīng)用。目前，美人蕉的繁殖主要通過(guò)種子及塊莖分株繁殖方式進(jìn)行。但是目前市場(chǎng)需求大的品種基本上結(jié)實(shí)率很低、甚至不結(jié)實(shí)，種子數(shù)量有限，而通過(guò)塊莖分株方式繁殖受到材料本身狀態(tài)、生產(chǎn)季節(jié)及土地的限制，每年產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)的需求。同時(shí)，由于美人蕉長(zhǎng)期繁殖材料長(zhǎng)期處地下，容易 受到各種病毒的感染，由于美人蕉多采用無(wú)性繁殖，一旦感染便很難通過(guò)化學(xué)藥物根除。已有研究表明，美人蕉主要感染病毒包括美人蕉黃斑駁病毒、黃瓜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒、西紅柿不育病毒及美人蕉黃色條紋病毒，嚴(yán)重降低了美人蕉的觀賞價(jià)值。植物莖尖培養(yǎng)被認(rèn)為是目前最有效的植物脫毒材料獲得手段，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于美人蕉不同品種快速繁殖報(bào)道極少，且增值效率低，最高僅為1.67，至于美人蕉莖尖培養(yǎng)研究，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種美人蕉莖尖組織培養(yǎng)的方法，解決美人蕉通過(guò)莖尖培養(yǎng)建立良好的美人蕉組培再生體系，為美人蕉脫毒培養(yǎng)、新品種培養(yǎng)及遺傳改良等做好技術(shù)支持。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)完成的。這種美人蕉莖尖組織培養(yǎng)的方法，該方法包括以下幾個(gè)步驟:I)、外植體的選取及處理:選取美人蕉地下帶有芽的根莖，將根莖表面根切除、附著物洗凈，然后將帶芽的根莖帶基部切成約Icm見(jiàn)方，基部厚度約0.5cm大小，作為組培用外植體。2)、莖尖剝離:無(wú)菌環(huán)境下，將經(jīng)過(guò)消毒的外植體在解剖鏡下，先用低倍鏡一層一層剝離芽鱗，然后逐步增大放大倍數(shù)，繼續(xù)剝離芽鱗，最后在40 45倍鏡下切下0.2
0.5mm長(zhǎng)的莖尖部分，最后切取莖尖的刀必須無(wú)菌且沒(méi)有切過(guò)任何植物材料。
3)、美人蕉莖尖培養(yǎng):將切取的莖尖材料接種在莖尖培養(yǎng)用培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+ 脯氨酸 50 200mg/L 中，培養(yǎng)條件為:24 + 2V,暗培養(yǎng)7 10d，然后將材料轉(zhuǎn)移至25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d，光照強(qiáng)度為45 60 μ.mol.m 2.s、4)、不定芽誘導(dǎo)及增殖:莖尖培養(yǎng)獲得的不定芽利用無(wú)菌的解剖刀將芽基部輕輕造成一些傷口，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)及增殖，不定芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為 45 60 μ.mol.m 2.s 1O5)、不定芽生根誘導(dǎo):從基部將高生長(zhǎng)到3 5cm的叢生不定芽分開(kāi)成單個(gè)不定芽，接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)，生根培養(yǎng)基為MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0 0.5mg/L,培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d，光照強(qiáng)度為45 60 μ.mo I^m2-S10 6)、組培苗馴化及移栽:不定芽基部長(zhǎng)出2 3條I 2cm的不定根后，將組培移至溫室，散射光培養(yǎng)5d后打開(kāi)瓶蓋，再培養(yǎng)I 2d，完成組培苗移栽前馴化，然后將組培苗從培養(yǎng)瓶取出，洗凈組培苗表面瓊脂，栽入基質(zhì)中，保濕90 %以上培養(yǎng)15d，然后在溫室中正常培養(yǎng)。莖尖培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)及增殖、不定芽生根誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為25 30g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8 9g/L，培養(yǎng)基pH分裝前調(diào)整為5.7 5.8 ;莖尖培養(yǎng)用培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+脯氨酸50 200mg/L ;不定芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L ;生根培養(yǎng)基為MS+IBA0 0.5mg/L 或 1/2MS+IBA0 0.5mg/L ;莖尖培養(yǎng)環(huán)境為:24±2°C，暗培養(yǎng) 7 10d，然后將材料轉(zhuǎn)移至25±2°C,光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ *mol.πΓ2 s—1 ；不定芽誘導(dǎo)及增殖、不定芽生根培養(yǎng)條件為，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d，光照強(qiáng)度為45 60 μ.mol.m 2.s、起始外植體的選擇及處理，莖尖剝離、莖尖培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)中CaCl2的應(yīng)用、移栽前馴化過(guò)程及移栽后保濕90%以上培養(yǎng)15d。本發(fā)明有益的效果是:1、通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行美人蕉種苗快繁，生產(chǎn)可以不受地區(qū)、季節(jié)及氣候限制，便于工廠化育苗，可根據(jù)訂單進(jìn)行生產(chǎn)，生產(chǎn)時(shí)間及規(guī)模可控，為美人蕉的推廣應(yīng)用提供充足的優(yōu)質(zhì)種苗保障。2、利用莖尖培養(yǎng)技術(shù)，可有效獲得無(wú)對(duì)美人蕉生長(zhǎng)有嚴(yán)重影響病毒的脫毒植株，提高美人蕉的觀賞價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。3、繁殖系數(shù)達(dá)到不低于2.5，達(dá)到花卉種苗工廠化育苗生產(chǎn)的要求，目前已有關(guān)于美人蕉組織培養(yǎng)的文獻(xiàn)中，尚未見(jiàn)美人蕉增殖系數(shù)達(dá)到2的報(bào)道。4、美人蕉不定芽誘導(dǎo)采用直接器官發(fā)生，無(wú)愈組織傷誘導(dǎo)及愈傷分化誘導(dǎo)環(huán)節(jié)，減少植物組培過(guò)程中后代變異的發(fā)生，后代種苗遺傳背景一致，最大限度保持母本的優(yōu)良性狀。5、有利于結(jié)實(shí)率低、甚至不結(jié)實(shí)的優(yōu)良美人蕉品種的推廣。6、建立良好的組培快繁體系，為今后利用植物生物技術(shù)對(duì)美人蕉進(jìn)行新品種培育、遺傳改良等研究工作奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，實(shí)施例將幫助更好地理解本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅僅局限于下述實(shí)施例。本發(fā)明所述的這種美人蕉莖尖組織培養(yǎng)的方法，該方法包括以下幾個(gè)步驟:1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件:莖尖培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)及增殖、不定芽生根誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為25 3·0g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8 9g/L，培養(yǎng)基pH分裝前調(diào)整為5.7 5.8 ;莖尖培養(yǎng)用培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+脯氨酸50 200mg/L ;不定芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L ;生根培養(yǎng)基為MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0 0.5mg/L ;莖尖培養(yǎng)環(huán)境為:24±2°〇，暗培養(yǎng)7 10(1，然后將材料轉(zhuǎn)移至25±21:，光照時(shí)間為12 14h/d，光照強(qiáng)度為45 60μ.mol.πΓ2.s_1 ;不定芽誘導(dǎo)及增殖、不定芽生根培養(yǎng)條件為，培養(yǎng)溫度25±2°C,光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ.mol.m_2.s'2、外植體的處理與消毒:選取美人蕉地下帶有芽的根莖，將根莖表面根切除、附著物洗凈，然后將帶芽的根莖帶基部切成約Icm見(jiàn)方，基部厚度約0.5cm大小，處理好的外植體用洗潔精溶液清洗20min，期間不斷輕輕攪拌，然后流水沖洗經(jīng)洗潔精清洗的外植體材料20 30min，在已經(jīng)過(guò)消毒的超凈工作臺(tái)上將流水清洗過(guò)的外植體轉(zhuǎn)移至無(wú)菌錐形瓶中，用75%酒精浸泡60s，期間不斷輕輕晃動(dòng)錐形瓶，再用0.l%HgCl2溶液浸泡8 lOmin，或用有效氯濃度為l%NaC10溶液浸泡10 15min,浸泡期間不斷輕輕晃動(dòng)錐形瓶,然后用無(wú)菌水清洗經(jīng)過(guò)消毒處理的外植體4 5次，用無(wú)菌水浸泡、備用。3、美人蕉莖尖剝離:消過(guò)毒的超凈工作臺(tái)上，將經(jīng)過(guò)消毒的外植體取出放在有無(wú)菌濾紙的接種盤(pán)中，在解剖鏡下，先用低倍鏡一層一層剝離芽鱗，逐步增大放大倍數(shù)，最后在40倍鏡下切下0.2 0.5mm長(zhǎng)的莖尖部分，最后切取莖尖的刀必須沒(méi)有切過(guò)任何植物材料，將剝離莖尖培養(yǎng)到培養(yǎng)基后再?gòu)腻F形瓶中挑取下一個(gè)外植體。4、美人蕉莖尖培養(yǎng):將切取的莖尖材料接種在莖尖培養(yǎng)用培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+ 脯氨酸 50 200mg/L 中，培養(yǎng)條件為:24 + 2V,暗培養(yǎng)7 10d，然后將材料轉(zhuǎn)移至25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d，光照強(qiáng)度為45 60 μ.mol.πΓ2.s_1,至莖尖長(zhǎng)至I 2cm后進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)及增殖。5、不定芽誘導(dǎo)及增殖:莖尖培養(yǎng)獲得的不定芽利用無(wú)菌的解剖刀將芽基部輕輕造成一些傷口，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)及增殖，不定芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為 45 60 μ.mol.m 2.s 1O6、不定芽生根誘導(dǎo):從基部將高生長(zhǎng)到3 5cm的叢生不定芽分開(kāi)成單個(gè)不定芽，接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)，生根培養(yǎng)基為MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0
0.5mg/L,培養(yǎng)溫度25±2°C,光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ.mol.πΓ2.s'7、組培苗馴化及移栽:不定芽基部長(zhǎng)出2 3條I 2cm的不定根后，將組培移至溫室，散射光培養(yǎng)5d后打開(kāi)瓶蓋，再培養(yǎng)I 2d，完成組培苗移栽前馴化，然后將組培苗從培養(yǎng)瓶取出，洗凈組培苗表面瓊脂，栽入基質(zhì)中，保濕90%以上培養(yǎng)15d，然后在溫室中正常培養(yǎng)，成活率100%。最后，應(yīng)當(dāng)指出，以上實(shí)例僅是本發(fā)明較有代表性的例子。顯然，本發(fā)明的技術(shù)方案并不限于上述實(shí)例，還可以有許多變形，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種美人蕉莖尖組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:該方法包括以下幾個(gè)步驟: 1)、外植體的選取及處理:選取美人蕉地下帶有芽的根莖，將根莖表面根切除、附著物洗凈，然后將帶芽的根莖帶基部切成Icm見(jiàn)方，基部厚度0.5cm大小，作為組培用外植體； 2)、莖尖剝離:無(wú)菌環(huán)境下，將經(jīng)過(guò)消毒的外植體在解剖鏡下，先用低倍鏡一層一層剝離芽鱗，然后逐步增大放大倍數(shù)，繼續(xù)剝離芽鱗，最后在40 45倍鏡下切下0.2 0.5mm長(zhǎng)的莖尖部分，最后切取莖尖的刀必須無(wú)菌且沒(méi)有切過(guò)任何植物材料； 3)、美人蕉莖尖培養(yǎng):將切取的莖尖材料接種在莖尖培養(yǎng)用培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1 0.5mg/L+NAA0.05 0.2mg/L+ 脯氨酸 50 200mg/L 中，培養(yǎng)條件為:24±2 °C，暗培養(yǎng)7 10d，然后將材料轉(zhuǎn)移至25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d，光照強(qiáng)度為45 60 μ.mol.m 2.s 1 ； 4)、不定芽誘導(dǎo)及增殖:莖尖培養(yǎng)獲得的不定芽利用無(wú)菌的解剖刀將芽基部造成傷口，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)及增殖，不定芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 6.0mg/L+CaCl250 800mg/L,培養(yǎng)溫度 25±2°C，光照時(shí)間為 12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ.mol.πΓ2.s_1 ； 5)、不定芽生根誘導(dǎo):從基部將高生長(zhǎng)到3 5cm的叢生不定芽分開(kāi)成單個(gè)不定芽,接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)，生根培養(yǎng)基為MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0 0.5mg/L,培養(yǎng)溫度25±2°C,光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ.mol.πΓ2 *s_1 ； 6)、組培苗馴化及移栽:不定芽基部長(zhǎng)出2 3條I 2cm的不定根后，將組培移至溫室，散射光培養(yǎng)5d后打開(kāi)瓶蓋，再培養(yǎng)I 2d，完成組培苗移栽前馴化，然后將組培苗從培養(yǎng)瓶取出，洗凈組培苗表面瓊脂，栽入基質(zhì)中，保濕90%以上培養(yǎng)15d，然后在溫室中正常培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美人蕉莖尖組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:莖尖培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)及增殖、不定芽生根 誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為25 30g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8 9g/L，培養(yǎng)基pH分裝前調(diào)整為5.7 5.8。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種美人蕉莖尖組織培養(yǎng)的方法，包括如下步驟培養(yǎng)基的配制、外植體的選取與消毒、莖尖剝離、莖尖培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)及增值、不定芽生根誘導(dǎo)、組培苗馴化及移栽?；九囵B(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基，蔗糖25～30g/L，瓊脂粉8～9g/L，培養(yǎng)基pH5.7～5.8；莖尖培養(yǎng)用培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.05～0.2mg/L+L-脯氨酸50～200mg/L；不定芽誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0～6.0mg/L+CaCl250～800mg/L；生根培養(yǎng)基為MS+IBA0～0.5mg/L或1/2MS+IBA0～0.5mg/L。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)建立的美人蕉組培快繁技術(shù)體系種苗繁殖速度快，健壯均勻，移栽成活率高，適合優(yōu)良美人蕉種苗脫毒及規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103141389SQ20131007407
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月8日
發(fā)明者陳志 , 汪一婷, 牟豪杰, 呂永平, 周迪江, 陳劍平 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院